Western Blot 实验技术及心得
western blot实验经验总结
western blot实验经验总结1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。
原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。
在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。
Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。
我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。
具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。
揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。
western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。
我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。
效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。
Western-Blotting实验报告
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法优点： 1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点： 1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
免疫印迹实验报告——westerblot
免疫印迹实验报告——westerblotWestern blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
Western Blot个人总结详细版
Western Blot—单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例—中山大学临床检验诊断学硕士—刘记2016/11/141．蛋白制样A．贴壁单层细胞的处理：1）60mm细胞培养皿按200ul/皿，准备RIPA裂解液【6孔板100ul/孔，按底面积换算，用量不能过多，不然后续蛋白浓度过稀，无法保证15ul有足够的蛋白上样量】2）使用前将CockTail按1:100加入RIPA，混匀，冰上备用3）收取培养上清后，预冷PBS洗涤两遍【洗涤干净培养基，防止BCA培养基颜色干扰】4）200ul/皿，加入RIPA裂解液，冰上放置5分钟，轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞5）冰上操作，细胞刮刷将细胞刮向一侧，加样枪收样到标记好的EP管，冰上放置6）离心，4℃，14000Xg，15min7）冰上操作，收上清至新标记好的EP管，冰上放置B．BCA测定蛋白浓度：按照碧云天BCA试剂盒说明书操作即可1）收取蛋白样品稀释10-20倍测浓度2）蛋白标准品在公用-20℃冰箱2层C．蛋白浓度调整：1）根据BCA蛋白浓度测定结果，按15ul上样体积【15-20ul】，40ug总上样量【30-100ug】，等体积，等蛋白量上样调整浓度至一致2）加入5XSDS蛋白上样缓冲液3ul，剩余12ul由上样蛋白和PBS补足3）按照计算好的每个15ul总体积需要加入的蛋白体积，PBS体积，5XSDS蛋白上样缓冲液体积，按6个15ul即90ul总体积，用量各X6配总体系【0.5mlEP管】，煮沸5min后再分装到每个小的EP管4）用0.5mlEP管配总体系，煮沸5min【使用0.5mlEP管，煮沸时不易进水】5）分装至0.2mlEP管【不要用0.2ml的EP管煮沸，易进水，改变总体积】，-80℃保存备用2．SDS-PAGEA．配胶【以1.0mm厚度mini胶为例】1）按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶2）选用新配置AP，4℃保存3）将玻璃板洗洁精洗涤干净，自来水冲洗干净，烘箱烘干备用；固定架上的软垫洗涤干净；梳子洗涤干净，烘干备用4）配胶用小烧杯洗净，倒扣纸巾吸干水滴，严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分5）按照每块mini胶5ml用量配置分离胶，3ml用量配置浓缩胶6）加入TEMED后，迅速将分离胶倒入15ml离心管，迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接近上缘，最后用1ml加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘【此步骤速度要快，防止凝固，导致分离胶上缘不平】7）尽快用1ml加样枪加无水乙醇进行液封，将分离胶上缘压平8）可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固，判断配胶是否出现问题，不凝固最常见问题是AP失效9）待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线，5min左右，快速倒去无水乙醇，滤纸沿边缘吸干10）按照配方配置浓缩胶，加入TEMED后，用1ml加样枪迅速加满玻璃板，除去任何气泡11）将洗净的梳子迅速斜行划入，垂直压下，观察严禁梳子下方出现气泡，静置30min【跟室温和AP活性有关，可放入湿度温箱加速凝固】12）通过观察配浓缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题13）蛋白胶的保存，放入小袋，加少量单蒸水，保证胶润湿，常温保存可一周【4℃保存过久易出现裂胶】B．