本科毕业论文---论质量源于设计(qbd)在制剂处方筛选中的应用以长春新碱脂质体为例

摘要
研究背景：长春新碱是一种广谱抗癌药，广泛应用于肿瘤联合化疗，但由于严重的神经毒性和组织刺激性等不良反应，其临床应用受到限制。

众所周知，脂质体是一种靶向给药制剂，具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮系统吞噬而活化机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

研究目的：本研究拟将长春新碱开发成长循环脂质体制剂，以减小其严重的毒副反应。

本论文主要论述长循环长春新碱脂质处方的开发，着重探讨QbD在制剂处方筛选中的应用。

研究方法：根据QbD的理念，首先明确长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况，结合以往脂质体处方开发的经验和风险评估的手段确定药品的关键质量属性。

然后以药品的关键质量属性和目标产品质量为出发点，从内相缓冲液的种类、培化磷脂酰乙醇铵（PEG-DSPE）的用量和药物的装载比例等因素进行系统筛选，以找出高包封率和可接受的体外药物释放度的处方。

然后将这些长春新碱脂质体和游离药物进行药代动力学、毒性和抗肿瘤效果对比，最终筛选出既有最佳的抗肿瘤效果又表现出最低毒性的处方，同时对该处方进行初步稳定性考察。

结果表明筛选出的处方在冷藏条件下稳定，不易渗漏，包封率高，粒径分布均匀，其质量属性符合预先设定的目标。

研究结论：本研究应用QbD的方法进行产品开发，对影响产品的关键质量属性进行了科学系统的研究，找出了影响产品质量的与处方和工艺相关的因素，从而制定合理的控制战略，使研发出的产品能够顺利转移到生产部门，最终实现商业化生产。

关键词：质量源于设计，QbD；处方筛选；脂质体；关键质量属性；风险评估；稳定性；药物动力学
The application of QbD in Formulation Development for Vincristine
Liposome Injection
Abstract
Background: Vincristine has been widely used in treatment of various cancers, especially in combined chemotherapy. However, clinical use of vincristine may cause severe neurotoxicity and tissues irritation, which limits its clinical application. It is well-known that liposome formulation is a targeted drug delivery system, which has structure similar to cells. There are many advantages to use liposome formulation in clinics. Liposomes could stimulate immune system once engulfed by reticuloendothelial system (RES). In-vivo distribution of a drug entrapped into liposomes could be changed, leading to decrease of therapeutical doses and thus adverse effects.
Research Purposes:formulating vincristine into long-circulating liposomes may significantly reduce its severe adverse effects, so the clinical outcome could be further improved. The purpose of this thesis is to develop PEGylated vincristine liposome formulations using current Quality-by-Design (QbD) approach.
Research Methods: Using QbD approach in formulation development, the quality target product profile (QTPP) of long-circulating vincristine liposome was first established and critical quality attributes (CQA) were identified using prior experience and risk assessment tool. Then, the type of intraliposomal trapping agents, the amount of PEG-DSPE and the drug-to-HSPC ratio (D/L) were investigated to obtain formulations with high encapsulation efficiency and acceptable in-vitro drug release profile. Moreover, in-vivo evaluation in animals was also conducted, including pharmacokinetic studies, acute toxicity and antitumor efficacy. Finally，a PEGylated liposome formulation with improved therapeutic index and reduced toxicity was selected. The selected liposome vincristine formulation met the predefined QTPP with good physical and chemical stability, higher encapsulation efficiency, lower leaking rate, and acceptable particle size distribution.
Research Conclusions: The thesis work followed the principle of QbD to systemically and scientifically evaluate the factors that have impact on product quality attributes and
identify critical quality attributes. Thus, source of variables in formulation and process can be understood and properly controlled. The vincristine liposome formulation developed from this study should be able to successfully transfer to production site in next step to achieve final commercial production.
Keywords:Quality by design, QbD, formulation screen, liposome, critical quality attributes, risk assessment, stability, pharmacokinetics
目录
第1章前言 (1)
第2章长春新碱市售制剂分析 (3)
2.1长春新碱理化性质 (3)
2.2长春新碱的市售制剂 (3)
2.3长春新碱的临床应用 (3)
2.4长春新碱的药代动力学 (3)
第3章长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况及关键质量属性 (5)
3.1长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况 (5)
3.2长循环长春新碱脂质体的关键质量属性 (6)
3.2.1 pH (6)
3.2.2 粒径 (6)
3.2.3 包封率和体外释放率 (7)
3.2.4 降解产物 (7)
3.2.5 残留溶剂 (7)
3.2.6 无菌和细菌内毒素 (7)
第4章处方筛选 (10)
4.1 处方变量的风险评估 (10)
4.2 内相缓冲液的影响 (12)
4.2.1 脂质体的制备方学 (12)
4.2.2 初步分析方法学 (13)
4.2.3 硫酸铵梯度法[1] (14)
4.2.4 磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺梯度法[5] (14)
4.2.5 试验结果 (15)
4.3 培化磷脂酰乙醇铵（PEG-DSPE）密度的影响 (16)
4.4 药物-类脂比（D/L）的影响 (19)
4.5 不同脂质体处方对药代动力学的影响 (20)
4.5.1方案设计 (20)
4.5.2动物及饲养 (20)
4.5.3供试品和对照品 (21)
4.5.4样品采集及处理 (21)
4.5.5试验结果 (21)
4.6 不同脂质体处方对体内毒性的影响 (22)
4.6.1方案设计 (22)
4.6.2动物及饲养 (22)
4.6.3供试品和对照品 (23)
4.6.4试验内容 (23)
4.6.5试验结果 (24)
4.7不同脂质体处方的抗肿瘤活性比较 (24)
4.7.1方案设计 (25)
4.7.2供试品和对照品 (25)
4.7.3 动物及饲养 (26)
4.7.4试验内容 (26)
4.7.5试验结果 (27)
4.8脂质体处方的初步稳定性考察 (28)
4.8.1稳定性研究 (28)
4.8.2试验结果 (29)
4.9处方因素的更新风险评估 (30)
第5章结论 (32)
参考文献 (34)
致谢 ...................................................................................................................... 错误!未定义书签。

