基因工程的工具酶解析
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
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04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
第三章 基因工程工具酶
（3）牛血清蛋白 (BSA)
BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、 的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 的酶变性。 会引起电泳拖尾。
Ⅱ类 R-M 系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两 种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲 基化酶。 甲基化酶也称修饰酶 (modification enzyme)，用 来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶 （C）5- 氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限 制性内切酶识别而免于切割。
甲基化酶分两类： 甲基化酶分两类：
第三章 基因工程工具酶
基因工程工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， 是依赖一些酶 如限制性核酸内切酶，连接酶， 如限制性核酸内切酶 DN聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割 聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“ 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工 具酶” 工具酶是对野生菌株（ 具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如 酵母）进行改造、优化、 酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产 品。
DNA连接酶（ligase） 连接酶（ 连接酶 ）
能够催化 DNA 中相邻的 3’-羟基和 5’-磷酸 基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可 使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
基因工程3-3基因操作的工具酶
由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在 质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。 (1) 切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。 (2) 切除cDNA的发夹结构。
26
3.3 DNA聚合酶
DNA聚合酶 ：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到
双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端，使核 苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。
反应特点 ：
(1) 以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物 (2) 反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链
所决定 (3) 聚合反应需要有引物存在，且引物要有3’-OH
Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5’延 伸末端）。
13
14
对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5’ 延伸末端可用32PdATP标记：
而BamH I切割后形成的5’延伸末端可用
32PdGTP标记：
15
3.3.3 T4 DNA聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一
种特殊的DNA聚合酶。 1. T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶：
合成的方向移动——缺口平移（Nick
Translation）。 9
应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的 反应体系是：在25 l总体积中含有1 g纯化的特 定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、 32PdNTP和未标记的dNTP。
脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶， 它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸 末端的单（寡）核苷酸。
解方向有两种： * 从RNA链 5’末端外切：称5’ 3’外切RNA 酶 * 从RNA链 3’末端外切：称3’ 5’外切RNA 酶
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
基因工程所用到的酶
基因工程所用到的酶基因工程中所用到的酶。
一、限制性核酸内切酶。
1. 作用。
- 限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子。
例如，EcoRⅠ识别的序列是GAATTC，它会在G和A之间切割DNA双链。
这种酶在基因工程中的作用至关重要，它就像是一把“分子剪刀”，可以将目的基因从供体DNA中精准地切割下来。
- 原因是基因工程常常需要将特定的基因片段进行分离和操作。
如果没有这种精确切割的酶，就无法准确获取目的基因，后续的基因重组等操作也就无法进行。
2. 类型。
- 限制性核酸内切酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
其中Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的类型。
- Ⅰ型限制性核酸内切酶的切割位点不固定，离识别位点较远，并且需要ATP、Mg²⁺和S - 腺苷甲硫氨酸等多种辅助因子，这使得其在基因工程中的应用受到限制。
而Ⅱ型限制性核酸内切酶只需要Mg²⁺作为辅助因子，它的识别序列和切割序列是固定的，通常是4 - 8个碱基对的回文序列，这使得它能够非常精准地切割DNA，方便基因工程操作。
Ⅲ型限制性核酸内切酶也需要多种辅助因子，且切割位点不固定，所以应用较少。
二、DNA连接酶。
1. 作用。
- DNA连接酶能够将两个具有相同粘性末端或者平末端的DNA片段连接起来。
在基因工程中，它的作用是将切割下来的目的基因与载体（如质粒）连接在一起，形成重组DNA分子。
