108、临床PCR实验室常见问题及整改措施
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR核酸检测实验室自检自查整改报告
PCR核酸检测实验室自检自查整改报告一、整改背景我实验室负责进行PCR核酸检测工作，经过自检自查发现存在一些问题，不仅影响了工作效率，还可能对检测结果产生误差，为了保证检测结果的准确性和可靠性，我决定开展整改工作，并报告整改情况。
二、问题分析1.设备运行不稳定：实验室PCR仪器出现频繁故障，导致实验进度受阻，影响工作效率。
2.试剂保存不当：一部分试剂未按照要求储存，导致试剂失效或效果下降，影响了检测结果。
3.数据记录不完整：实验过程和结果记录不规范，缺乏关键信息的记录，影响了结果的追溯和分析。
4.实验室清洁和消毒不及时：仪器和试剂的清洁消毒不及时，可能造成交叉污染，影响结果的准确性。
三、整改措施1.设备运行不稳定问题的整改：（1）定期检查设备状态，及时发现问题并解决；（2）建立设备维护保养制度，确保设备运行稳定；（3）配备备用设备，确保实验进展不受阻。
2.试剂保存不当问题的整改：（1）制定试剂存储和使用规范，明确存储温度、有效期等要求；（2）建立试剂使用登记制度，及时更新试剂信息，避免使用失效试剂；（3）实行试剂定期盘点，清理不合格和失效试剂。
3.数据记录不完整问题的整改：（1）建立标准的实验记录表格，详细记录实验过程和结果；（2）明确记录项目、时间、操作人员等关键信息；（3）实行项目负责人审核制度，确保记录的准确性和可追溯性。
4.实验室清洁和消毒问题的整改：（1）制定实验室清洁消毒制度，明确清洁和消毒频率；（2）定期进行实验室清洁和消毒，清除交叉污染源；（3）培训实验人员正确进行仪器和试剂的清洁消毒。
四、整改效果评估经过整改措施的落实，以下是整改效果的评估：1.设备运行不稳定问题：设备故障率显著下降，实验工作进展顺利，工作效率明显提升。
2.试剂保存不当问题：试剂使用失效或下降的情况明显减少，检测结果更加可靠稳定。
3.数据记录不完整问题：实验记录规范化，关键信息完整记录，结果可追溯性明显增强。
4.实验室清洁和消毒问题：实验室清洁和消毒规范化，交叉污染风险得到控制。
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1、模板:含有抑制物，含量低2、Buffer对样品不合适3、引物设计不当或者发生降解4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2、更换Buffer或调整浓度3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4、降低退火温度、延长延伸时间问题二：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1、模板不纯2、Buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg 2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换Buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP和镁离子的浓度6、减少循环次数问题四：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存[ 来源]：实验室之家，以及相关网络知识、转载仅为分享知识，如有侵权请联系删除。
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PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法检验科人员是核酸检测工作的主力军，我们不但要保证检测结果的有效性，还时刻面临着被感染的风险。
本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。
1、传染源目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。
无症状感染者也可能成为传染源。
2、传播途径经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径。
在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。
由于在粪便及尿中可分离到新型冠状病毒，应注意粪便及尿对环境污染造成气溶胶或接触传播。
3、荧光PCR原理重复进行“变性 - 退火 - 延伸”三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。
4、常见问题解析①新冠试剂出现翘尾，怎么处理？答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。
如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。
设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