第1章前言
脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。

早在1965年，英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了这样的分子结构，把它称作为脂质体，并首次展示了脂质体的图像，球状的、自我封闭的、分散在水中并且包封一部分水性介质的脂质粒子[1]。

之后脂质体进入快速发展期。

近年来，随着生物技术的不断发展，脂质体的制备工艺逐步完善，加之脂质体适合于生物体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是脂质体作为药物载体，具有靶向性，从而能够减少药物剂量，降低毒性，减少副作用等，因此脂质体靶向给药系统已愈来愈受到重视并得到广泛应用。

癌症是人类的大敌，在攻克癌症堡垒中，目前化疗还是主要的手段，而提高化疗效果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。

脂质体剂型可以在某种程度上提高化疗药物的靶向性，并大幅度地降低化疗药物的毒副作用，从几种途径上提高化疗药物的治疗指数。

与目前其他的抗癌药物剂型相比较，药物脂质体具有独特的优点，早已为国内外专家所瞩目。

长春新碱是从夹竹桃科植物长春花中提取的一种生物碱，有广泛的临床应用（尤其是治疗儿童和成人的恶性肿瘤），被认为是一种重要的抗肿瘤药物。

长春新碱对细胞有多种影响，但其作用机理仍在进一步研究中。

一般认为的作用机理是长春新碱抑制了微管蛋白的聚合，从而影响纺锤体微管的形成，使细胞分裂阻止在中期，从而抑制了肿瘤的生长。

随着长春新碱在临床上的广泛应用，其不良反应报道也日趋增多，尤其是与剂量相关的神经系统毒性，主要引起外周神经症状，如手指、神经毒性等，与累积量有关。

其他还有足趾麻木、腱反射迟钝或消失，外周神经炎。

此外也有腹痛、便秘，麻痹性肠梗阻的报道。

运动神经、感觉神经和脑神经也可受到破环，并产生相应症状。

神经毒性常发生于40岁以上者，儿童的耐受性好于成人，恶性淋巴瘤病人出现神经毒性的倾向高于其他肿瘤病人。

骨髓抑制和消化道反应较轻，有局部组织刺激作用，药液不能外漏，否则可引起局部坏死，可见脱发，偶见血压的改变。

其严重的神经毒性和组织刺激性等不良反应，已经限制了其临床应用。

而脂质体作为抗癌药物载体具有能增加与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加药物被癌细胞的摄取量，降低用药剂量，提高疗效，降低毒副作用的特点。

