传代细胞培养分析
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
传代细胞培养
一、目的要求
掌握动物细胞培养的基本原理。 掌握动物细胞传代培养的技术方法。
二、基本原理
细胞培养(cell culture) :即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞， 放在类似于体内的体外环境中生存， 使其不断生长、繁殖或传代，借以观 察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现 象。
可分为原代和传代培养两种方式。
缺点： （1）来源受限。
（2）成分复杂，影响对某些实验产物的提取和 实验结果的分析。
（3）易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、 RPMI-1640、 DMEM等。
主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机 盐和其它一些辅助物质。
实验中所用溶液的配制：
D-Hanks工作液试剂配方
氯化钠 8g 磷酸氢二钠（Na2HPO4 ·12H2O） 0.132g 氯化钾 0.4g NaHCO3 0.35g D-葡萄糖 1g
0.1% 酚红液 1ml
三蒸水 800ml ，溶解后定容到1000ml。
113 ℃灭菌15min。
消化液：胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－ hanks配置。 常用的浓度是0.25％ 。PH7.4 用滤器过滤除菌。
中止消化、吹散细胞
4．分瓶扩大培养。每瓶再补加2.0毫升培养液， 混匀细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养。
分瓶培养
37℃、5％CO2培养
5．观察。细胞培养24小时后，即可进行观 察，观察的重点如下： ⑴ 首先要观察培养细胞是否污染。主要观 察培养液颜色的变化及浑浊度。 ⑵ 观察培养液颜色变化及细胞是否生长。 ⑶ 如细胞已生长，则要观察细胞的形态特 征并判断其所处的生长阶段。 ⑷ 观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行 染色。以确定死、活细胞的比例。
培养基：1640培养基（含10%小牛血清）
四、实验步骤
1．生长良好的原代细胞，一般经过3-5天左右可 形成致密单层。
2．倒去原瓶内培养液。
3．消化。向培养瓶内加入0.25%的2ml胰 蛋白酶消化液浸泡细胞，2分钟后倒去多余 消化液，剩余的酶液继续作用。(也可以直 接消化作用6min左右）。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本 低
缺点：只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生 长。使用时还要添加一定比例的天然培养基。例 如血清。
一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多 数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长 一般需加 10％血清。
CO2培养箱设定的条件为37 ℃, 5％ CO2 。
在倒置显微镜下观察细胞消化变化，当观 察到大部分细胞出现胞质回缩、细胞变成 圆球形、细胞间隙增大现象时需终止消化。
消化数分钟
细胞基本皱缩变圆， 此时细胞可吹打下
4.终止消化：加培养液3-4ml，即可终止消 化E作用。
用吸管有序地吹打瓶壁细胞（从瓶底到瓶 口，从瓶的一侧到另一侧，注意吹打边角 细胞）。打匀后分装。
消毒
细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、 真菌和病毒等微生物的污染
常见原因：
操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 严格遵守操作常规，防止发生污染
2、 293T细胞
293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮 细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时 表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点 与启动子区的质粒可以复制。
使用时注意：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶 盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
③箱内加灭菌蒸馏水于槽中以保持箱内湿度， 避兔培养液蒸发。
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
常用玻璃器皿清洗
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质 都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24 小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃ 烘干
培养基。 实验材料
1、培养细胞生长的条件
➢ 细胞的营养需要 ➢ 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 ➢ 无毒 ➢ 无污染
培养基
天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液
优点：营养成分丰富，培养效果好
血清的成分
血清中含有： ①多种蛋白质（球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
培养
动物细胞原代培 养过程图
细
原代培 养期
为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长 至第一次传代的时期。
胞
系
的
传代期
生
长
原代培养的细胞生长一定时间之后，贴附型 细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，便 应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的
培养器皿中，即传代，此即成细胞系。
过
程
衰退期
一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍 然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，
五、作业
1、简述动物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞传代培养的注意事项？
知识简介：
贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。大部分二倍体 动物细胞。
悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见 于各种造血系统肿瘤细胞
原代培养
从体内取出细胞接种培养到第一次传代的 阶段，叫原代培养。
方法：无菌操作取出组织（或器官）
酶消化处理 分散成单个细胞 使其不断地生长和繁殖。
进而细胞发生衰退死亡。
传代细胞培养
原代培养的细胞在瓶壁相互汇合后，需要 将其分开至多个新的培养瓶，叫传代。
否则因为接触抑制和密度抑制现象，引起 细胞衰老，停止生长甚至死亡。
三、实验材料
用具器材： 移液枪，枪头、细胞培养瓶、倒置显微镜、
酒精灯、液体储存瓶、试管架等。 实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640