蛋白上样1）将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起，小玻璃板向内，带字玻璃板向外，组成内电泳槽，放入大电泳槽，内外槽均加满1X的SDS电泳缓冲液2）在电泳缓冲液浸没的情况下，垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子，易致泳道破裂或粘合】3）蛋白上样，mini胶每孔上样蛋白体积最好15ul，最多不超过20ul，否则容易出现蛋白样品外溢，进入其它泳道或者曝光易出现β-actin的相连成线，上样预染蛋白marker，并记录蛋白样本次序，记住靠近marker的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜，可以在蛋白样本两侧各加一个泳道的蛋白marker，向内压】C．电泳1）按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子，插上电极2）打开电源开关，调整电压80V，观察电泳槽出现小气泡上浮，证明正在电泳3）2h左右，观察溴酚蓝位置，待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时，终止电泳，关掉电源，拔下电极，盖子3．转膜-半干转法1）预先配好1L干转专用转膜缓冲液，向小瓷盘倒入一定量转膜液2）将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液，准备干净的玻璃棒，镊子放入转膜液3）用绿色塑料小撬板将小玻璃板撬开，切除浓缩胶，立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做标记，标注正面，如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散，可以在玻璃分离胶之前，用手术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶；在电泳缓冲液里小心撬开分离胶，用撬板拖入转膜液内4）干转仪地面加少量转膜液润湿，从下向上一次放置滤纸，NC膜，分离胶，滤纸，每放入一层，立即用玻璃棒排出气泡，再加一定量转膜液；放下NC膜后即可用刀片在一角切除标记正面；放下分离胶之后，玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行，轻轻赶动5）盖好转膜仪盖子，插上电极，打开开关，调整电压15V，40min，转膜4．封闭1）转模后，用镊子小心将NC膜取出2）在桌面保鲜膜上加少量TBST，按照预知的目的蛋白分子量KD大小，参照预染marker位置，用刀片切下NC膜，至少多切上下各1个marker位点3）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次4）用5%脱脂奶粉（TBST配置），在抗体孵育盒内，每个格子加入5ml，放入剪切好的NC膜5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时5．孵一抗1）回收封闭液，4℃保存，一周可反复用三次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或者用TBST配置5%BSA作为一抗稀释液】4）每格加入5ml一抗稀释液‘5）摇床，最小转速，4℃孵育过夜6．孵二抗1）回收一抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次，不少于6个月2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用封闭液5%脱脂奶粉（TBST配置）稀释二抗4）每格加入5ml二抗稀释液‘5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时7．化学发光1）回收二抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）1:1配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作，避光保存；按每张膜1ml量配置4）带上镊子，干净玻璃平皿，1ml加样枪，枪头，发光工作液5）在化学发光仪上曝光拍照8．配置溶液1）10%SDS—用于配胶，常温保存2）AP—新鲜配置，4℃保存3）20%TWEEN—配置TBST需要使用4）转膜缓冲液—按照配方配置2X储存液，用前单蒸水稀释至1X5）电泳缓冲液—公用5X储存液，用前单蒸水稀释至1X，或者按配方自己配置6）TBS—商品化粉末溶解即可7）TBST—TBS和20%TWEEN配置8）配胶所需其他几种成分（30%丙烯酰胺，0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8，TEMED），5XSDS loading buffer，TBS粉末，可以购买商品化产品9．注意事项小结1）电泳缓冲液可配置2X或5X，使用之前用单蒸水稀释至1X，最好不要用PBS稀释，影响组分及导电性2）转膜缓冲液最好自己配置，可配置2X，用前单蒸水稀释至1X，干转15V恒压时初始电流应在800-900mA才正常；若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途，湿转用转膜液，15V恒压转膜，初始电流300mA左右，不适合干转3）拔梳子禁止干拔，应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔4）资料：转膜用NC膜不分正反面，注意孔径选择：0.45μm-大于20KD，0.22μm-小于20KD；自己实验证明统一选用0.45μm可以做出结果5）丽春红染色主要目的是NC膜上蛋白，判定是否成功转膜，并可助于染色条带剪切出目的蛋白位点的NC膜条带，剪下的NC膜用TBST洗涤去除丽春红染色，放入孵育盒开始封闭；丽春红染色步骤可以省略，前提是清楚确定目的蛋白所在位置6）封闭选用进口脱脂牛奶溶于TBST中配置5%脱脂牛奶，室温慢摇不少于2h7）一抗用一抗专用稀释液或者TBST配置5%BSA（不能用脱脂牛奶，易变质），4℃慢摇至少孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用；一抗可4℃孵育过夜或两天，不影响效果8）二抗用封闭液稀释，室温慢摇不少于2小时9）每次更换孵育液前用TBST进行洗膜，10min/次，洗涤2次，快摇10）剪切好的膜放在抗体孵育盒内，进行封闭，孵一抗，孵二抗及洗膜过程中，不用拿出膜，可直接倾倒液体11）加发光液前，将NC膜从TBST洗涤液夹出，反面放在纸巾吸干液滴，不要正面摩擦纸巾，防止蛋白脱落。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