因此本研究拟将长春新碱开发成长循环脂质体制剂。

本论文采用QbD理念来研发疗效高、毒性低的长循环长春新碱脂质体。

首先分析研究长春新碱的市售制剂的临床用量、理化性质、药代动力学等参数。

进而确定长循环脂质体制剂的目标产品质量概况（QTPP）以及关键质量属性（CQA）。

然后以此为目标，从辅料的种类、用量、和药物的装载比例等因素进行系统研究，并和市售制剂进行对比，最终筛选出既有好的抗肿瘤效果，又有最低毒性的处方。

本论文应用实例阐明了QbD的理念在制剂处方开发中的应用。

应用QbD的理念进行产品开发，可以使研发人员可从临床患者角度出发来确定产品的目标质量特征，建立药品的关键质量属性，以保证药品的质量能满足患者需要。

在产品的研发过程中，强调对影响产品质量的处方和工艺过程中的变异因素进行科学系统的研究，从而理解哪些因素对关键质量属性有影响，并对此加以合理地控制，以确保上市产品生产的长期可靠性和一致性。

第2章长春新碱市售制剂分析
2.1长春新碱理化性质
游离长春新碱为片状结晶，极不稳定，因此常用其硫酸盐。

其盐为白色或类白色结晶粉末，无臭，有吸湿性，遇光或热易变黄。

熔点为218-220◦C。

在水中易溶，在甲醇或三氯甲烷中能溶解，在乙醇中微溶。

硫酸长春新碱为亲水性药物，因此拟开发的长春新碱脂质体可以采用主动载药方式，即先形成空白脂质体，再借助特定的梯度（如pH梯度或硫酸铵梯度）来实现药物的装载。

2.2长春新碱的市售制剂
目前临床上使用的均为硫酸长春新碱普通注射剂型，即注射用硫酸长春新碱，规格均为1mg。

国内有两家单位申报长春新碱的特殊制剂，分别为上海复旦张江生物医药股份有限公司申报的注射用硫酸长春新碱脂质体浓溶液和南京思科药业有限公司申报的注射用硫酸长春新碱脂质体。

临床上应用的均为长春新碱的普通注射剂，因此拟开发的长春新碱脂质体的质量特征和市售制剂对比时，直接采用原料药配制的水溶液来代替。

2.3长春新碱的临床应用
静脉给药，成人剂量1～2mg(或1.4mg/m2）最大不大于2mg，年龄大于65岁者，最大每次1mg。

儿童75μg／kg或2.0mg/m2, 每周1次静脉注射或冲入。

联合化疗是连续用药2周为一周期。

市售制剂规格为1mg，临床上最大使用剂量为2mg，鉴于计划开发的长循环长春新碱脂质体有可能降低毒副作用，可以增加给药剂量，故将产品规格升高到临床的最大使用剂量2mg。

2.4长春新碱的药代动力学
静脉注射长春新碱后，药物迅速分布于各组织，神经细胞内浓度较高，很少透过血脑屏障，脑脊液浓度是血浆浓度的1/30～1/20。

蛋白结合率75%。

在成人，T1/2α小于5分钟，T1/2β为50～155分钟，末梢消除相T1/2γ长达85小时。

长春新碱在肝
内代谢，在胆汁中浓度最高，主要随胆汁排出，粪便排泄70%，尿中排泄5%～16%。

为了提高长春新碱在体内的循环时间，计划将长春新碱开发成长循环脂质体，即隐形脂质体。

普通脂质体静脉注射后，迅速从血液循环中清除，因此脂质体可能还没有到达靶区，就已经被机体清除掉而无法发挥其治疗作用。

而隐形脂质体能够阻止巨噬细胞对脂质体的识别和摄取，从而延长脂质体在血中的循环时间，增加药物与肿瘤细胞的作用时间，并且更利于脂质体借助实体瘤的高通透性和滞留（EPR）效应富集到肿瘤组织中，以此提高对肿瘤细胞的杀伤力，增强药物疗效。