③新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。
PCR检测常见问题与解决途径
P C R检测常见问题与解决途径------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxxPCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
PCR实验室存在问题及解决措施
8
临床应用基本规范和管理要求
➢ 以科研为目的的临床基因扩增检验项目，不得向临床出具检验报 告，不得向病人收取任何费用
9
检测要求
➢ 项目：新开展检测项目应有相应临床科室出具的评估报告 ➢ 仪器：必须三证齐全 ➢ 试剂：必须SFDA批准 ➢ 新开展项目在技术审核前应进行方法学验证 ➢ 仪器、试剂、方法更新时应进行方法学验证
1、校准SOP中制定仪器校
2、部分仪器未定期校准
准参数、判断标准
2、实验室检测人员提出校
3、校准未覆盖检测常用量程（移液器、恒温金属浴） 准要求
4、校准报告不规范，缺原始记录
3、实验室审核校准报告
5、校准报告中校准数据错误未发现 6、校准不符合要求的设备仍在使用（移液器、高速
冷冻离心机） 7、未引用校准出现的校准因子（、温度计、恒温金
属浴） 8、内部校准存在问题：用于校准恒温金属浴的温度
计未校准；且最小刻度为1℃，不适用于金属浴 校准；内部比对（温度计）无记录或记录信息不
4、内部比对记录信息最少 应包括：比对设备编号、 用于比对设备的校准信息 （校准日期、校准有效期、 校准单位）、比对时间、 标准设备实测数据、比对 设备实测数据、判断标准、 结论、比对人、比对日期、 科室负责人
究和使用情况的检索报告及技术资料
14
PCR审核
流程（初审、
复审、扩项、 新技术）
医疗机构提出技术审核申请 申请资料审查
受理、登记、编号 发出《技术审核受理通知书》
文件内容审查 确定审核专家组成员 书面通知专家、医疗机构 组织专家现场审核 汇总专家组审核意见 医疗机构就专家意见整改 完成技术审核结论报告
临床PCR检测中常见问题及分析
设置不当导致的假 阳性曲线
设置不当导致的假 阴性曲线
不正常扩增曲线的分析探讨 • 阈值设置 析改动 常见经常设定为自动,个别时候需要人为分
设置不当导致的假 阳性曲线 设置不当导致的假 阴性曲线
科华核酸诊断试剂产品
核酸种类 试剂盒产品名称
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 （PCR-荧光探针法） 沙眼衣原体核酸检测试剂盒 （PCR-荧光探针法）
• 标本处理：柱抽提方法提取标本中病原体 RNA 加入裂解液释放核酸——介质吸附核酸——过滤洗涤——核酸洗脱
•
二氧化硅吸附核酸，以负压纯化柱方式实现核酸纯化，以半自动操作代替手工操作，极 大地降低了实验操作的技巧要求，受人工操作影响显著减少，检测速度快、结果重复性 好
二氧化硅膜 吸附核酸 手工：
离心法
核酸定量检测：通过工作 标准品生成的标准曲线， 获得待测标本的初始核酸 模板浓度
实时荧光定量PCR产物的检测和结果分析
Ct （Cp）值是实时荧光PCR的主要定量参 数和定性判断参数 不同核酸含量的样本检测得到的Ct（Cp） 值不同，Ct值越小表明模板浓度越高
仪器自带软件分析定量检测结果
不正常扩增曲线的分析探讨 • 基线设置 分析改动 常见设定为3-10 循环,个别时候需要人为
注册号
国食药监械(准)字2008第 3400932号 国食药监械(准)字2009第 3400912号 国食药监械(准)字2009第 3400914号 国食药监械(准)字2009第 3400913号 国食药监械(准)字2011第 3400113号 国食药监械(准)字2009第 3400677号 国食药监械(准)字2010第 3400117号 国食药监械(准)字2012第 3400079号
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
PCR实验中常见问题解决方法
QuikStrip 已变干。
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。
3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物
凝胶未正确制备。
确保正确稀释电泳缓冲液。
融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液 没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。
凝胶未正确染色。
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。
电泳装置或电源出现故障。
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障
4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。
凝胶没有染色足够长的时间。
