双向凝胶电泳技术.

双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
制备原则：
由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备百度文库法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
（1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
（2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术
two-dimensional gel electrophoresis
technology (2DE)
定义一：以凝胶为载体的双向电泳。
定义二：根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在 凝胶介质二维空间上对蛋白质分子进行等电点聚焦和 电泳来分离与纯化蛋白质的方法。
双向凝胶电泳的原理：该技术是在1975年由意大利生化 学家O’Farrell 发明的。根据蛋白质等电点和分子 量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳。第一向 为等电聚焦（Isoelectric facusing，IEF)电泳，其 基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质 的分离。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE),它是按蛋白质分子量的大小进行分 离的,再用考马斯亮兰或P银染进行检测，经Pdquest 等软件对结果进行对比，解析。
2D-PAGE技术应用中的关键步骤： 1、样品制备（蛋白提取）：
（1）细胞培养、处理和收集； （2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解； （3）将样品离心以去除不容的细胞碎片和DNA，提取上 清，-80 ℃保存。 2、蛋白质定量和上样： （1）固相PH梯度干胶条（immobi-linePH Gradient,IPG）水化、等电聚焦； （2）IPG的平衡； （3）SDS-PAGE； (4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3、图像分析及数据处理： 将染色后凝胶放在GS-710,光密度扫描仪上，扫描后的 图像用PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑 点进行比较。
聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
IPG胶条平衡 在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要
目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介 质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基 呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正 常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净 电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDSPAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中 正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分 钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl Ph8.8缓冲 液（含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡1015分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从 第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原 剂DTT的375mmol/L Tris-HCl pH8.8缓冲液，其他组分及 相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱 氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰 胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二 向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基 组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。
蛋白质样品处理：
在制备蛋白质样品的过程中，最好适用Dnase（脱氧核 糖核酸酶）和RnaseA（核糖核酸酶）来降解核酸。如果样 品中含有较多的核酸会增加样品的粘性并造成非斑点处的 背景拖迹，甚至还可能封闭凝胶孔。在蛋白样品裂解时， 应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中 蛋白质的溶解性为主要目标。目前增加蛋白质溶解性的方 法主要是适用变性剂，如尿素、硫脲，可以打破蛋白质的 高级结构，打断非共价连接。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上， 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切
需要自动二维电泳仪的出现。
细胞处理：
对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组 分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。
组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融 等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过 稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。
等电聚焦
等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术， 基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在 一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有 分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低 的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分 子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯 度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度 （Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度 （Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两 性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质 的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式 的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。