隐形脂质体主要是由携带亲水性长链的脂质插入脂质体膜上制备得到的，它能在血液循环中长时间保留，作用机制主要是亲水性长链在脂质体表面形成了亲水性保护层，阻止了调理素的吸附，因而减少了网状内皮系统（RES）的摄取。

常用于长循环脂质体的脂质成分为培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE），目前这种材料已经商业化，已上市的盐酸多柔比星脂质体制剂中也使用了该种长循环材料。

因此，开发体内长循环脂质体是切实可行的。

第3章长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况及关键质量属性3.1长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况
目标产品的质量概况是药品质量属性的前瞻性总结，具备这些质量属性，才能确保产品质量，并最终保证药品的安全性和有效性。

目标产品的质量概况是QbD方法的一个基本要素，构成了该产品的设计基础。

因此，从长春新碱的市售产品的属性出发，考虑到临床患者的需求，首先确定计划开发的长循环长春新碱脂质体的目标产品质量概况。

表3-1 目标产品质量概况（QTPP）
3.2长循环长春新碱脂质体的关键质量属性
关键质量属性（CQA）是产品的某种物理、化学、生物学或微生物学特性或特点，只有当这一性质或特点在一个适当的限度、范围或分布内，才能保证所期望的产品质量，保证产品安全有效[2]。

因此需在QTPP中确认关键质量属性，作为产品控制战略的关键部分。

3.2.1 pH
在脂质体制备过程中，无论是天然来源的磷脂，还是人工合成的饱和磷脂，都有可能发生水解。

磷脂水解掉一条酰基链后，就会形成溶血磷脂。

溶血磷脂作为表面活性分子，如果在脂质体中的含量超过一定的比例，就会导致脂质体解体。

同时溶血磷脂本身由于可以破坏磷脂膜，对机体的细胞可能也有毒害作用。

因此要严格的监控磷脂水解的程度。

通常，磷脂分子在pH6.5左右最为稳定[1]，如果pH偏酸或者偏碱，或者温度升高，磷脂的水解常数都会增加。

因此为了保证产品的质量，对产品的pH需要进行严格控制。

3.2.2 粒径
实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）是脂质体从血液向肿瘤中转运并在肿瘤组织中滞留的原因。

正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子和脂质颗粒不易透过血管壁，而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应，简称EPR效应。

EPR效应促进了大分子类物质在肿瘤组织的选择性分布，可以增加药效并减少系统副作用。

文献报道[3]，当脂质体粒径在100 nm左右时，血循环时间最长。

可能由于粒径超过100 nm的脂质体进入体内后迅速被单核吞噬细胞系统（MPS）清除，其半衰期很短，而粒径小于100 nm的脂质体能穿过窦状型毛细血管离开循环系统到相关组织(肝、脾、骨髓和实质性肿瘤等)。

脂质体粒度的控制是一个非常重要的问题。

最终产品的粒度会显著影响其体内行为，进而影响被包封的药物的治疗效果和毒性。

经过合理设计的脂质体由于EPR 效应能够在肿瘤组织中蓄积，减少药物在正常组织的分布，从而提高了药物的安全性和治疗的有效性。

因此本研究中将粒径控制在100nm左右。

为了使最终产品的粒度在需要的范围内，必须使用合适的制备工艺和制备设备。

不同的制备工艺得到的脂质体的粒度是不同的。

本研究选用同一制备工艺，考察处方中各种变量的影响。

因此仅需对产品的粒度进行控制，使其在合适的范围即可。

3.2.3 包封率和体外释放率
包封率(entrapment efficiency，EE)，又称为包裹率、包封效率等，是指包封在脂质体内的药物量占投料量的百分比。

包封率和很多因素相关，如类脂的种类及用量、药物的性质、药物-类脂比等，是脂质体制剂的一项重要质量指标，直接影响脂质体在机体组织的行为。

一个良好的脂质体处方应该具备较高的包封率，且在贮存期内稳定，因此将其作为关键质量属性，进行重点评价。

一个良好的抗肿瘤脂质体处方应该具备经静脉给药后，在血液循环中药物不释放或较少释放；当到达肿瘤区后，药物能有效的释放的特点，这样才能降低药物毒性，更好的发挥治疗作用。