严格按照染色流程说明进行实验操作。
5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。
PCR扩增不成功。
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。
PCR实验中常见问题解决方法
PCR实验中常见问题及解决方案
PCR实验中常见问题汇总
问题，管中的液体较少。
样品挥发，损失
确保加热的盖子达到适当的温度。
吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。
移液不准确
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。
确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。
6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度
pcr实验室整体解决方案及措施
pcr实验室整体解决方案及措施一、PCR实验室的布局。
1.1 功能分区的重要性。
PCR实验室啊，就像一个精密的小世界，功能分区那可是相当重要的。
它得有试剂准备区，这就好比是厨房的食材准备区，得干干净净、整整齐齐的。
在这里，我们要准备好各种试剂，容不得一点马虎。
要是这里乱了套，就像做饭没有好食材一样，后面的实验肯定会出问题。
1.2 样本制备区的讲究。
样本制备区呢，这可是关键中的关键。
这就像厨师切菜、处理食材的地方。
在这个区域，要小心地处理样本，避免样本之间的交叉污染。
这就如同做菜的时候，不能把不同的菜弄混了，不然做出来的菜就不是那个味儿了，实验结果也会变得乱七八糟。
1.3 扩增区和检测区的要求。
扩增区和检测区也是各有各的门道。
扩增区像是一个魔法区域，把样本中的微量核酸进行大量扩增，就像把一颗小种子培育成一片大森林。
检测区呢，就是要精准地判断这些扩增后的产物，要做到火眼金睛，不能有丝毫差错，就像孙悟空识别妖怪一样。
二、设备的选择与维护。
2.1 主要设备的挑选。
PCR实验室的设备挑选可不能含糊。
像PCR仪，这就是实验室的“顶梁柱”，得选质量好、性能稳定的。
这就好比打仗要选好武器一样，好的PCR仪能让实验事半功倍。
还有离心机，那得是转速精准、运行平稳的，不然样本离心不好，后续的实验就没法好好进行，这就叫“一着不慎，满盘皆输”。
2.2 设备维护的要点。
设备维护更是重中之重。
要像照顾自己的孩子一样照顾这些设备。
定期清洁、校准是必不可少的。
要是忽略了设备维护，设备就会像生病的人一样，工作起来没精打采，给出的实验结果也不可靠。
这就如同开一辆没有保养的汽车，随时可能抛锚。
三、人员管理与操作规范。
3.1 人员培训的必要性。
人员管理首先得从培训开始。
实验室的人员就像一群战士，没有经过训练怎么能上战场呢？培训要全面，从理论知识到实际操作，都得让大家熟练掌握。
只有这样，在实验室里才能做到游刃有余，而不是像没头的苍蝇一样到处乱撞。
临床PCR实验室质量管理及SOP存在的问题和改进
质量管理的发展历史
l 统计质理管理：最大的进步是，将“事后检 验”的观念改变为“预测质量事故的发生并事 先加以预防”的观念。 但其过分强调统计方法，忽视组织管理， 易使人误认为“质量管理就是统计方法”，数 理统计方法理论比较深奥，是“质量管理专家 的事情”，因而对质量管理产生了一种“高不 可攀、深不可测” 的感觉，继而“望而生 畏”。
我国临床PCR实验室质量管理的发展
l 1983年美国Cetus公司的Kary Mullis偶然得到了PCR的“概 念”，进而使其成为了可操作的成熟的实验系统。
l 1989年，PCR实际应用的瓶颈问题“耐热DNA聚合酶”解 决，分子时代到来。
l 1990年代PCR技术在我国临床实验室得到广泛应用，由于 不规范，出现了诸多问题。
l ISO9000《质量管理和质量保证》系列标准 ISO/IEC 15189-2007《医学实验室质量和能力的专用要 求》 ISO/IEC17025-2005 《检测和校准实验室的通用要求》
质量管理的发展历史
l 21世纪的质量管理：标准化+全面质量管理； 概念的集成化
“管理”的定义
●管理就是通过计划、组织、领导和控制，协调以人为中 心的组织资源与职能，以有效实现目标的社会活动。
实验室清洁
l ①没有规定具体的责任人。实验室的操作台面、地面和仪 器设备可能是由不同的人员负责，应明确责任人，并在实 际工作中，对有关责任人进行实验室管理方面的培训。
l ②清洁只是对实验室台面和地面，仪器设备要么只有加样 器、离心机等一到两种，要么根本就没有涉及。
l ③清洁操作步骤过于原则，不具体。如清毒剂的消毒没有 规定时间，清洁的各步骤之间没有连惯性，紫外照射没有 时间等。
l ④没有规定工作人员清洁时的工作流向。 l ⑤没有规定清洁各实验区域必须使用其专用的清洁用具。 l ⑥没有考虑有潜在生物传染危险性材料溅出时的消毒清
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施2022年5月29日中午12:30开始PCR实验室假阳性频率增高,考虑可能出现实验室污染，检测工作立即停止，首先，查找污染源和明确污染范围。
