第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用
预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
一、分子用研究技术
目录
第一节 分子杂交与印迹技术
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
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5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
目录
PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
目录
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
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常用分子生物学技术的原理及其应用
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
01
03
基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
01
02
03
04
基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
高中生物竞赛：常用分子生物学技术的原理及应用课件
（一）Southern blotting 1 2 M
内切酶
基因组DNA
重物
纸巾
10×SSC 转 移缓冲液
500g
支持物
9
（一）印迹(blotting)技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
原始文献出处：
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
PCR方法被美国Science杂志评为1989年 的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被 评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
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Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
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"for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies"
Kary B. Mullis
⑥根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建 立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体， 在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
第二十二章常用分子生物学技术的原理及其应用
第二十二章常用分子生物学技术的原理及其应用第二十二章常用分子生物学技术的原理及其应用一、选择题A型题1、用来分析蛋白质的技术是A、Northern blottingB、Southern blottingC、Western blottingD、亲和层析E、离子交换层析2、用来分析DNA的技术是：A、Northern blottingB、Southern blottingC、Western blottingD、亲和层析E、离子交换层析3、下列哪一种不是核酸探针的标记A、同位素标记B、非同位素标记C、地高辛标记D、生物素标记E、辣根过氧化物酶标记4、当双链DNA经加热变性后，按下列哪种方式放置可获得单链DNA？A、37℃水浴B、室温C、4℃冰箱D、冰水或颗粒冰内E、100℃水浴5、与Southern blotting比较，核酸的Dot blotting中可省略的步骤是A、电泳B、核酸样品固定于NC膜C、杂交信号检测D、标记探针E、制备样本核酸6、原位杂交是指A、在NC膜上进行杂交分析B、在组织切片或细胞涂片上进行杂交分析C、直接将核酸点在NC膜上进行杂交分析D、在PVDF膜上进行杂交分析E、在凝胶电泳中进行杂交分析7、关于PCR引物的选择，下列哪项是错误的？A、由于变性温度在95℃，故可选择具有二级结构的引物B、尽可能选择(G+C)含量在50%左右并随机分配的引物C、避免连续的多聚嘌呤顺序D、反应过程中，每种引物的浓度一般在0、1 – 0、5 mol/LE、应避免两引物末端重叠形成二聚体8、有关DNA链末端终止法的不正确说法是A、需要dNTPB、需要ddNMPC、需要ddNTPD、dNTP:ddNTP的比例要合适E、需要放射线同位素和荧光染料9、用PCR技术完成对某一遗传病的疾病基因纯合性缺失的研究过程中不需要的步骤为：A、受检者血白细胞的分离B、白细胞DNA的制备C、配制PCR反应体系D、PCR反应及其产物的琼脂糖电泳E、反应产物的SSCP分析10、在DNA测序的化学裂解法中需要A、用同位素或荧光标记DNA 3’端B、用同位素或荧光标记DNA 5’端C、用随机引物法标记DNAD、用缺口平移法标记RNAE、用DNase水解DNAX型题1、生物大分子印迹技术包括A、Northern blottingB、Southern