双向凝胶电泳技术.
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
7
12% SDS-PAGE
CBB Stain
Silver Stain
蛋白质双向凝胶电泳
荧光差异双向电泳
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
生物样品分类
细菌
植物
真菌 其它
动物
生物分类
亚细胞 细胞
体液 其它
组织
形态分类
生物样品分类
¾Lysis C (1033 spots)：8M尿素、 4%CHAPS、25mMDTT、0.5% CA (pH=46.5)
¾ Lysis D (2226 spots)：5M尿素、 2M硫 脲、 2%CHAPS、2%SB3-10、20mMDTT、 5mM TCEP、0.5% CA (pH=4-6.5)、0.5% CA (pH=3-10)
¾ 比较蛋白质组学：
9 动物疾病的发病机制 9 植物抗逆的分子机理 9 生物标志物发掘
¾ 蛋白质互作组学 ¾ 蛋白质翻译后修饰
蛋白质组学研究常用技术
凝胶
双向凝胶电泳(2-DE) 荧光差异双向电泳(DIGE)
非凝胶
二维色谱(2D-HPLC) 毛细管电泳(HPCE)
一级质谱(MS-PMF) 串联质谱(MS/MS) 部分序列比对(Sequence Query)
¾ Lowary法：碱性条件蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物，
该复合物将磷钼酸-磷钨酸还原后显色 9 优点：灵敏度20-250ug 9 缺点：费时、干扰物质多(Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基 化物、酚类、柠檬酸等)，标准曲线的直线关系不严格
蛋白上样量
¾ 胶条pH范围：范围越窄，上样量越大 ¾ 胶条长度：胶条越长，上样量越大 ¾ 染色方法：灵敏度越低，上样量越大 ¾ 有效蛋白比：比例越低，上样量越大
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
双向电泳凝胶银染操作流程.
2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸） 六、（补充）：脱色
双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1
双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1一、蛋白质组学概论随着人类基因组计划的实施，生命科学步入了后基因组时代，出现了不同于以往经典生物实验科学的全新的研究方式─“生物大科学”。
这种生物大科学的核心思想是整体性研究，即以生物体内某类物质为对象进行完整的研究。
过去对生命活动的研究仅限于研究细胞内个别的基因或蛋白质，而基因组学和蛋白质组学的目标则是细胞内全部的基因和蛋白质。
因此，生物大科学与经典实验生物学在研究思路上有一个重要的区别：前者通常不针对具体的生物学问题或科学假设，其目标主要是把全部研究对象测定清楚，被称为“发现的科学”（Disco very Science）；而后者属于“小科学”，其实施则离不开具体的生物学问题或科学假设，被称为“假设驱动的科学”(Hypothesis-drive n Science)。
显然，生物大科学与经典实验生物学各有其所长，前者“广”而后者“深”。
如何把这二者有机地结合起来，使得人们能够更深刻更全面的揭示生命复杂体系和行为，这是后基因组时代生命科学工作者面临的重要课题，系统生物学（Systems Biology）就是针对这样一个时代需求而产生的生命科学研究领域的一门新兴学科。
它以基因组学和蛋白质组学为基础，通过实验观察和数学建模的反复迭代过程来描述和预测生物系统的动态行为。
点此下载本文的PDF全文：双向电泳(two-dimensional electrophores is).pdf蛋白质组学是系统生物学的基础和组成部分之一，在后基因组学时代的地位尤为突出。
蛋白质组学的内容包括：表达蛋白质组学（express ion proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能蛋白质组学（functional proteomics）。
双向电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。
双向电泳操作步骤
3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。
参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。
用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。
离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。
置于冰上裂解2h。
13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。
用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。
3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。
1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。
加入300μL沉淀剂。
振荡或倒置搅匀。
冰浴中（4~5℃）培育15min。
2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。
3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。
保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。
后离心5min，去上清。
4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。
将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。
在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。
-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。
5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。
小心地将上清液移走弃去。
此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。
6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。
振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。
