平面色谱法

Rf值越小。
固定相：烷基化学键合相 流动相：水或水-有机溶剂的混合溶剂
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（三）高效薄层色谱法（HPLC）
参 数
板尺寸(cm) 颗粒直径(μm) 颗粒分布 点样量(μl) 原点直径(mm) 展开后斑点直径(mm) 展开距离(cm) 展开时间(min) 精密度RSD(%) 最小检测量：吸收(ng) 荧光(pg)
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2. 分离数(SN)
在相邻两斑点分离度为1.177时，
在Rf=0和Rf=1两组分斑点之间所能容纳的色谱斑点
数
L0 SN 1 (W1/ 2 )0 (W1/ 2 )1
（W1/2）0、（W1/2）1：薄层扫描所得的Rf=0和Rf=1 的组分的半峰宽
经典薄层板的分离数为7～10，高效薄层板的分离数在 10～20范围内。
Rf为0 的组分，K与k为，表示该组分停留在原
点，完全被固定相所保留。
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（三）面效参数
1．理论塔板数（n）：反映组分在固定相和流动相 中动力学特性的色谱技术参数。 代表色谱分离效能的指标，主要取决于色谱系 统的物理特性。 n=16（L/W）2 L：原点到斑点中心的距离 W：斑点的宽度
2．塔板高度（H）：
高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。
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(二)点样 1.样品溶液的制备 一般选用易挥发，与展开剂极性相似的有机溶剂， 如甲醇、丙酮、乙醇等。配制样品液浓度为 0.01% ～ 0.1%。 目的：使点样后溶剂能迅速挥发，减少色斑的扩散。 2.点样工具: •手动点样：点样毛细管，微量注射器。 •自动点样：半自动点样仪或全自动点 样仪
开多个试样；
分离能力较强，分析结果直观； 试样预处理简单，对被分离组分性质没有限制； 上样量较大； 仪器简单，操作方便。
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一、薄层色谱法的主要类型和原理
（一）吸附薄层色谱法
分离原理：将A、B两组分的混合溶液点在薄层板的 一端，在密闭的容器中用适当的溶剂展开。 吸附剂 展开剂溶解 A,B两组分 A，B移动 吸附 解吸附 新的吸附剂 展开剂 薄层板上 吸附 解吸 吸附，解吸附，再吸附 A ,B得以分离 KA＞KB, RfA＜RfB 再解吸，反复多次
线性范围：18.28 ng329.04 ng 回归方程：IF=720.146+34.942m r=0.998
中药品种的鉴定：例北柴胡与其它同属近缘植物的鉴别
可见光谱
UV366nm 荧光光谱
第一节
平面色谱法的分类和原理
一、平面色谱法的分类 1．薄层色谱法：将固定相均匀地涂布在玻璃板、塑 料板或铝箔上形成厚薄均匀的薄层，在此薄层上进 行混合组分分离的色谱法。 按分离机制分： 吸附薄层色谱法
石油醚等)，以降低极性。
可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。
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练习：某物质用氯仿展开时，⑴ Rf值太小，甚至停
留在原点，该如何调整展开剂？ ⑵若Rf值太大，斑
点在前沿附近，又该如何调整展开剂？
解：
⑴Rf值太小，说明流动相极性太小，应该加大流动
相的极性。在氯仿中加入一定量的甲醇或丙酮。
⑵若Rf值太大，说明流动相极性太大，应加入一定 量的烷烃或石油醚。
如生物碱、脂溶性维生素等； 中性氧化铝(pH7.5)——分离酸性及对碱不稳定的 化合物； 酸性氧化铝(pH4.0)——酸性化合物的分离。
Hale Waihona Puke 26硅胶与氧化铝的活度与含水量的关系
硅胶含水量% 活 性 级 氧化铝含水量%
0 5 15 25 38
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
0 3 6 10 15
含水量越高，活性越弱。
度。（注意温度不可过高）
活度与含水量的关系：含水量高，级数越高，吸
附能力越弱，同一组分在此硅胶上的Rf值越大。
分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。
常用硅胶
硅胶H、硅胶G、硅胶GF254、硅胶HF254、硅胶
HF254+366
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2. 氧化铝
碱性氧化铝(pH9.0)——分离中性或碱性化合物，
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二. 平面色谱法参数
※（一）定性参数 1．比移值(retardation factor Rf) 溶质移动距离与流动相移动距 离之比。
L0
La
Rf =La/L0
La为原点（origin）至斑 点中心的距离； L0为原点至溶剂前沿 （solvent front）的距离
Lb
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在实际工作中，Rf值适宜范围是0.2-0.8，最佳范
（一）吸附剂
1. 硅胶：硅胶为多孔性无定形粉末
表面带有硅醇基(silanol)呈弱酸性 通过硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键而表现 其吸附性能，由于各组分的极性基团与硅醇基形成 氢键的能力不同，而各组分被分离。
应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、 醛类等
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活化：加热至105~110℃左右，除去吸附水提高活
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※三、薄层色谱操作方法
一般操作程序：
制板 点样 展开
均匀 集中 (多种方式) 预饱和
斑点定位
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（一）薄层板的制备
1.薄层板的选择：表面光滑、平整、洁净，厚度一
致的玻璃板、塑料板或铝箔。
2.薄层的涂布：一般厚度250μm
3.薄层板的活化：涂铺的薄层板自然晾干后，在105110℃活化0.5-1h，取出，冷却至室温,存放在干
TLC
20×20 10 ~ 40 宽 1 ~ 5 3 ~ 6 6 ~ 15 10 ~ 15 30 ~ 200 ±10 1~5 50 ~ 100
HPTLC
10×10 5,10 窄 0.1~0.2 1 ~ 1.5 2 ~ 5 3~6 3 ~ 20 ±5 0.1 ~ 0.5 5 ~ 10
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二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
燥器中.