blottingC、Western blottingD、Dot blottingE、Immunoblotting2、Northern blotting 主要用于A、检测某一组织或细胞中已知的特异DNA的复制情况B、检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的转录情况C、检测某一组织或细胞中已知的特异蛋白质的翻译情况D、可比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况E、可比较不同组织和细胞的不同基因的表达情况3、DNA测序的化学裂解法的基本过程为A、含待测DNA的M13模板的制备B、模板与引物杂交C、引物延伸与合成的阻断D、聚丙烯酰胺凝胶电泳E、放射自显影后分析4、系统的定位克隆工作包括遗传学和分子生物学两部分，所采用的方法主要有A、遗传学的交换分析B、连锁不平衡分析C、染色体异常(缺失、易位)分析D、基因文库的筛选E、基因克隆5、克隆动物的产生A、属于同种异体细胞转移技术B、属于同种异体细胞核转移技术C、其遗传物质来源于另一个同种异体体细胞D、需在体外受精E、为无性繁殖6、有关转基因技术的正确说法包括A、基因转移技术是在整体水平上进行B、基因转移技术是在细胞水平上进行C、将目的基因整合入卵细胞中D、将目的基因整合入受精卵细胞中E、转基因动物个体不能遗传二、名词解释1、基因芯片（gene chip）2、Western blotting3、probe4、real time PCR5、基因剔除技术6、酵母双杂交技术三、问答题1、分子生物学中常用的印渍实验有哪些？有何共同点？主要不同之处有哪些？2、基因转移、基因剔除技术在医学上可能有哪些用途？[参考答案及答案要点]一、选择题A型题1、C2、B3、E4、D5、A6、B7、A8、B9、E 10、BX型题1、ABCDE2、BD3、ABCDE4、ABCDE5、BCE6、BD二、名词解释1、包括DNA芯片和cDNA芯片，是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，与待测的荧光标记样品进行杂交，用激光共聚焦荧光检测系统等进行扫描，通过计算机系统对每一探针位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果，亦被称为DNA微阵列。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用概述分子生物学技术是现代生物学研究中应用广泛的一系列技术方法。
这些技术能够帮助科学家从分子水平上理解生物学系统的结构和功能，并促进相关研究的进展。
本文将介绍几种常用的分子生物学技术，并详细探讨它们的原理和应用。
1. 聚合酶链式反应（PCR）•原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外合成DNA的方法，通过循环性反应使DNA的数量迅速扩增。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热使其解旋成两条单链。
在退火步骤中，引物与模板DNA序列互补碱基配对。
在延伸步骤中，热稳定DNA聚合酶将新的DNA链延伸。
•应用：PCR技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因突变分析、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
此外，PCR还常用于检测病原体、肿瘤标记物以及遗传性疾病的诊断。
2. 凝胶电泳•原理：凝胶电泳是一种分离DNA和蛋白质的常见方法。
该技术基于物质在电场中的迁移速度不同，利用电势差将分子分离开来。
DNA片段在凝胶中迁移速度与其大小有关，大片段迁移较慢，小片段迁移较快。
•应用：凝胶电泳广泛应用于DNA分析、蛋白质分析以及核酸杂交等实验中。
在分子生物学研究中，凝胶电泳可用于确认PCR扩增产物的大小，并进行DNA片段的分离和纯化。
此外，它还可以检测基因突变、遗传关系等。
3. 蛋白质电泳•原理：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
该技术基于蛋白质的大小、电荷和形状差异，利用电势差将蛋白质分离开来。
在电泳过程中，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电场迁移。
•应用：蛋白质电泳在生物学研究和临床诊断中具有重要作用。
它可以用于鉴定蛋白质在细胞中的表达水平、研究蛋白质结构和功能以及检测特定蛋白质的存在与否。
此外，蛋白质电泳还用于分离和纯化重组蛋白质。
4. 核酸杂交•原理：核酸杂交是一种通过互补碱基配对而发生的分子相互作用。
通过标记的探针DNA或RNA与靶序列相互结合形成稳定的双链或三链结构，从而可进行检测和定位。
常用分子生物学技术的原理及其应用
酵母双杂交系统的应用 分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析 分析未知蛋白相互作用 绘制蛋白质相互作用系统图 在药物设计中的应用
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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实时PCR技术原理 实时PCR技术原理 PCR
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(略 )