经排查本次实验室污染的主要来源可能是部分配置好的反应体系放置时间过久、实验室二区出现扩增产物的污染。
一、发生污染的原因分析。
1.核酸检测工作频次过高，导致每批样本检测之间没有足够时间消毒。
2、核酸检测人员短缺，检测人员需要多次往返二区、三区，极容易导致扩增产物的污染。
二、实验室污染的处理：1.生物安全柜的操作台消毒处理：使用5000mg∕L含氯消毒剂进行喷洒消毒。
消毒液需要现用现配，24小时内使用。
2.实验室台面、地面、物体表面等的消毒处理：立即使用润湿有5000mg∕L含氯消毒剂的毛巾擦拭、消毒。
清洁、消毒通风系统滤网。
采用房间固定和可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。
3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
整改措施：1.严格实验室功能分区确保实验室人、物及空气单向流动核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区一样本制备区T扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。
空气流向应按照从试剂储存和准备区一样本制备区一扩增区一扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
2、力口强实验室检测安全管理(1)基本要求核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩和隔离衣等。
开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。
(2)实验室前安全要求应使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精进行桌面、台面及地面消毒。
消毒液需每天新鲜配制，不超过24小时。
转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。
转运桶开启后，使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精对转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。
实验室存在问题及整改措施有哪些
实验室存在问题及整改措施有哪些实验室是进行科学研究、技术开发和教学实验的重要场所，是推动科学技术进步的重要力量。
然而，近年来，我国实验室存在一些问题，影响了实验室的正常运行和科研成果的产出。
本文将对实验室存在的问题进行分析，并提出相应的整改措施。
一、实验室存在的问题1. 安全问题实验室安全是实验室管理的重中之重，但目前我国实验室安全问题仍然较为突出。
部分实验室安全设施不完善，如消防器材不足、紧急疏散通道不畅等；实验室安全教育不到位，部分实验人员安全意识不强，违规操作现象时有发生；实验室废弃物处理不当，容易造成环境污染。
2. 管理问题实验室管理是保障实验室正常运行的关键，但目前我国实验室管理存在一定的不足。
实验室规章制度不健全，导致实验室管理混乱；实验室人员配备不合理，部分实验室缺少专业管理人员；实验室设备维护不及时，影响实验设备的正常使用。
3. 科研问题实验室是科研工作的重要场所，但目前我国实验室在科研方面也存在一些问题。
实验室研究方向不明确，导致科研资源浪费；实验室科研团队建设不足，缺乏高效的协作机制；实验室与产业界的联系不紧密，科研成果转化率较低。
4. 人才问题实验室是培养人才的重要基地，但目前我国实验室在人才建设方面也存在一定的问题。
实验室师资力量不足，部分实验教师待遇较低，影响其工作积极性；实验室人才培养体系不完善，实验技术人才短缺；实验室人才流动性强，难以形成稳定的科研团队。
二、整改措施1. 加强实验室安全管理（1）完善实验室安全设施，确保实验室安全防护措施到位；（2）加强实验室安全教育，提高实验人员的安全意识；（3）建立健全实验室废弃物处理制度，加强环保意识。
2. 优化实验室管理（1）建立健全实验室规章制度，加强实验室管理；（2）合理配置实验室人员，提高实验室管理水平；（3）加强实验室设备维护，确保实验设备正常运行。
3. 提升实验室科研能力（1）明确实验室研究方向，优化科研资源配置；（2）加强实验室团队建设，提高协作效率；（3）加强实验室与产业界的联系，提高科研成果转化率。
PCR常见问题及解决方案