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黏结剂
无机黏结剂——石膏（硫酸钙），添加石膏的吸
附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字 母“H”表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐 酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。 薄层强度差。
有机黏结剂——羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、
聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度
3.点样量
点样量一般以几微升为宜，毛细管大约2～
3cm左右。若进行薄层定量或薄层制备，可多至
几百微升。
点样斑点直径以2～4mm为宜。
溶液宜少量多次点样。
4.点样方法 吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的点样 线上，点样线一般距薄层底边1.5～2cm,点间距 约0.8～1.5cm,根据板的宽度而定，点样后形成 的原点面积越小越好，一般原点直径不超过2～ 4mm为宜。
薄层定量精确的关键：原点直径的一致，点样
间距的精确。
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（三）展开 选择大小适合的展开容器，将点有样品的薄层板放
入容器内的展开剂中，浸入深度以展开剂液面距点样
基线5mm为宜，密闭，展开。一般上行展开8-15cm，
高效薄层板上行展开5-8cm。在溶剂前沿达到预定展
距后，取出薄层板，晾干，待检测。
展开方式主要有上行展开、下行展开、双向展开、
一般的极性大的组分用 极性大的展开剂，极性小 的组分用极性小的展开剂， 即“相似相溶原则” Stahl简图：极性物质— 活度低（活性级大）的吸 附剂--极性展开剂
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混合溶剂
先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极
性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，
如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、
水平展开、环形展开等。
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边缘效应:薄层展开后，位于
薄层板边缘的样品斑点比移 值较处于中间的斑点大的现 象。边缘效应会使斑点扩散 变形，从而影响样品定性结 果的判断。
预饱和是减少边缘效应的有
效办法。
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预饱和:
展开前，将薄层板臵于盛
有展开剂的色谱缸内饱和
15～30min,此时薄板不与 展开剂直接接触，当色谱 缸内展开剂蒸汽、薄层与 缸内大气达到动态平衡时， 即饱和时，再将薄层板浸 入展开剂中，称预饱和。
L0
La和Lb分别为组分i和参考物
质s在平面色谱上的移动距离。
Lb
9
重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误差
（参考物质与组分在完全相同的条件下展开）
Rr值可以大于1，也可以小于1。
影响Rr的因素
被测组分 色谱条件 参考物质
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（二）相平衡参数
1.分配系数（distribution coefficient；K）
分配薄层色谱法
分子排阻薄层色谱法
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2．纸色谱法:以纸为载体，纸纤维上吸附的水为固 定相，有机溶剂为流动相，根据被分离组分在水 和有机溶剂中的溶解能力不同，在色谱纸上产生 差速迁移而得到分离的方法。分离原理属于分配 色谱。 3．薄层电泳法:是指带电荷的被分离物质在纸、醋 酸纤维素、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等惰性 支持介质上，以不同速度向其相反的电极方向泳 动,产生差速迁移而得到分离的方法。
围0.3-0.5 影响比移值的因素
被分离物质的结构和性质
固定相的种类和性质
展开剂的种类和性质
温度 展开剂蒸气饱和度
2．相对比移值(relative
retardation factor；Rr)
Rr = Rf
(i)/Rf (s)=La/Lb
Rf（i）和Rf（s）：组分i和参考
物质s在相同条件下的比移值。 La
3.聚酰胺
聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物，薄层
色谱中常用的是聚己内酰胺。
白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一般有机溶
剂。
与化合物质子给予体形成氢键而对该类化合物产
生吸附。
用于酚、酸、硝基、醌类等化合物的分离。