第六节 遗传修饰动物模型的建立及应用 The establishment and application of heredityhereditymodified animal model
一. 转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎 干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。
医本<生物化学> 医本<生物化学>周爱儒 第六版
第二十二章 常用分子生物学技术的原理 及其应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting 库
是指一个包含了 某一生物体全部DNA 某一生物体全部 序列的克相关基因的克隆与鉴定 Cloning and identification of disease relative gene
分子杂交(nucleic acid hybridization) 一. 分子杂交
不同来源的单链核酸经退火形成双链结构的过程。 不同来源的单链核酸经退火形成双链结构的过程。
DNA DNA DNA RNA
基础：核酸的变性与退火 基础：
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用一、PCR技术1.PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，主要用于扩增DNA片段。
2.PCR技术的原理是通过添加DNA模板、引物和DNA聚合酶，以及一系列特定的温度循环，迅速扩增目标DNA序列。
3.PCR技术的应用广泛，如基因克隆、基因突变分析、疾病诊断等。
二、蛋白质电泳技术1.蛋白质电泳技术是用于分离和定量蛋白质的常用方法。
2.蛋白质电泳技术包括SDS-PAGE和蛋白质西方印迹等。
3.SDS-PAGE是一种蛋白质分子量分析方法，通过凝胶电泳分离蛋白质。
4.蛋白质西方印迹则用于检测特定蛋白质的表达，并通过特异性抗体与该蛋白质结合，产生特定的信号。
三、原位杂交技术1.原位杂交技术是研究基因表达和基因组结构的重要工具。
2.原位杂交技术通过结合特异性探针和标记物，用于检测目标序列在组织或细胞中的分布。
3.原位杂交技术有多种类型，如荧光原位杂交（FISH）和非放射性原位杂交等。
4.原位杂交技术在遗传学研究、疾病诊断和生物学研究中得到广泛应用。
四、基因克隆技术1.基因克隆技术是将特定DNA片段插入到载体DNA中的技术。
2.基因克隆技术的关键步骤包括：DNA片段的切割、载体DNA的选择和连接、转化等。
3.基因克隆技术在基因工程、重组蛋白质的表达以及基因功能研究等方面具有重要应用。
五、DNA测序技术1.DNA测序技术是用于确定DNA序列的方法。
2.DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序等。
3.Sanger测序是一种经典的测序方法，逐个位置确定DNA序列。
4.高通量测序技术通过并行测序大量的DNA片段，实现快速高效的DNA测序，并被广泛应用于基因组学研究、药物研发等领域。
六、蛋白质质谱技术1.蛋白质质谱技术是分析蛋白质结构和功能的重要方法。
2.蛋白质质谱技术包括质谱仪的使用和蛋白质样品的制备等。
3.蛋白质质谱技术能够快速鉴定蛋白质样品中的蛋白质组分，并定量分析特定蛋白质的表达水平。
分子生物学技术及其应用
分子生物学技术及其应用随着科技的不断发展，分子生物学技术已经逐渐成为了生物学前沿研究中的重要工具之一。
从最早的基因克隆技术，到现在的基因编辑和重编程技术，分子生物学技术已经广泛应用于药物研发、生物治疗、基因诊断等多个领域。
本文将着重介绍分子生物学技术的基本原理、主要应用及对未来科技发展的影响。
一、分子生物学技术的基本原理分子生物学技术是一种借助于分子生物学理论，利用各种化学和物理手段对生物大分子进行操作和研究的技术。
其基本原理在于利用生物大分子的物理性质和化学性质来进行分离、纯化和分析。
其中，分子生物学技术的核心是DNA分子的操作和研究。
DNA分子作为生物体内的遗传物质，其结构和功能的研究对于理解生物现象和生命本质有着重要作用。
因此，在分子生物学技术中，对于DNA的操作和研究显得尤为重要。
二、分子生物学技术的主要应用1. 基因克隆技术基因克隆技术是指将DNA分子从源生物体中剪切并插入到另一个宿主生物体中的技术。
其应用广泛，例如在基因疗法、基因工程、药物研发和农业生产等领域中都有重要的作用。
2. 基因编辑技术基因编辑技术是利用CRISPR-Cas9系统定点修改基因序列的技术。
其应用广泛，可用于基因治疗、基因诊断及疾病预防等领域。
3. DNA测序技术DNA测序技术是指通过对DNA分子的测序来分析DNA序列信息的技术。
其应用广泛，可用于遗传病诊断、药物研发、生态环境研究等领域。
4. 基因表达分析技术基因表达分析技术是指通过各种分析手段对基因表达水平进行分析的技术。
其应用广泛，可用于疾病诊断、药物研发、基因工程等领域。
5. 基因组编辑技术基因组编辑技术是指将基因组中的特定部位进行编辑的技术。
其应用广泛，可用于基因治疗、药物研发等领域。
三、分子生物学技术对未来科技发展的影响随着分子生物学技术的不断发展，其在生物医学、农业、环境保护、食品安全等领域中的应用越来越广泛。
分子生物学技术的出现和发展带来了许多新的机遇和挑战。
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting Technique
DNA的变性和复性
目录
复性
RNA
DNA
探针标记技术
探针 (probe) ???