PCR常见问题及解决方案问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备;基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度,特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物,避免二级结构;优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装,-20℃保存,避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存,小量分装,避免反复冻融酶纯度低,扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间;对高GC或复杂结构模板,提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度,应比引物Tm低至少5℃ 延伸时间不足增加延伸时间,特别是针对长片段PCR 循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌,否则应先高温高压灭菌处理;用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多,引物二聚体拖尾严重体系污染设计对照实验寻找污染源,操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量,以0.5 U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间,以1 min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南);使用PCR增强剂其他HotStart PCRTouchDown PCR巢式PCR引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量,以0.5 U间隔递减;更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度,以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数,以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验,消除污染源其他HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照,确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染,去除污染源。
pcr技术审核中存在的问题和解决措施方案
实施效果评估结果与分析
结果
经过实施标准化操作流程、加强人员培训、建立质量管理体系等措施，PCR技 术审核的准确率和效率得到了显著提高，成本效益比也得到了有效控制。
分析
这些结果表明实施方案是有效的，可以解决PCR技术审核中存在的问题，提高 审核质量和效率，降低成本，为实验室带来积极的影响。
THANKS
对实验人员进行PCR技术的全面 培训，包括理论知识和实践操作 ，确保实验人员具备必要的技能
和知识。
培训应包括实验安全、实验设备 使用、实验试剂使用、实验操作
步骤等方面的内容。
对实验人员进行定期的考核和评 估，以确保其技能和知识水平符
合要求。
建立标准化操作规范
建立PCR技术的标准化操作规范 ，包括实验操作流程、实验试剂 、实验设备、实验数据处理等方
针对不同的实验目的和需求，制定个性化的引物设计方案，以适应不同的样本类型、扩增效率和特异 性要求。
加强引物质量评估与筛选
对所有用于pcr的引物进行质量评估 ，包括引物特异性、扩增效率、引物 二聚体等，确保其质量和性能符合实 验要求。
VS
建立引物筛选标准，对多条引物进行 比较和筛选，选择最合适的引物用于 pcr实验。
引物设计不合理
总结词
引物是PCR实验的关键因素之一，其设计合理性直接影响到PCR的特异性和扩 增效率。如果引物设计不合理，可能导致非特异性产物的扩增或无法成功扩增 目标片段。
详细描述
引物设计不合理可能包括引物长度不合适、引物序列互补性过高、引物之间形 成二聚体、引物与非目标序列的互补性过高等问题。这些问题可能导致实验结 果出现偏差或失败，需要进行引物优化和重新设计。
反应条件不一致
总结词
实验室存在问题及改进措施
实验室存在问题及改进措施实验室是进行科学研究、教学实验、技术开发和产品质量检测的重要场所，对于提高人才培养质量、促进科技进步和经济发展具有重要作用。
然而，在实际运行过程中，实验室存在一些问题，需要我们认真分析并采取相应的改进措施。
一、实验室存在问题1. 安全意识不强实验室安全管理是实验室工作的重中之重，但由于部分实验室人员安全意识不强，对实验室安全管理工作重视不够，导致实验室安全事故时有发生。
例如，实验室废弃物处理不当、实验仪器设备维护不及时、实验操作不规范等，都可能引发安全事故。
2. 实验设备不足且老化实验室设备是开展实验工作的重要物质基础，但目前许多实验室设备数量不足，难以满足实验教学和科研需求。
此外，部分设备老化严重，性能不稳定，影响实验结果的准确性。
3. 实验教学资源整合不足实验室教学资源包括实验教材、实验项目、实验师资等，目前存在整合不足的问题。
实验教材内容陈旧，实验项目设置单一，实验师资队伍不稳定，这些问题影响了实验教学的质量。
4. 科研与实验教学脱节在一些高校和研究机构，科研与实验教学存在脱节现象。
科研成果未能有效转化为实验教学内容，实验教学内容与实际科研需求不符，导致学生实践能力不足。