一、目的要求
掌握动物细胞培养的基本原理。 掌握动物细胞传代培养的技术方法。
二、基本原理
细胞培养(cell culture) :即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞， 放在类似于体内的体外环境中生存， 使其不断生长、繁殖或传代，借以观 察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现 象。
可分为原代和传代培养两种方式。
缺点： （1）来源受限。
（2）成分复杂，影响对某些实验产物的提取和 实验结果的分析。
（3）易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、 RPMI-1640、 DMEM等。
主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机 盐和其它一些辅助物质。
实验中所用溶液的配制：
D-Hanks工作液试剂配方
氯化钠 8g 磷酸氢二钠（Na2HPO4 ·12H2O） 0.132g 氯化钾 0.4g NaHCO3 0.35g D-葡萄糖 1g
0.1% 酚红液 1ml
三蒸水 800ml ，溶解后定容到1000ml。
113 ℃灭菌15min。
消化液：胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－ hanks配置。 常用的浓度是0.25％ 。PH7.4 用滤器过滤除菌。
中止消化、吹散细胞
4．分瓶扩大培养。每瓶再补加2.0毫升培养液， 混匀细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养。
分瓶培养
37℃、5％CO2培养
5．观察。细胞培养24小时后，即可进行观 察，观察的重点如下： ⑴ 首先要观察培养细胞是否污染。主要观 察培养液颜色的变化及浑浊度。 ⑵ 观察培养液颜色变化及细胞是否生长。 ⑶ 如细胞已生长，则要观察细胞的形态特 征并判断其所处的生长阶段。 ⑷ 观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行 染色。以确定死、活细胞的比例。
培养基：1640培养基（含10%小牛血清）
四、实验步骤
1．生长良好的原代细胞，一般经过3-5天左右可 形成致密单层。
2．倒去原瓶内培养液。
3．消化。向培养瓶内加入0.25%的2ml胰 蛋白酶消化液浸泡细胞，2分钟后倒去多余 消化液，剩余的酶液继续作用。(也可以直 接消化作用6min左右）。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本 低
缺点：只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生 长。使用时还要添加一定比例的天然培养基。例 如血清。
一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多 数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长 一般需加 10％血清。
CO2培养箱设定的条件为37 ℃, 5％ CO2 。
在倒置显微镜下观察细胞消化变化，当观 察到大部分细胞出现胞质回缩、细胞变成 圆球形、细胞间隙增大现象时需终止消化。
消化数分钟
细胞基本皱缩变圆， 此时细胞可吹打下
4.终止消化：加培养液3-4ml，即可终止消 化E作用。
用吸管有序地吹打瓶壁细胞（从瓶底到瓶 口，从瓶的一侧到另一侧，注意吹打边角 细胞）。打匀后分装。
消毒
细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、 真菌和病毒等微生物的污染
常见原因：
操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 严格遵守操作常规，防止发生污染
2、 293T细胞
293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮 细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时 表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点 与启动子区的质粒可以复制。
使用时注意：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶 盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
③箱内加灭菌蒸馏水于槽中以保持箱内湿度， 避兔培养液蒸发。
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
常用玻璃器皿清洗
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质 都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24 小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃ 烘干
培养基。 实验材料
1、培养细胞生长的条件
➢ 细胞的营养需要 ➢ 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 ➢ 无毒 ➢ 无污染
培养基
天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液
优点：营养成分丰富，培养效果好
血清的成分
血清中含有： ①多种蛋白质（球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
培养
动物细胞原代培 养过程图
细
原代培 养期
为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长 至第一次传代的时期。
胞
系
的
传代期
生
长
原代培养的细胞生长一定时间之后，贴附型 细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，便 应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的
培养器皿中，即传代，此即成细胞系。
过
程
衰退期
一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍 然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，
五、作业
1、简述动物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞传代培养的注意事项？
知识简介：
贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。大部分二倍体 动物细胞。
悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见 于各种造血系统肿瘤细胞
原代培养
从体内取出细胞接种培养到第一次传代的 阶段，叫原代培养。
方法：无菌操作取出组织（或器官）
酶消化处理 分散成单个细胞 使其不断地生长和繁殖。
进而细胞发生衰退死亡。
传代细胞培养
原代培养的细胞在瓶壁相互汇合后，需要 将其分开至多个新的培养瓶，叫传代。
否则因为接触抑制和密度抑制现象，引起 细胞衰老，停止生长甚至死亡。
三、实验材料
用具器材： 移液枪，枪头、细胞培养瓶、倒置显微镜、
酒精灯、液体储存瓶、试管架等。 实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640