已知序列的多聚核苷酸片段 可被标记:同位素、生物素或荧光染料 可被检测
一、基本概念
核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) ：
3、应用：
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹 (Northern Blot)：
1、利用与DNA印迹相类似的技术分析RNA 就称为RNA blot。RNA印迹技术正好与 DNA相对应，故被称为Northern blot。
2、基本过程：
与Southern Blot相似，但有以下不同： • RNA分子较小，在转移前无需进行限制性
退火（annealing）：当温度突然降低至4565℃,引物与其互补的单链DNA模板在局部 形成杂交链。
Step 2 : Annealing 退火 T ℃ primer-dependent
TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGAT GCTGCTACGTAG
2、基本过程：
(1) 电泳（Electrophoresis）： 一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所 用条件总要确保蛋白质解离成单个 多肽亚基并尽可能减少其相互间的 聚集。
• 蛋白质：SDS-PAGE凝胶
(2) 转膜(Transfer)：
蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固 相支持体。
目前进行的Western印迹反应大多还是从 凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素 滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方 可实现。
分子生物学-分子生物学技术的原理及其应用
遗传变异与进化
研究基因组的突变、遗传变异和物种进化过程。
生物工程与基因治疗
应用分子生物学技术进行
2
将目标基因插入携带载体中，实现基因
的复制和传递。
3
PCR技术
通过反复复制DNA片段，快速扩增目标 DNA序列。
基因测序技术
通过测定DNA碱基序列，获得基因组的 信息。
未来发展趋势和前景
分子生物学技术的不断发展将为医学、农业、环境等领域带来更多应用，推动科学研究和社会发展。
分子生物学-分子生物学 技术的原理及其应用
分子生物学的定义
分子生物学是研究生物体的分子基础和机制的科学，涉及生命的DNA、RNA和蛋白质等分子的结构、功能和 相互作用。
分子生物学的研究领域
基因结构与表达
研究基因的结构、转录过程和蛋白质合成调控 机制。
信号转导与细胞通讯
研究细胞内信号传递、细胞通讯和细胞命运决 定。
分子生物学技术的应用
生物工程
利用基因工程技术改良农作物、制造药物等。
功能基因研究
研究基因在生物体内的功能和作用机制。
基因改良
改良农作物和家畜，提高产量和品质。
医学诊断
通过基因检测诊断疾病，提供个性化医疗方案。
基因治疗
通过修复异常基因或引入正常基因来治疗遗传 性疾病。
检验食品安全
利用基因检测技术检测食品中的有害成分。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验技术。
这些技术基于对核酸（DNA和RNA）和蛋白质的结构和功能的研究，以及对基因表达和调控机制的理解。
在本文中，我将介绍常用分子生物学技术的原理和应用。
1.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。
它基于DNA的两条链之间的互补配对，使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和温度周期变化的条件下进行。
PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学研究中，包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA，RNA和蛋白质的常用技术。
其中，聚丙烯酰胺（或琼脂糖）是一种高分子量聚合物，能够形成孔隙凝胶。
在电场的作用下，DNA，RNA或蛋白质在凝胶中迁移，根据大小和电荷的差异进行分离。
凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化，以及蛋白质的分析和鉴定。
3.DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的技术。
它通过测量DNA片段中的碱基顺序来分析DNA的序列信息。
目前有多种DNA测序技术，包括链终止测序（Sanger测序）和高通量测序（如Illumina测序和Ion Torrent测序）。
DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。
4.基因克隆技术：基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增，并将其插入到载体DNA 中，然后转化到宿主细胞中。
利用基因工程技术，克隆的基因可以在宿主细胞中被表达。
这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生物的制备以及基因治疗的研究中。
5. 蛋白质电泳和Western blot：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
与DNA电泳类似，蛋白质电泳通过在聚丙烯酰胺凝胶中迁移蛋白质来分离不同大小和电荷的蛋白质。
Western blot是一种检测目标蛋白质的特异性抗体的技术，通过将蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合来检测和定量蛋白质。
常用分子生物学技术的原理及应用
琼脂糖分离的DNA片段 → 变性为单链 → 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 → 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到 NC膜上，使之成为固相化分子。
载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与 另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有 互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的 DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子 的区带。
DNA ISH can be used to determine the structure of chromosomes.
