生物化学常用缓冲液

生物化学常用缓冲液

（一）基本概念

⑴ Bronsted-Lowry酸碱理论（酸碱质子理论）:

1923年由丹麦化学家J.N.Brφnsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl-等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。

如盐酸在水中的解离：

HCl Cl- ＋H+

HCl是酸，Cl-是它的共轭碱。

pH = pKa+log{[质子受体]/[质子供体]}

⑵缓冲体系的设计：

1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：

① pKa值在6-8之间；

②在水中的溶解度高；

③不易穿透生物膜；

④盐效应小；

⑤离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；

⑥不与金属离子生成复合物或沉淀；

⑦该缓冲剂化学稳定；

⑧紫外和可见光波长范围内光吸收小；

⑨易制得高纯度的盐。

（二）生物化学常用缓冲液

⑴磷酸盐缓冲液：

磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级

解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：

NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21

Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32

配酸性缓冲液：用NaH2PO4，pH＝1-4，

配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6-8，

配碱性缓冲液：用Na2HPO4，pH＝10-12。

用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。

磷酸盐缓冲液的优点为：

①容易配制成各种浓度的缓冲液；

②适用的pH范围宽；

③pH受温度的影响小；

④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。

其缺点为：

①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；

②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。

⑵ Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液：

Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。

Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：

Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5-8.5

Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0-9.0

Tris-HCl缓冲液的优点是：

①因为Tris的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由

酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；

②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。

其缺点是：

①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；

②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，而37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃-4℃。

③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。

④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

⑶有机酸缓冲液：

这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。

有机酸缓冲液的缺点是：

①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；

②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、

Mg++等）结合而使缓冲液受到干扰；

③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。

⑷硼酸盐缓冲液：

常用的有效pH范围是：pH＝8.5-10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。

⑸氨基酸缓冲液：

此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有：

甘氨酸-HCl缓冲液：pH=2.0-5.0，

甘氨酸-NaOH缓冲液：pH=8.0-11.0，

　甘氨酸-Tris缓冲液：pH=8.0-11.0，（广泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），

组氨酸缓冲液：pH=5.5-6.5，

此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。

其缺点是：

①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。

②试剂的价格较高。

⑹两性离子缓冲液（Good’s缓冲液）：

1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的几条要求和特性。

Good’s缓冲液的主要优点：不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。

其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。