5. 实验室管理水平不高实验室管理水平直接关系到实验室运行效率和实验教学质量。
目前，部分实验室管理水平不高，表现在实验室管理制度不健全、实验室队伍建设不足、实验室经费投入不足等方面。
二、实验室改进措施1. 加强实验室安全管理（1）建立健全实验室安全管理制度，明确实验室安全责任人。
（2）加强实验室安全培训，提高实验室人员安全意识。
（3）定期检查实验室设备，确保设备安全性能良好。
（4）规范实验室废弃物处理，防止环境污染。
2. 增加实验设备投入（1）加大财政支持力度，购买新型实验设备。
（2）优化实验设备配置，满足不同实验室需求。
（3）定期更新实验设备，提高设备性能。
3. 优化实验教学资源（1）修订实验教材，更新实验项目，提高实验教学内容的时代性。
PCR实验室常见问题及经验分享
PCR实验室常见问题及经验分享一、没有ct值二、ct值过晚三、阴性对照扩增有信号四、标准曲线不佳五、熔解曲线峰不特异六、扩增曲线异常七、扩增效率低聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
一、没有ct值检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;3、引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
二、ct值过晚在相对定量中,Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。
引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计;2、PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;4、PCR产物太长。
PCR产物设计超过500bp;5、模板存在抑制物。
用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
PCR实验室防污染措施及应急处理方法
PCR实验室防污染措施及应急处理方法PCR（聚合酶链式反应）实验室是进行核酸扩增实验的关键场所，为了保证实验结果的准确性和可靠性，需要采取一系列的防污染措施以及应急处理方法。
一、实验室防污染措施：1.实验室空间划分：将实验室分成不同区域，包括扩增前处理区、样本DNA提取区、嵌合反应区和扩增产物分析区。
各个区域应设立合适的物理屏障，防止交叉污染。
2.空气处理系统：实验室内应安装高效过滤器和通风系统，确保室内空气质量良好。
减少空气中的DNA和RNA等污染源。
3.无菌操作：在PCR实验室中进行工作时，必须采取无菌操作技术，包括穿戴无菌手套和口罩，避免颗粒、细菌和真菌的污染。
4.设立正常控制组和负空白对照组：对于每个PCR实验批次，应设置正常的样本对照组和无模板反应的负空白对照组，以确保扩增产物的准确性和特异性。
5.实验室设备清洁与消毒：定期对PCR仪、离心机、移液器等实验设备进行清洁和消毒，以减少交叉污染的发生。
6.样本处理区和实验重叠区分离：为了避免扩增前杂交污染，应将样本处理区和实验重叠区分隔开，分别使用不同的工作区域和实验仪器。
二、应急处理方法：1.污染样品的处理：一旦检测到污染样品，应立即停止实验，并将污染的试管和其他实验材料放入注射器中，用10％次氯酸钠溶液彻底清洗。
污染的工作台、仪器等表面也要进行消毒处理。
2. 扩增产物污染的处理：若扩增产物遭受到外源DNA污染，可使用外源DNA降解酶如DNase或Exonuclease I降解外源DNA。
然后，用新的试剂和陶瓷粉、洗涤缓冲液等彻底清洁实验器具。
3.实时监测和紧急停电措施：对PCR实验过程中的机器、电脑和监测设备等进行定期检查，确保正常工作。
同时，应安置备用电源设备，一旦停电时能立即启动备用电源，保证实验的连续性。
4.废液处理：将PCR废液最好两次分离处理，首先将其放入安全密闭的容器中，然后经过高温或化学处理，彻底灭活。
总之，PCR实验室的防污染措施与应急处理方法的实施对于保障实验结果的准确性和可靠性至关重要。
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概况
上海市临床检验中心制定了 《上海市医疗机构临床实验室质量管理基本内容和要求》（附录E） 《上海市医院临床检验专业质控督察表（分子生物学专业）》
2011年起每年年底根据上述要求进行上海地区PCR实验室全覆盖督查
实验室设置
督察内容
检查方法
按照《医疗机构临 床基因扩增检验实 验室管理办法》和 《基因芯片诊断技 术管理规范（试 行）》相关要求执 行
（五）卫生部规定的其他需要特殊管理的医疗技术
概况
《上海市卫生局<关于指定上海市临床检验中心作为本市医疗技术临床 应用能力技术审核机构的通知>》（沪卫医政[2011]090号） 《上海市临床检验中心关于印发<上海市医疗机构临床基因扩增检验技 术审核办法>和<上海市医疗机构基因芯片诊断技术审核办法>的通知>》 （沪临检办[2011]29号） 2014年中心自行开发了分子诊断技术临床应用管理专栏，其中包括审 核申请、审核查询、公共查询、政策法规等栏目。（） 《国务院关于第一批取消62项中央指定地方实施行政审批事项的决定》 （国发〔2015〕57号） 截止至2015年11月，目前通过审核的实验室有104家。