Fluorescent DNA ISH (FISH) can, for example, be used in medical diagnostics to assess chromosomal integrity.
辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含 有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标 记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发
射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
Western blotting应用
PCR方法被美国Science杂志评为1989年 的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被 评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。
The Nobel Prize in Chemistry 1993
"for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry"
常用分子生物学技术的原理及应用
根据中心法则，可以RNA为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根据mRNA的3’端有poly(A)的特点，在进行反转录时，就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据poly(A)的原理设计的。 根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
由宿主控制的限制与修饰作用使得细菌避免噬菌体感染，如果噬菌体DNA没有被修饰过，进入宿主就会被限制性酶切断。如果被修饰过，其侵染细菌的效率就提高。
限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用
分子克隆 (Molecular Cloning)
1.Vectors
Vectors: A DNA (a plasmid or a phage DNA) that serves as a carrier in gene cloning experiments.
本章常用技术词汇
一 基因工程与分子克隆
(genetic engineering and molecular cloning)
Research content: genomic library, cDNA library, gene cloning, gene expression, gene regulation, gene knockout 用于基因克隆的工具酶 (enzymes for gene cloning) 在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。
以DNA一条链为模板， 诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点 以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNA 当遇到转录终止信号时，转录即停止。
分子生物学技术原理
生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子 性质及其所在介质的 pH及其组成。由于混合物中各 组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同， 在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也 各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同， 从而达到分离鉴定各组分的目的。
在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于 质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘 积。 F＝QX 质点的前移同样要受到阻力（ f ）的影响，对 于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f ＝6π r ην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质 点移动速度）
按支持介质形状不同可分为：
⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳 ； ⑶ 柱电泳
三. 分类
按待分离大分子的不同可分为：
DNA电泳 RNA电泳 蛋白电泳
其他
双向电泳 测序电泳 脉冲场电泳
核酸电泳原理
核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电 极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与 电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子 的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以， DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、 RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）- ethidium bromide染 色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
蛋白质电泳
IEF （等电聚焦）is used to separates proteins by their charge (pI, point of isoelectric).