体内的释放情况往往用体外方法代替。

因体外释放试验是在体温下，等渗的缓冲液中进行的，这些触发药物释放的因素和血浆中是类似的，例如稀释效应，逆转的pH梯度，可以很好的模拟体内释放情况。

因此体外释放度也是脂质体制剂的一项重要质量指标，将其作为关键质量属性，进行重点评价。

3.2.4 降解产物
降解产物是指新药制剂在生产和贮藏过程中，因光照、温度、pH、水或与赋形剂和/或包装系统互相反应而导致原料药发生化学变化而产生的杂质[4]。

虽然长春新碱原料对光、热敏感，但考虑到制成脂质体后，可以将原料药包裹到脂质双层的囊泡中，因此在处方筛选阶段不作为关键质量属性进行考察，仅在初步的稳定性研究中作为考察指标。

3.2.5 残留溶剂
制备脂质体的过程中，几乎不可避免的要使用有机溶剂。

除了乙醇以外，几乎所有的溶剂都是对机体有害的溶剂；因此制备的产品，对有机溶剂的残留量应该予以控制。

不同的制备工艺，使用的有机溶剂不同，应采取不同的控制手段。

但在本研究中，采取同样的制备工艺，同时制备规模较小，为实验室制备，可以很有效的除去有机溶剂，因此在本研究中，对残留溶剂暂不进行考察。

3.2.6 无菌和细菌内毒素
无菌和细菌内毒素是无菌制剂的关键质量属性，主要与制备工艺和生产系统相关，本研究为实验室规模，不具备无菌生产所需要洁净环境，因此对此不进行考察。

药品的质量属性的系统分析结果，如下表所示：
表3-2 药品质量属性
第4章处方筛选
4.1 处方变量的风险评估
本公司已经开发出盐酸多柔比星脂质体注射液和盐酸米托蒽醌脂质体注射液，其中盐酸多柔比星脂质体注射液已经取得生产批件，盐酸米托蒽醌脂质体注射液取得临床批件，正在进行Ⅰ期临床试验。

两种产品和普通剂型相比较，均显著降低了药物毒性，明显提高了治疗安全指数。

本公司在脂质体的处方研究中积累了一定的经验，根据以往的研究经验，首先对拟开发的长循环长春新碱脂质体的处方变量进行了初始风险评估，风险评估结果见表4-1,4-2。

表4-1 处方变量的初始风险评估
表4-2 处方变量初始风险评估依据
在体外通过对内相缓冲液、培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）和药物-类脂比例进行考察，初步确定脂质体处方。

然后将不同的脂质体处方通过体内的药代动力学、毒性和抗肿瘤活性的评价，最终确定毒性降低疗效增强的脂质体处方。

4.2 内相缓冲液的影响
硫酸长春新碱为亲水性药物，宜采用主动载药的制备方式，即先形成空白脂质体，再借助特定的梯度来实现药物的装载，常用的主动载药技术为pH值梯度法和硫酸铵梯度法。

使用主动载药技术，对药物的性质要求比较严格，能和脂质体的内相缓冲液可以生成较稳定的复合物或者沉淀。

只有药物可以和内相缓冲液生成较稳定的复合物或沉淀，才有可能保证药物在贮存期维持其包封效率和载药量，并且给药后，不会由于体液的稀释效应导致药物的大量渗漏。

但是这种复合物或沉淀作用又不宜太强，否则有可能药物在病变部位不释放，导致药物的疗效下降。

因此内相缓冲液的筛选尤为重要。

4.2.1 脂质体的制备方学
简要地说，氢化大豆卵磷脂（HSPC）、胆固醇（Chol）和培化磷脂酰乙醇胺（PEG2000–DSPE）的混合物溶解在氯仿中，然后在氮气下干燥成一层磷脂膜，接着
在真空条件下除去残留的溶媒。