双向凝胶电泳(2-DE)_百替生物
双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
聚丙烯酰胺凝胶双向电泳-文档资料
3．实验步骤 (1)准备玻璃管 取4支18 cm的长玻璃管，洗净晾干。 (2)配制第一向凝胶溶液（8mL /4组） 配制方法见表1。 表1 第一向凝胶溶液配方
尿素 重蒸水 30% Acrylamide储液
10% NP40 两性电解质(pH3~9.5) 10% 过硫酸铵* TEMED*
搅拌溶解
3.84 g 2.0 mL 1.6 mL
2．实验步骤 (1)组装夹心式玻璃板、制胶支架底座调水平；
取一块长玻璃板和一块带磨口槽的短玻璃板，将短玻璃 板带磨口槽的一边位于上端与长玻璃相对，两玻璃板之间 的左、右两端各放入一条间隔条，对齐，插入玻璃板固定 夹，将上面的固定螺丝拧紧，将此夹心式玻璃板放入制胶 支架底座，插入凸轮，向内侧推入并旋转180º，夹心式玻 璃板即被固定。
2配制第一向凝胶溶液8ml第一向凝胶溶液配方尿素38420ml30acrylamide储液16ml搅拌溶解10np4015ml两性电解质ph395050ml10过硫酸铵15temed10ml注射器和一根长针头吸取约05ml第一向凝胶溶液再取1支玻璃管用手指垫一块封口膜堵住玻璃管的一端将长针头全部插入玻璃管中一边注入凝胶溶液一边后退针头注意针头不要露出胶面直至凝胶溶液到达玻璃管顶端撤出针头用滤纸擦干玻璃管口的凝胶溶液然后用封口膜封住该端管口将玻璃管倒置将长针头从玻璃管的另一端插入管内凝胶液面下用同样方法加入凝胶溶液至距管口2cm处将玻璃管垂直放置然后立即用微量注射器在胶面上加少量重蒸水覆盖大约30min后凝胶聚合
1.5 mL 0.50 mL 15 µL 10 µL
(3)灌制第一向凝胶（每组2人共制作4根胶柱） 取1支1 mL注射器和一根长针头，吸取约0.5mL第一向凝
胶溶液，再取1支玻璃管，用手指垫一块封口膜堵住玻璃 管的一端，将长针头全部插入玻璃管中，一边注入凝胶溶 液一边后退针头，注意针头不要露出胶面, 直至凝胶溶液 到达玻璃管顶端，撤出针头，用滤纸擦干玻璃管口的凝胶 溶液，然后用封口膜封住该端管口，将玻璃管倒置，将长 针头从玻璃管的另一端插入管内凝胶液面下，用同样方法 加入凝胶溶液至距管口2cm处，将玻璃管垂直放置，然后 立即用微量注射器在胶面上加少量重蒸水覆盖，大约30 min后凝胶聚合。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
双向电泳
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应
双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义
双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义李峰师庆红张晓静何成彦赵丽纯1郭宏华（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）〔摘要〕目的利用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质差异，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。
方法①双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组；②二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组。
结果在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中两种技术路线有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表达上调的有7个，表达下调的有6个。
结论两种技术路线共同鉴定出的差异蛋白质是有意义的，对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依据和方向。
〔关键词〕双向凝胶电泳；二维色谱技术；质谱；大肠癌；蛋白质组学〔中图分类号〕R735〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0497-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.026基金项目：吉林省科技厅资助项目（No.20100742，200705387，20050702-4，20090461）1吉林大学药学院通讯作者：郭宏华（1964-），女，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤的发病机制及治疗研究。
第一作者：李峰（1979-），女，在读硕士，主要从事肿瘤分子生物学研究。
大肠癌（colon cancer ）是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率在世界范围内居各种肿瘤的第三位，在西方居第二位，并且发病率和死亡率均有逐年上升的趋势〔1，2〕。
大肠癌的发生和发展受到基因和环境等多种因素的影响，其病理机制复杂，从单一的基因突变和分子通道的变化难以全面理解大肠癌的发生机制。
蛋白质组学是近年来发展起来的新兴学科，已经广泛应用于肿瘤研究的诸多方面。
本文拟采用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质的差异性，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。
双向凝胶电泳介绍(Thermo)
1D- IEF
Practice
Preparative and analytical polyacrylamide and agarose gels can be readily cast in the laboratory for a variety of pH ranges. Gels are typically cast in sizes of 10 X 8 cm to 23 X 20 cm and in a variety of thicknesses. Precast Immobilized and ampholyte-containing gels are readily available in a variety of pH ranges. Precast sizes range from 0.5 X 6 cm strips for single samples to 12.5 X 24.5 cm large format for multiple samples. Precast gels are available in ultrathin formats, providing a high degree of resolution.