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。
它的原理是基于DNA的逐步复制。
PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。
通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程，可以在短时间内扩增指定的DNA片段。
应用：PCR在许多领域得到广泛应用。
它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。
例如，PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。
2.DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。
（1）Sanger测序原理：Sanger测序是一种经典的测序方法，基于DNA的DDN反应。
它利用碱基的链终止效应，使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断，从而得到不同长度的DNA片段。
通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段，可以确定DNA序列。
（2）高通量测序原理：高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等，通过以平行方式同时测序多个DNA片段，大大提高了测序效率和数据产量。
应用：DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。
它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。
3.基因克隆：基因克隆是将DNA片段插入载体（如质粒）中并转化到细胞中，从而实现特定基因的复制和表达。
基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。
应用：基因克隆技术是分子生物学研究的基础。
它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。
4.蛋白质表达：蛋白质表达是将基因转录为mRNA，再通过翻译作用合成蛋白质的过程。
蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。
（1）原核表达系统：原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
这些系统可以用于高效表达蛋白质，并且易于操作。
（2）真核表达系统：真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、基本工作原理
•Template • 5 DNA
•5
• 5
•Cycle 1
•Primer 1 •5 •Primer 2
•5 • 5
•5 •5
•Cycle 2
•5 • 5
•5
• 5
•5
• 5
•5 •5
•目 录
•5 • 5
• 5 • 5
•Cycle 3
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•第 八 节
•蛋白质相互作用研究技术
•Research Technology of Interaction of Protein
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•蛋白质之间相互作用研究的重要性
• 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而 形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主 要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括 DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、 信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间 的相互作用。
•生 物 芯 片 技 术
•Biological Chip Technology
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip)
•cDNA芯片(cDNA chip)
• 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片
段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•实时PCR技术原理
•目 录
第三节
核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
（四）定位候选基因克隆策略
当致病基因的染色体定位确认后， 人们可以利用因特网上的基因网站 所提供基因序列数据，鉴定出候选 致病基因。
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
第六节
遗传修饰动物模型的建立
及应用
•The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
•变性
•95˚C
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•延伸 •72˚C
•退火
•Tm-5˚C
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、转基因技术
•转基因技术 • 采用基因转移技术使目的基因整合入 受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导 入动物子宫，使之发育成个体。
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•转基因——被导入的目的基因
•转基因动物(transgenic animal)
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
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第二十二章常用分子生物学技结果举例
•第一轮筛选
•第二轮筛选
•第三轮筛选
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•第 五 节
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•二、核转移技术
核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物
体细胞核全部导入另一个体的去 胞核的受精卵内，使之发育成个 体，即克隆(clone)。
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•目 录
•三、基因剔除技术
•基因剔除技术 • 也称基因靶向(gene targeting)灭 活，有目的去除动物体内某种基因 的技术。
•系统的定位克隆工作
•① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
• 交换分析、连锁不平衡分析
•② 分子生物学分析
• 染色体异常(缺失、易位等)分技术的原 理及应用
（三）非定位候选基因克隆策略
由于基因组作图的完成和分子病理学的 发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根 据病理学变化和对各种基因产物功能的了解， 预测出候选致病基因。
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
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•复性
•RNA
•DNA
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
• （一）印迹技术 • （二）探针技术
• 探针 (probe) • 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记 其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定 在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核 酸分子存在。
第二十二章常用分子生 物学技术的原理及应用
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2020/12/9
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、分子杂交与印迹技术的原理
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•DNA自动测序结果举例
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第二十二章常用分子生物学技术的原 •目 录 理及应用
PPT文第二十二章常用分一个包含了某一生物体全部y)
强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同
分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同
的DNA片段，将这些片段经电泳分离。
• 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放
射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•二、DNA链末端合成终止法
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•常用蛋白质相互作用的研究技术
•酵母双杂交 •各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） •荧光共振能量转换效应分析 •噬菌体显示系统筛选等等
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、酵母双杂交技术的基本原理
•目 录
3rew
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•克隆疾病相关基因的策略
•
（一）功能性克隆(functional cloning)
•
（二）定位克隆(positional cloning)
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•二、印迹技术的类别及应用
•（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) • 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
•（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) • 用于RNA的定性定量分析。
•（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotional complementation assay) • 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•（二）定位克隆
•定义 • 从一种致病基因的染色体定位出发逐步 缩小范围，最后克隆该基因。
•定义 • 从对一种致病基因的功能的了解出发， 克隆该致病基因。
•应用 • 生化机制已明确、基因表达产物较易得 到部分纯化的遗传性疾病。
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
• 克隆方式 寡核苷
•核酸序列分析的基本原理 •化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) •DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
•基本原理
• 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个
碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
四、基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•第 七 节 •
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•
•②
•①
•③
•分子杂交实验
•目 录
•放 射 自 显 影 照 片
•目 录
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•DN A点 阵
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•目 录
第二节
聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•目 录
•三、DNA自动测序
• 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列 分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱 氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发 射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并 依此确定DNA碱基的排列顺序。