在所有的实例中，HSPC 和chol 的摩尔比设定为3:2，PEG-DSPE 和HSPC 的摩尔比根据需要进行调整，比例是0.5%、2.9%和8.3%。

干燥的磷脂膜随后用内相缓冲液水化。

水化过程在60℃孵育1小时。

水化后的溶液在60℃下，通过0.1μm 的聚碳酸酯膜挤出8遍，所用挤出仪为Avestin 。

该过程形成了粒径100nm 的均一的粒子囊泡。

该囊泡的平均粒径通过Zetasizer Nano ZS （马尔文仪器）进行检测。

待粒径合格后，再使用Sephadex G-75凝胶柱，和脂质体的外相缓冲液进行置换，从而产生跨膜的离子梯度。

在实验中使用的外相缓冲液是pH6.5的300mM 蔗糖和20mM 组氨酸溶液，通过缓冲液的置换，空白脂质体具有了跨膜的离子梯度，然后和长春新碱以设定的质量比进行混合。

这混合溶液在60℃孵育设定时间，从而完成药物的装载。

4.2.2 初步分析方法学
包封率：采用凝胶过滤法分离脂质体和游离药物测定包封率，本实验采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75对游离药物和脂质体进行分离。

具体操作如下：
用0.9%氯化钠溶液平衡Sephadex G-75层析柱3倍柱体积以上，然后取100μl 的样品，加入层析柱上端，待药液完全进入胶内后，用0.9%氯化钠溶液洗脱，流速控制在1.0ml/min 左右，采用中压层析系统在线监测洗脱情况。

根据洗脱曲线，可以很好的分离脂质体部分和游离药物部分。

洗脱曲线如下图所示：
图4-1 洗脱曲线
A ：脂质体；
B ：游离药
包封率
%100(%)⨯+=F L L W W W Qw
体外释放度：在体内，脂质体的释放由粒径、双分子膜组成及内水相的组成决定；在体外，脂质体的释放受温度、介质中铵浓度、pH值等诸多因素影响。

在脂质体体外释放试验中，通常采用磷酸盐缓冲液或生理盐水为释放介质。

但是在体内能够促进药物释的一个主要因素是铵离子浓度，为了更准确的模拟体内环境，在本研究中选择pH6.5的葡萄糖组氨酸等渗溶液加入5mM的氯化铵作为释放介质。

精密吸取2 ml稀释后的长春新碱脂质体注射液，加到经预处理过的透析袋中，将袋口扎紧，固定于桨上并置于装有400 ml释放介质的溶出杯中，37℃ 75rpm恒速搅拌，定时吸取0.1 ml脂质体溶液，加入甲醇0.4ml溶解后进行液相测定。

含量：取长春新碱脂质体1 ml，置于10ml容量瓶中，用冷甲醇溶液定容至刻度。

取20 µl注入液相色谱仪，记录色谱图。

使用外标法计算含量。

液相检测：使用Waters液相进行色谱分析，用Zorbax的C18色谱柱，150*4mm2，5μm。

洗脱流动相为甲醇/80mM醋酸铵溶液，用盐酸调pH至3.0，体积比为52:48，流速为1ml/min，检测波长297nm。

4.2.3 硫酸铵梯度法[1]
硫酸铵梯度法在20世纪90年代初期由以色列学者发明。

该方法的制备过程和传统的pH值梯度犯有相似之处。

首先使用硫酸铵缓冲液制备空白脂质体，之后采用交叉流透析等手段除去脂质体外相的硫酸铵。

硫酸铵梯度法之所以能够实现药物的装载，可能和游离的氨跨膜扩散，造成磷脂膜内外的pH值得差异有关。

硫酸铵梯度法的优势在于制备空白脂质体的过程中，接近中性的硫酸铵水溶液不会引起过多的磷脂分子水解。

因为毕竟如果使用饱和磷脂制备脂质体，需要在较高的温度下完成。

使用传统的pH值梯度法，可能使得磷脂更容易发生水解。

在本研究中，硫酸铵内相溶液溶度为250mM。

4.2.4 磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺梯度法[5]
使用磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺为内相制备脂质体的机制基础和传统的硫酸铵梯度方法机制类似。

简要地说，当通过缓冲液置换产生磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺的跨膜梯度时，三乙胺（TEA）由于浓度梯度会穿过磷脂膜。

TEA的跨膜运动会引起脂质体内部介质酸化，从而产生pH梯度，长春新碱就能主动积累到囊泡中。

在本研究，磺丁基醚-β-环糊精-三乙胺内相铵离子浓度为500mM。