Western blot学习心得
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四蛋白质电泳
• 板子固定于电泳架→板子间加电泳缓冲液→上样→将板子放入 电泳槽中→倒入电泳缓冲液→加盖、插电源 • 1、玻璃板固定要注意小玻璃板向内，大玻璃板向外。 • 2、上样前一定要先加电泳液，将板子处在电泳环境中，起码没 过小玻璃板。电泳槽中按板子数量将电泳液加至2G刻度或4G刻 度。 • 3、将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。加样太快可使样 品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。 • 4、蛋白上样量一般20-50μg，按浓度计算上样体积，体积一般 不超过20μl。 • 5、样品两边要加Maker，以便于转膜时有清洗的界线。Maker 两边分别加2个孔的上样缓冲液，可减轻边缘效应。 • 6、电泳电压调至100V，电泳1小时。此为经验值，电压小，跑 的慢。观察溴酚蓝刚跑出可终止。
二蛋白质定量
• BCA蛋白质定量盒。按说明说操作。省略
三洗板子、灌胶
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论述学习western blotting技术心得
论述学习western blotting技术心得Westernblotting，也叫做蛋白免疫印迹（immunoblotting），是一种用于检测蛋白质的有效技术。
它有助于研究蛋白的表达、结构及功能的变化。
Western blotting在医学检测、分子生物学研究、病毒分析等领域都有广泛应用。
Western blotting技术主要由几个步骤组成，包括电泳、转印、洗涤、去背景、免疫检测和发光检测等步骤。
电泳能够将蛋白质分离出来，以便以后的检测。
转印将分离出的蛋白质转移到膜上，以便进行后续操作。
然后，经过洗涤这一步，膜上的蛋白质能够实现更好的排列。
随后，进行去背景操作，以减少接下来的免疫检测的干扰。
在免疫检测步骤中，一般使用抗体，对膜上的蛋白质进行特异性结合。
最后，发光检测能够有效检测出特异性结合的抗体，从而获得结果。
在实际操作Western blotting技术时，我深刻感受到，这项技术需要严格控制实验条件，以保证数据的准确性和可靠性。
首先，正确掌握样品稀释量是获得有效数据的关键，过低或过高的比例会造成失真，影响检测结果的准确性。
另外，实验步骤的执行需要严格的时间控制。
如果时间太短，则可能导致结果的不准确；如果时间太长，可能会将蛋白质破坏，也会影响结果的准确性。
此外，在每一步，如转印、洗涤过程中，都需要对操作温度进行精确控制，以确保操作的准确性。
最后，在发光检测步骤时，还需要调整扫描仪参数，以保证数据的准确性。
通过实际操作Western blotting技术，我发现，这项技术具有很高的可行性和准确性，能够有效检测和定量分析蛋白质的表达水平和表达变化。
此外，Western blotting技术操作简单，无需复杂的设备和技术，是一项低成本、高效的检测技术。
通过本次操作，我明白了Western blotting技术的重要性，它能够帮助我们有效获取蛋白质的表达信息。
虽然我们在实验操作时需要更多的耐心和技巧，但正是这种精细的技术，才能够帮助我们研究蛋白质的结构和功能。
western blot自己总结
Western blot一、提取细胞蛋白1、准备：将培养板置于冰上，准备刮刀，去离子水，纸，PBS，枪，废液缸，离心管，ripa，蛋白酶抑制剂。
2、配制裂解液：取细胞培养板，按：每空加ripa35μl计算共需ripa量，再按1%比例计算共需蛋白酶抑制剂的量。
两者相加即为裂解液的量。
再将两者加入到ep管中。
3、处理细胞：将培养基倒掉，用PBS洗两遍，倒尽PBS，用枪吸干残余PBS，加入裂解液35μl，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
用刮刀刮净细胞。
4、离心：用枪将细胞与裂解液一起吸入，转移至离心管中，离心13500转，离心15分钟。
5、存放：取上清液转移至ep管中，-20°C储存测浓度，-80°C存放。
二、测蛋白浓度1、准备：将取出的蛋白置于冰上，枪，标记96孔板，BCA，ripa2、配BCA液：按：每孔加200μl A计算，每空加4μl B计算，配制共需BCA液。
3、区部混匀：按：每孔28.5μl ripa,1.5μl蛋白,先加入到离心管中,涡旋,瞬离。
4、全部混匀：按：每孔20μl局部混合液，200μl BCA液加入到96孔板中。
加样时枪头在液面下，提抢时贴壁，尽量不产生气泡。
5、反应：将96孔板置于37度温箱，反应30min。
6,、检测：酶标仪检测，计算浓度，ripa，loading，记录数据。
三、蛋白样预处理1、加样：按计算量将1.5倍的蛋白，ripa，loading量加入到ep管中，此过程在冰上进行，涡旋，瞬离。
2、煮样：100摄氏度，煮5min，看好防崩盖，涡旋，瞬离。
四、电泳1，配电泳液，转膜液：1）、电泳液：甘氨酸15.0g，Tris-base3.02 g,去离子水1000ml,摇,SDS1g。
2）、转膜液：甘氨酸14.4g，tris-base3.00g，去离子水850ml，甲醇150m 2，配胶：1)、洗板，板上没有胶粒。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
WesternBlot实验经验分享，你都知道吗？
WesternBlot实验经验分享，你都知道吗？Western blot真的是让人头疼的实验，辛苦付出和完美结果不成正比的实验，是整个研究生阶段最磨练我个人忍耐力的实验，要掌握整体操作并不难，但是需要注意的细节却很多，而且，三分靠努力，七分靠运气，当你把能做的都做了的时候，能修改的条件都修改了，结果仍然是空白条带，what can I do for you?今天，小编给大家简单整理一下，自己在跑小分子蛋白和大分子蛋白时，摸索出来的经验和条件，欢迎大家积极讨论分享。