例如，T4 DNA连接酶可以连接粘性末端和平末端的DNA片段，在构建基因表达载体时起到关键的连接作用。
- 原因是基因工程的核心是构建重组DNA分子，而将目的基因和载体连接是构建重组DNA的关键步骤。
如果没有DNA连接酶，目的基因和载体就无法形成一个完整的重组分子，也就无法将目的基因导入受体细胞进行表达。
2. 种类。
- 常见的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
E.coli DNA连接酶只能连接粘性末端，并且需要NAD⁺作为辅助因子；而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端，也能连接平末端，需要ATP作为辅助因子。
基因工程常用工具酶及应用
DNA 连接酶
36
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
37
三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
38
四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
14
四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
15
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
基因工程基因工程工具酶
2023-11-03
目录
• 基因工程工具酶概述 • 基因工程工具酶的种类及应用 • 基因工程工具酶的生产及纯化 • 基因工程工具酶的发展趋势及挑战 • 基因工程工具酶的相关法规及伦理问题
01
基因工程工具酶概述
基因工程工具酶的定义
基因工程工具酶是指那些在基因工程实验中用于切割、修饰 、检测和操控DNA的酶。
详细描述
DNA连接酶可以连接DNA片段之间的缺口，实现DNA分子的拼接。在基因工程中，它被广泛应用于 基因克隆、载体构建、测序等实验中。根据来源不同，DNA连接酶具有不同的特性和应用范围。
逆转录酶
总结词
逆转录酶是一种能够将RNA转化为cDNA 的酶，是基因工程中重要的工具酶之一。
VS
详细描述
逆转录酶可以逆转录RNA分子，生成 cDNA分子。在基因工程中，它被广泛应 用于RNA测序、cDNA库构建、基因克隆 等实验中。根据来源不同，逆转录酶具有 不同的特性和应用范围。
03
基因工程工具酶的生产及 纯化
基因工程工具酶的生产
01
02
03
基因克隆
将目标酶的基因克隆到表 达载体中，构建成重组 DNA分子。
细胞转化
将重组DNA分子导入宿 主细胞，使目标基因在细 胞内表达。
培养基选择
选择适合细胞生长和酶表 达的培养基，优化培养条 件。
基因工程工具酶的纯化
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放出目标酶。
这些酶主要来自生物体内，但也可以通过基因工程技术进行 人工改造和优化。
基因工程工具酶的重要性
基因工程工具酶是实现基因操作的关键工具，没有它们，我们无法实现从DNA片 段到完整基因组的精确编辑。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
3第三章 基因工程的工具酶
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序 类限制性内切酶的底物识别顺序 及切割位点
几种最常用的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶名称 BamHⅠ Ⅰ Cla Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ KpnⅠ Not Ⅰ Pst Ⅰ Sal Ⅰ Sau3A Ⅰ Sfi Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ 识别序列和切割点 G↓GATCC AT↓CGAT G↓AATTC A↓AGCTT GTPy↓PuAC GGTAC↓C GC↓GGCCGC CTGCA↓G G↓TCGAC ↓GATC GGCCNNNN↓NGGCC CCC↓GGG T↓CTAGA C↓TCGAG
酶 限制性核酸内切酶 主要用途 识别DNA特定序列，切断DNA链 特定序列，切断 识别 特定序列 链 ①缺口平移制作标记DNA探针 缺口平移制作标记 探针 合成cDNA的第二链 ②合成 的第二链 填补双链DNA3’凹端 ③填补双链 凹端 ④DNA序列分析 序列分析 聚合酶链反应（ 聚合酶链反应（PCR） ） 连接两个DNA分子或片段 分子或片段 连接两个 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化， 催化多核苷酸 羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 羟基末端磷酸化 在3’末端加入同质多聚物尾 末端加入同质多聚物尾 降解单链DNA或RNA，使双链 或 降解单链 ，使双链DNA突出端变为平端 突出端变为平端 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 ，在双链 降解 上产生随机切口 降解除RNA 降解除 切除核酸末端磷酸基
有大量的修饰酶，主要的有以下几种： 有大量的修饰酶，主要的有以下几种： 1） 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道） ） 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道） 可以去掉DNA分子的 端的磷酸基团。 分子的5‘端的磷酸基团 可以去掉 分子的 端的磷酸基团。 p HO 5 ‘ 3‘ p 3‘ 5 ‘ OH 2） polynucleotide kinase: 来自于 侵染的 来自于T4侵染的 ） 大肠杆菌， 端增加磷酸基团。 大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。 端增加磷酸基团
第八章 基因工程的工具酶-最终版
四、限制性核酸内切酶的酶切反应条件
大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl MgCl2 NaCl DTT Volume TT BSA
50 mM pH 7.5 10 mM 0 - 150 mM 1 mM 20 - 100 ml 37 ℃ 1 - 2 hr 100ug/ml
0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶
背景知识：大肠杆菌宿主控制的限制与修饰
细菌的限制—修饰作用 1952年，Luria和Human， 1953年，Bertani和Weigle 发现细菌的限制（restriction）现象：
感染 大肠杆菌k
噬菌体λ（k） 大肠杆菌 B【大肠杆菌 B 限制 λ（k）】
不感染
一、限制性核酸内切酶的发现
五、影响限制性内切酶活性的因素
（一）星活性 （二）DNA样品纯度 （三）DNA的甲基化程度 （四）DNA的分子结构 （五）侧翼序列长度
（一）星活性（star activity）
