土壤微生物综合实验报告

广州大学

综合设计性实验报告

课程：微生物实验

实验课题：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶

活力的测定

学院：生命科学学院

姓名：徐嘉宽

学号：1414300030

班级：生技142

小组成员：

一实验摘要

本次实验通过采用5点采样方法在校园中采取2处土壤样品，运用梯度稀释的方法分离培养出不同生长形态的细菌，镜检后挑选几个菌落进行纯培养，用淀粉培养基鉴定其是否产淀粉酶，通过单染色、芽孢染色、革兰氏染色确定菌株的形态及革兰氏阴阳性，再通过各株菌株其中一株为蜡状芽孢杆菌。2种生化试验鉴定菌株的特性，确定了我们所分离的．

二实验目的

1.掌握从土壤等复杂的微生物环境中分离纯化技术

2.掌握培养基的配置方法及常用的微生物培养方法

3.掌握常用的微生物形态学鉴定方法、生理生化鉴定方法

4.了解微生物的16SrRNA序列鉴定方法、免疫学鉴定方法

5.掌握淀粉酶活力测定的原理及方法

6.掌握菌种保藏技术

7.培养数据统计、分析能力

8.培养团队协作精神，增强沟通合作能力

9.与其他小组交流合作、数据共享，进行更深入的探讨

10.学会查找、收集、整理资料

三实验原理

芽孢杆菌(BaciUus)是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体表面及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辖射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境。

土壤中蕴含着丰富的微生物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生

物类群。有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受体,在基因工程领域中有较高的应用价值。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件，是微生物生活最适宜的环境。其中的微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲

料等具有商业价值的重要酶类。

广州大学城四面环江，地处南亚热带,其气候属南亚热带典型的季风海洋气候。芽孢杆菌资源非常丰富。本方案在广州大学城预定区域釆集土壤样品,采用纯培养的方法,分离获得芽孢杆菌。对菌株进行形态学观察及生理生化分析,以挑选出可产淀粉酶的菌株。．

四实验材料

1.试剂与配方

试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、葡萄糖；可溶性淀粉、

K2HPO4、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水等工具:取样：铁锹、尺子、塑料袋等

培养：接种环（针）、培养皿、试管、试管架、锥形瓶、塞子、标签纸、

打火机、酒精灯、报纸、橡皮筋、无菌棉签、载玻片、香柏油、二

甲苯、擦镜纸、精密pH试纸、吸水纸、培养基平板，无菌水，试管

架，酒精灯，酒精瓶，记号笔，废物缸，牙签等；

其他工具：无菌操作台、恒温振荡培养箱、恒温培养箱

配方：

1)牛肉膏蛋白胨培养基：

营养琼脂3.3%、蒸馏水100mL、pH7.2-7.4。

2)营养肉汤:

牛肉膏0.3%、蛋白胨 1.0%、NaCl0.5%、蒸馏水100ml、pH（5.7、7.2→对照）。

3)半固体培养基(运动性试验）:

琼脂0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨 1.0%、NaCl0.5%、蒸馏水

100ml、pH7.2-7.4。

4)酪素水解培养基（酪素水解试验):

取5g脱脂奶粉与一号三角瓶中，加入50ml蒸馏水，110℃灭菌。另称 1.5g 琼脂置于含50mL蒸馏水的二号三角瓶中,120℃灭菌,待冷至45-50°C时,

将两液混匀倒成平板,即为牛奶平板。将平板倒置过夜,使表面水分干燥。

5)淀粉水解培养基:

营养琼脂3.3%、可溶性淀粉2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4

6)卵黄反应培养基：

无菌条件下去卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取5ml加入到融化的约

50-55℃的100ml的营养琼脂中（内含1g葡萄糖)，混匀后倒入培养皿内。制成的卵黄平板过夜后即可使用。

7)硝酸盐还原实验培养基:

胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl1.0%,KN030.1%,蒸馏水1OOmL,调节

pH7.0。

8)发酵培养基:

玉米粉2%、黄豆饼粉 1.5%、CaCl20.02%、MgSO40.02%、NaCl

0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸氨0.075%(溶解后加)、

Na2HPO40.2%,pH值7.0。

9)明胶培养基：

NaCl0.5%、蛋白胨 1.0%、牛肉膏0.3%、明胶12%、蒸馏100mL，调pH

。7.2-7.4．

10)西蒙斯氏柠檬酸钠盐培养液：

柠檬酸钠0.2%、NaCl0.5%、MgSO40.02%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢氨0.1%、溴麝香草酚蓝水溶液1ml、琼脂2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。

11)耐盐试验培养基（2%、5%、7%、10%）：

营养琼脂3.3%、NaCl（0.2%、0.5%、0.7%、1.0%）、蒸馏水100ml、PH7.2-

7.4。

12)糖发酵培养基（110℃灭菌）

12-1葡萄糖发酵培养基：

葡萄糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子

0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

12-2乳糖发酵培养基：

乳糖1.5%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子

0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

12-3木糖发酵培养基：

木糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子

0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

12-4阿拉伯糖培养基：

阿拉伯糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分

子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

12-5甘露醇发酵培养基：

甘露醇1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子

0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

13)葡萄糖蛋白胨培养基(VP、MR试验）（110℃灭菌）：

葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl0.5%、PH7.2-7.4。

14)蛋白胨水培养基（吲哚试验）：

蛋白胨1.0%、NaCl0.5%、PH7.2-7.4。

15)酪氨酸培养基（酪氨酸水解试验）：

L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，20min110℃灭菌，与100ml无菌营

养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板。

16)1%麦芽糖溶液

取0.1g麦芽糖,加入蒸馏水定容至100ml。

17)0.85%无菌生理盐水

称取0.85g NaCl于100ml蒸馏水中，摇匀，120℃灭菌。

18)1%3,5-二硝基水杨酸试剂

称取1g3,5-二硝基水杨酸,溶于20ml浓度2mol/L氢氧化钠溶液中,加

入50ml蒸馏水,再加入30g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O),待溶解

后用蒸馏水定容至100ml,盖紧瓶塞,勿使CO2进入。

19)2%淀粉溶液:

称取2g可溶性淀粉溶于100ml浓度0.1mol/ml pH值 5.6柠檬酸缓冲液中。

20)生化鉴定：草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染液、香柏油、