枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案复习过程

枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案

实验原理：

枫叶中的色素，当叶子中所含的叶绿素占主导地位时，绿色就

为主色调，抑制了其他色素展现本来面目。入秋后，气温逐渐下降，叶绿素的合成速度受阻，破坏却与日俱增，到后来叶片中只剩下花

青素、类胡萝卜等色素，于是它们便有机会尽情展现自己的如花娇颜。另外，随着秋季不断降温，尤其是霜降之后，为适应即将到来

的寒冷气候，叶肉内积累了较多的糖分，这些糖分经过复杂的反应，形成了花青素，也由此形成了秋叶变红的重要基础

花青素：花青素是具有2-苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物，

广泛存在于植物中的水溶性天然色素。花青素在自然状态下常与各

种单糖形成糖苷，称为花色苷。溶液PH不同，花色苷的存在形式也

不同。对于一个给定的PH值，在花色苷的4种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式（脱水）碱，红色的花烊正离子，无色的甲醇假碱和查

尔酮。花色苷在PH值很低时，其溶液呈现最强的红色。随着PH值

的增大，花色苷的颜色将褪至无色，最后在高PH值时变成紫色或蓝色。PH示差法测定花色苷含量的依据是花色苷发色团的结构转换是PH的函数，起干扰作用的褐色降解物的特性不随PH变化。因此在

花青素最大吸收波长下确定两个对花青苷吸光度差别最大但是对花

色苷稳定的PH值。

根据Fuleki T经验公式

花青素含量（mg/100g)=△TO.D/(avE%1cm ×W ×10);

△TO.D=△A×DV×VF; △A=A(pH1.0)-A(pH4.5).

其中：DV-----稀释体积；VF-----稀释倍数；W------样品重量；A-

----总吸光值；avE%1cm------平均消光系数代入数值计算：

叶绿素 a.b:叶绿素是由叶绿酸、叶绿醉和甲醇组成的二醇酷，是四毗咯衍生物，

其中的叶琳环是处于二氢形式，中心的金属原子为镁。蔬菜中的叶

绿素有叶绿素a和叶绿素b两类。叶绿素在植物细胞中与蛋白质结

合成叶绿素蛋白

质，由多种叶绿素蛋白复合物构成叶绿体，当细胞死亡之后，叶绿

素就游离出来。叶绿素是一种不稳定的物质.不耐光、热、酸、

不溶于水，易溶于碱、乙醉与乙醚，在碱性溶液中，皂化为叶绿素

碱盐。

叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式:

D663=82.04Ca +9.27Cb

D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位：

g/mL）

叶绿素a的浓度：Ca= 12.72D663 – 2.59D645

叶绿素b的浓度：Cb= 22.88D645 – 4.68 D663

总叶绿素的浓度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位：mg/L）

材料与用品：枫叶提取液，乙醇95%（AR），盐酸仪器：PHs-3B

型酸度计，紫外分光光度计丙酮、石英砂、碳酸钙分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管

实验步骤：

1.花青素测定：

1，将花青素取液稀释至一定的体积，用稀氢氧化钠和稀盐酸调节PH，观察提取液在不同PH下的颜色变化。对提取液进行200~800nm

全波长扫描，绘制光谱图

取枫叶花青素提取液用5%HCL-EtOH（15:85）溶液稀释至一定

体积，进行光谱扫描，确定最大吸收波长。紫外可见吸收光谱

3.PH示差法中PH的选择

在选定PH时应考虑以下因素：在此两个PH处测定的花青素的

吸收值差异应是最显著的；单一PH的轻微变动，对花青素吸光值的

影响是极小的；花青素在所处的两个PH下，应是相当稳定的。由于

花青素只有在酸性介质中是稳定的，因此只测定PH小于7条件下花

青素吸光值的变化。PH为1.0时，花青素以红色的2-苯基苯并吡喃

的形式存在PH为4.5时，花青素以无色的甲醇假碱的形式存在。因

此选择PH为1.0和4.5。

4.平衡时间的确定

因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式在某一PH下处于动态平衡，当PH改变时，动态平衡发生转移，总的趋势是PH降低时，平衡向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动；PH升高时平衡向蓝色醌式移动。一定时间后达到一个新的平衡。因此提取液用缓冲液稀释后，必须静置一段时间，等动态平衡处于稳定后，才能测定吸光值。

花青素在缓冲液中的吸光度值与时间的变化关系（λ= nm）

结果表明，花青素在缓冲液中的吸光度值随时间变化，在

PH1.0( )基本稳定，在PH4.5时( )基本稳定。

所以综合考虑，选择平衡时间为

5.火棘果花青素含量的测定移取浓缩液2ml，用5%HCL-EtOH稀释、定容至100ml，分别移取10ml，用PH1.0和PH4.5的缓冲液稀释至100ml，平衡（）min，在波长处测定吸光值。

根据Fuleki T经验公式

花青素含量（mg/100g)=△TO.D/(avE%1cm ×W ×10);

△TO.D=△A×DV×VF; △A=A(pH1.0)-A(pH4.5).

2.叶绿素a.b测定：

称1.25g叶用丙酮研磨

↓

匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）

↓

滤液用80%丙酮定容至25mL

↓

适当稀释后测A645、A663

1 取样：称取1.25g剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。

2 研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许（约0.002g）CaCO

3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止

3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。

3 读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述2个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。

结果计算：

根据Fuleki T经验公式

（1）花青素含量（mg/100g)=△TO.D/(avE%1cm ×W ×10);

△TO.D=△A×DV×VF; △A=A(pH1.0)-A(pH4.5).

其中：DV-----稀释体积；VF-----稀释倍数；W------样品重量；A-----总吸光值；avE%1cm------平均消光系数代入数值计算：