一、小分子蛋白小编当时在跑S100A4，分子量12kDa。
首先，要注意的一点就是，小分子蛋白很容易在提取的过程中降解，所以整个操作过程一定要保证在冰上低温快速充分的研磨提取，具体的裂解组织的步骤我就不说了，不过说到组织，小编想提一句，组织提蛋白有一点需要注意，就是这个蛋白在组织中的表达丰度、以及蛋白定位。
胞浆或者核内的蛋白提取方式会有不同，细胞核内的蛋白可能需要特殊的裂解液，一是通过阅读文献，清楚相同的蛋白和组织，别人的跑出来的情况如何；二是可以通过在The Human Protein Atlas网站（不懂看这个（工具篇）S5E50：航母级神器——蛋白组学结果大收录！）上查询。
1、电泳条件：a) 小分子的蛋白电泳建议选择15%分离胶，5%浓缩胶。
正常配胶时，一个迷你垂直电泳仪的配制，5ml分离胶，2ml浓缩胶，跑正常分子量的蛋白是没有问题的。
但是跑小分子蛋白，浓缩胶的长度要再长一些，最起码要保证三分之一浓缩胶，三分之二的分离胶，浓缩胶多，可以保证不同分子量的蛋白充分压缩到同一起跑线。
b) 电泳时间：浓缩胶80V，300mA 50min,分离胶120V，300mA1h10min，分离胶时间不建议太长，只要把marker跑开，能够区分开内参和小分子蛋白就好了。
我的习惯是电泳的全程也会把机器放到冰水混合物中，防止温度过高，蛋白弥散。
c) 蛋白上样量：正常分子量蛋白30ug足够，可以建议小分子量蛋白先用二倍的量60ug试一下看看。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项 -回复
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。
西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。
本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。
一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。
如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。
2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。
在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。
通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。
3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。
通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。
进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。
二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。
样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。
为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。
2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。
正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。
3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。
实验总结-Western-blot
实验总结-Western-blotWestern BlotWestern Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达WB-蛋白提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（PMSF）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/l浓度为宜。
western原理和实验技术体会
Western的原理几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。
系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH 值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。
从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。
这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
western blotting技术心得
western blotting技术心得Westernblotting技术，又称西方印迹技术，一种很常用的蛋白质识别和定量方法，是将乳杆菌中的蛋白质从功能角度进行分离和分析的一种技术，它是利用介雷氏染料（Coomassie Brilliant Blue）和硫酸铵或电泳来获得蛋白质分子量和结构的一种技术。
Western blotting技术的实验方法包括以下几个步骤：1）收集样品：要求将样品的血清、非植物或植物细胞系统中的蛋白质收集到一定的浓度；2）蛋白质分离：将样品中的蛋白质分离为单一蛋白质或不同蛋白质；3）蛋白质检测：将收集的蛋白质进行检测，并通过Western blotting技术获得蛋白质的分子量和结构数据；4）结果分析：将获得的数据按照蛋白质的分子量和结构进行分析，以获得有关蛋白质的完整结构、功能和分子量的信息。