医疗技术临床应用管理办法
（分类分级管理、审核）
第一类：安全性、有效性确切，医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其 安全性、有效性的技术—医疗机构自行组织实施
第二类：安全性、有效性确切，涉及一定伦理问题或者风险较高，卫生行政部
门应当加以控制管理的医疗技术—省级卫生行政部门指定或者组建的技术机
构负责技术审核
照等方式电子版保留)
人员资质
督察内容
检查方法
存在问题
整改措施
实验室至少应有2 名具有临床基因扩 增检验技术上岗证 的本单位在职技术 人员。开展遗传性 疾病或基于组织、 细胞等分子病理并 出具诊断报告的实 验室，至少应有1 名具备出具相关诊 断报告资质的本单 位在职医师。
检查检测人员的相 关资质、PCR上岗 证等。
临床基因扩增检验技术；
第三类：具有下列情形之一，需要卫生行政部门加以严格控制管理的医疗技术—卫生
部或卫生部委托省级卫生行政组织负责对指定的第三类医疗技术进行审核
（一）涉及重大伦理问题
（二）高风险
（三）安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进一步验证
基因芯片诊断技术
（四）需要使用稀缺资源
（2011.5.3调整为二类）
临床PCR实验室常见问题及整改措施
回顾
1990年：PCR 技术在国内开始用于临床检测 90年代中期：假阳性？（假阴性？） 《关于暂停临床基因扩增检验的通知》（卫医政发[1998]第9号） 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号） 《医疗技术临床应用管理办法》的通知（卫医政〔2009〕18号） 《临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号）
床基因扩增检验
技术上岗证书复
印件；培训、能
力评审等资料，
并定期更新。
督察内容
人员培训与评估
检查方法 存在问题
整改措施
临床实验室负责人 应组织实验室人员 进行业务学习和培 训，有相应的学习 培训制度、计划和 记录，并定期（每 12个月至少一次） 对学习培训效果进 行评估。
检查PCR相关 人员培训记 录，培训效 果进行评估 的记录。
人员管理
督察内容
检查方法
存在问题
整改措施
应建立全部人员 PCR人员档案记 相关的教育背景、录 专业资格、培训、 经历及能力记录 档案。
1.实验室技术人员 实验室应分册建
档案内容过于简单： 立技术人员技术
只有学历、职称、 档案，档案至少
PCR上岗证书复印件，应包括以下内容：
其余缺
学历、职称、临
2.未及时更新
1.未取得上岗证的 人员独立操作，主 观认为只要不在报 告上出现名字就可 以；
2.病人报告单上的 检测人员和审核人 员与实际不一致；
3.试剂公司人员参 与检测。
1.及时参加培训取 得上岗证；
2.规定报告审核操 作规程。
人员资质
督察内容
新进人员应有 岗前培训
检查方法 存在问题
整改措施
检查新进人 员培训记录
实验室应有适合自身实际情况又 符合现行规章制度的记录管理制 度及记录表格
记录不全\潦草\ 记录应完整，修改应采用杠改；
涂改\不真实
记录应真实可追溯
仪器坏，数据丢 原始数据应定期备份（不同电脑） 失
无仪器打印结果 无仪器打印结果的检验项目记录 的检验项目缺原 信息至少应包括检测项目、试剂 始记录或记录不 品牌、批号、有效期、标本唯一 全（例杂交项目 编号、检测结果、检测者、检测 记录保存有缺陷） 日期（例杂交建议采用扫描、拍
根据使用技术的要求 相应增加区域
试剂分装应在试剂准 备区操作 II区安装冲眼器并保 证正常使用状态
每个实验区配备移动 紫外车并保证正常使 用状态
文件和记录管理
督察内容
检查方法
原始记录和质 检查原始记 量记录应完整、 录和质量记 清晰，至少保 录。 存2年。
存在问题
整改措施
记录表格设计不 适用（或简单或 复杂）
1.缺相应的制度
2.以为取得PCR上岗 证就可以
3.初审实验室大多数 缺员工是否能胜任其 岗位的记录
1.实验室应制定员工能力评 审的内容和方法（新进、转 岗）。
2.定期评审员工的工作能力， 并保存胜任的证据：直接观 察常规工作过程和程序、直 接观察设备维护和功能检查、 监控检验结果的记录和报告 过程、核查工作记录、评估 解决问题的技能、检验特定 样品。
实验室分区 设置应符合 检测方法要 求
存在问题
各缓冲间相通，实际使用 和验收时不一致
未根据项目相应增加IV区 （例采用杂交法开展HPV 分型项目）
试剂准备区形同虚设（无 移液器等） 未安装冲眼器或不能正常 出水 移动紫外车缺或已坏未及 时更换
整改措施
1.实验时随手关门 2.缓冲间相同的实验 室应封锁通道
1.缺培训计划、或 记录
1.计划制定应有针对性， 每年有重点 2.培训形式可以多样：讲 座（包括小组教学）、计 算机相关的练习、自学、 观看示例- 现场或视频、 实践监督、实践结果的自 我评估、特殊样品的检验 或鉴定 3.效果评估形式：口头提 问、笔试、现场操作演示、 获取合格证、填写培训小 结等