Coomassie blue stained, wide format IEF gel.
1D-SDS-PAGE
Sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Proteins are denatured in SDS. Negatively charged SDS coats the polypeptide evenly circa 1 SDS per 1.5-2.0 peptide bonds The charge density of the denatured protein is then independent of polypeptide length. Protein samples are loaded in individual wells at top of polyacrylamide gel
《双向凝胶电泳 》课件
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
第八课双向凝胶电泳
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。 • 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶， 因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓 缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙 烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
2D Gel-Based Proteomics
聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质的检测
• • • • • • • 理想显色剂的7S 安全（safety）： 灵敏（sensitivity）： 简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）：
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证 待研究蛋白的可检测性。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离：尽管增加上样 量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时 的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰 度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应 而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的 微制备技术进行分离：即将总蛋白组分 成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个 pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品
细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
样品的溶解
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制备原则：
由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
（1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
（2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上， 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
IPG胶条平衡 在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要
目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介 质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基 呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正 常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净 电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDSPAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中 正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分 钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl Ph8.8缓冲 液（含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡1015分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从 第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原 剂DTT的375mmol/L Tris-HCl pH8.8缓冲液，其他组分及 相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱 氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰 胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二 向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基 组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。
需要自动二维电泳仪的出现。
细胞处理：
对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组 分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。
组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融 等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过 稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。
等电聚焦
等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术， 基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在 一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有 分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低 的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分 子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯 度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度 （Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度 （Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两 性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质 的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式 的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。
2D-PAGE技术应用中的关键步骤： 1、样品制备（蛋白提取）：
（1）细胞培养、处理和收集； （2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解； （3）将样品离心以去除不容的细胞碎片和DNA，提取上 清，-80 ℃保存。 2、蛋白质定量和上样： （1）固相PH梯度干胶条（immobi-linePH Gradient,IPG）水化、等电聚焦； （2）IPG的平衡； （3）SDS-PAGE； (4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3、图像分析及数据处理： 将染色后凝胶放在GS-710,光密度扫描仪上，扫描后的 图像用PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑 点进行比较。
蛋白质样品处理：
在制备蛋白质样品的过程中，最好适用Dnase（脱氧核 糖核酸酶）和RnaseA（核糖核酸酶）来降解核酸。如果样 品中含有较多的核酸会增加样品的粘性并造成非斑点处的 背景拖迹，甚至还可能封闭凝胶孔。在蛋白样品裂解时， 应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中 蛋白质的溶解性为主要目标。目前增加蛋白质溶解性的方 法主要是适用变性剂，如尿素、硫脲，可以打破蛋白质的 高级结构，打断非共价连接。
双向凝胶电泳技术
two-dimensional gel electrophoresis
technห้องสมุดไป่ตู้logy (2DE)
定义一：以凝胶为载体的双向电泳。
定义二：根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在 凝胶介质二维空间上对蛋白质分子进行等电点聚焦和 电泳来分离与纯化蛋白质的方法。
双向凝胶电泳的原理：该技术是在1975年由意大利生化 学家O’Farrell 发明的。根据蛋白质等电点和分子 量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳。第一向 为等电聚焦（Isoelectric facusing，IEF)电泳，其 基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质 的分离。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE),它是按蛋白质分子量的大小进行分 离的,再用考马斯亮兰或P银染进行检测，经Pdquest 等软件对结果进行对比，解析。