Western blotting技术的应用非常的广泛，主要用于蛋白质的鉴定、检测、代谢和定量研究以及纯化研究等，同时，它还可以用于病毒和细菌的识别，是遗传学分析的重要工具之一。
它的实验方法简单，结果准确，操作方便，可以通过比较质谱图来鉴定蛋白质。
Western blotting技术在蛋白质研究中起着重要作用，但是也有一些弊端，比如检测效率低，检测出的蛋白质信号不够清晰，以及操作过程比较复杂等。
因此，在使用Western blotting技术进行蛋白质定量研究的时候，需要谨慎，遵循一定的操作流程，以最大限度地保证实验结果的准确性和可靠性。
总而言之，Western blotting技术是一种有效而可靠的蛋白质识别和定量方法，在蛋白质研究中发挥着重要作用。
它的实验方法较为简单，但准确性和精度却不容忽视，因此在操作时应谨慎，以最大限度地保证实验数据的准确性和可靠性。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项西方博(Western blot) 是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质样品经过电泳分离并转移到膜上，再使用特异性抗体检测蛋白质的表达水平。
以下是西方博检测蛋白质表达实验的结论和注意事项。
结论：1. 蛋白质的分子量：西方博通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的精确分子量。
根据蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以使用特定的分子量标准品绘制标准曲线，并在曲线上确定待测蛋白质的分子量。
2. 蛋白质的表达水平：西方博使用特异性抗体来检测特定蛋白质的表达水平。
利用特异性抗体与目标蛋白质的特定区域结合，然后使用辅助抗体标记抗体，并通过光学或化学方法检测抗体标记物的表达水平。
比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平可以确定其相对表达量。
注意事项：1. 样品的提取和准备：蛋白质的准备和提取是西方博实验的首要步骤。
样品应该被充分破碎，并使用适当的提取缓冲液来维持蛋白质的稳定性。
注意，使用不同类型的组织或细胞时，提取条件和方法可能有所不同。
2. 蛋白质的电泳分离：西方博通常使用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来进行蛋白质的分离。
凝胶的浓度和隔离电泳条件应选择适当，以分离不同分子量的蛋白质。
3. 转膜：将电泳分离的蛋白质转移到膜上是西方博的关键步骤之一。
选用合适的膜（如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素膜），并选择适当的电泳缓冲液进行转膜。
确保蛋白质能够均匀地转移到膜上。
4. 抗体的选择和试验条件：特异性抗体的选择和充分优化是确保实验准确性的关键因素。
保证抗体的特异性和亲和性，并验证抗体的工作浓度。
此外，充分优化抗体和探针的试验条件，包括反应温度、时间和抗体浓度等。
5. 成像和分析：西方博实验完成后，使用适当的成像方法（如化学发光或荧光成像）检测抗体标记物的表达水平。
使用适当的成像系统记录图像，确保信号处于线性范围内。
使用图像分析软件进行定量分析，比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平。
我的western-blot实验经验总结
我的western-blot实验经验总结
Western-blot实验是一种常用的免疫学分析方法，用于检测蛋白质的存在、定量和分子量。
在进行这项实验时，需要经过以下几个步骤：
1. 样品制备：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其分离成不同的组分。
这可以通过各种方法来完成，例如细胞裂解、电泳分离等。
2. 凝胶制备：将分离的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳分离蛋白质，使其根据分子大小以不同的速度移动。
3. 转移：将凝胶中分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺或聚偏氟乙烯膜上，以便进行进一步的免疫学分析。
4. 免疫学反应：使用特定的抗体识别目标蛋白质，并进行免疫学检测。
这包括将蛋白质与一种或多种特定抗体反应，再使用荧光标记或酶标记的二抗进行检测。
5. 成像和数据分析：使用特定的成像方法，例如荧光显微镜或化学发光成像，来可视化免疫学反应结果。
然后进行数据分析，例如测量蛋白质的强度、定量分析等。
在进行Western-blot实验时，需要注意一些常见问题，例如蛋白质分离不完全、
抗体不充分、背景噪音等。
为了获得准确和可重复的结果，需要仔细控制实验条件、进行质量控制和标准化操作。
自己根据实验总结的Western blot
Western blot一、试剂配制1）细胞裂解液：用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。
2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。
PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。
pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。
4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。
5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。
6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。
注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。
8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。
9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。