又称星号活性，一些限制性内切酶在某些 反应条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度 过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶 剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。 例如识别6个核苷酸的酶现在变成了识别5个或4 个核苷酸序列了。
仍有少量噬菌体λ(K)可在 E. coli B中生存，是因为大 肠杆菌B对噬菌体λ(K)进行了修饰。
修饰的噬菌体λ (B)
10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
10-4（限制作用）
修饰的噬菌体 λ (K)
1（修饰作用）
R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成 了 寄 主 控 制 的 限 制 — 修 饰 系 统 (R-M Restrictionmodification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限 制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修 饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降 解。
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限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
一、限制性内切酶的发现
附在E Coli上的噬菌体
（一）限制-修饰现象（restriction and modification）
Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中分离到的第3个限制酶。
四、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 6～8； NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基具有保护作
用； 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复
Ⅱ，Ⅲ等。
名
属种 株序
称
名 名名 号
EcoRⅠ E co R Ⅰ
Hind Ⅲ H in d Ⅲ
HindⅡ H in d Ⅱ
HpaⅠ H pa / Ⅰ
菌株来源
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
（二）寄主的限制与修饰
限制－修饰 ： 细菌能将外来DNA片段在 某些专一位点上切断，从而保证其不为外 来噬菌体所感染，而其自身的染色体 DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以 保护，这种现象叫做限制－修饰
（三）限制-修饰系统的作用（特点）
菌株内具有与内切酶活性相当的DNA甲 基化酶；
甲基化酶能把甲基加到与限制性内切酶 结合位点相同序列的A或C的亚基上;
基因工程工具酶
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
工具酶
工具酶是指能用于DNA和RNA分子 的切割、连接、聚合、反转录等有关的 各种酶系统称为工具酶。工具酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
Ⅲ型酶的作用方式 (引自Lewin,1997）
三、 限制性核酸内切酶的命名原则
用来源菌株属名的第一个字母（大写）和种名的前 两个字母（小写），构成基本名称。表示寄主菌的 物种名。（斜体)
一个字母（小写）代表菌株或型 。 若酶存在于质粒上，则需大写字母表示染色体以外
成分 同一菌株中存在不同的酶，用罗马数字顺序编号I,
甲基化使得靶位点不被内切酶切割掉。
（四）限制与修饰机理
限制与修饰由三个基因位点所控制： hsd R, hsd M, hsd S
➢ hsd R--编码限制性内切酶 ➢ hsd M--编码限制性甲基化酶 ➢ hsd S--控制两个系统的表达：协助上述两
种酶识别特殊的作用位点
由甲基化 酶和限制 性核酸内 切酶两种 酶活性配 合进行的
时间：1950’
人物与材料： ➢ T偶数噬菌体（Luria） ➢ λ噬菌体 & P2噬菌体(Bertani & Weigle）:更 具代表性和普遍性
请看实验
K、B具有核酸内切酶，能将外源DNA切断，保护自 己的方式是在这些内切酶的位点上进行甲基化；
甲基化的方式：N6甲基-A或C5甲基-C。
C不具有核酸内切酶。
核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
基因工程常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
杂合位点（hybrid site)：由一对同尾酶 分别产生的粘性末端共价结合形成的位 点。杂合位点一般不能再被原来的任何 一种同尾酶所识别。
MunI：5` - C A A T T G - 3`
同裂酶
同尾酶
5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5`
Bam ---3`
3`---C CTAG
G---5`
5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5`
Bgl II
5`---A
GATC T---3`
3`---T CTAG
A---5`
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 子。
第一节 限制性核酸内切酶 Restriction enzymes
“分子 剪刀”
限制性核酸内切酶 — 在DNA上核苷酸的特定连
宿主的限制与修饰的作用： （1）保护自身DNA不受限制（修饰后）， （2）破坏入侵的外源DNA（限制作用）。
基因工程中采用没有限制作用的菌株作受 体，使基因操作得以进行。
➢ r-M+限制缺陷，具有修饰作用。 ➢ r-M-限制缺陷， 修饰缺陷。
二、限制性核酸内切酶的分类
I类酶的作用方式 (引自Lewin,1997)
回文结构（Palindromic）
大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形 式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。
不同限制性内切酶切割的三种结果
粘性末端(blunt ends )
5′粘性末端 3′粘性末端
平头末端(blunt ends )
5′粘性末端
3′粘性末端
平头末端
五、同位酶与同尾酶
冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 为7bp～8bp，甚或多于 8bp。
多数限制酶的识别序 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 中的磷酸二酯键。
同位酶(isoschizomer) ： 也称同裂酶，识别位点的DNA序列相同
的一类限制性内切酶（切点不一定相同）；
同尾酶(isocandamer) 酶切后产生的DNA粘性末端相同的一类
限制酶（识别位点序列不一定相同） 。如
BamHI, BclI,Bgl Ⅱ ,Sau3AI,XhoⅡ是一 组同尾酶。