蛋白质表达系统 ppt课件
细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白质来研究其结构和功能。
蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。
本文将对这两种蛋白质表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的系统。
该系统具有以下特点：1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平的优势。
通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量的外源蛋白质。
2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。
不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。
3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天，速度较快。
这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。
然而，原核表达系统也存在一些缺点：1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。
3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。
二、真核表达系统真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。
真核表达系统具有以下特点：1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。
2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。
真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类蛋白质。
3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达，适用于工业化生产。
然而，真核表达系统也存在一些缺点：1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。
外源蛋白表达简介ppt课件
• 制备原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体 的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体 外生 长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖 ，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞(次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型)与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种 细胞继承两种亲 代细胞的特性，它既具有B淋巴细 胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外 培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞 培养增殖的细胞群，可制备抗 一种抗原决定簇的特 异单克隆抗体。
二、杂交瘤技术的基本原理
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免
疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象 骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异 性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。
杂交瘤细胞的制备
（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基
骨髓瘤细胞选择
（四）细胞准备
（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞；
（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤
净多余上清。
纸吸
（五）细胞融合
(1)将1ml 40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管； (2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完； (3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，
动物乳腺组织
• 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白 质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特 别适合药用蛋白的生产；
蛋白表达概述ppt课件
增加可溶性和折叠；稀有密码子；毒性基因及质粒稳定性；其他因素。
在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在(蛋白可溶并不意味着蛋白正确折叠)。载体、宿主菌、蛋白序列和培养条件都会降低或升高蛋白可溶/不溶形式的比例。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导剂浓度，降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。温度：37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。裂解缓冲液的性质会大大影响到目的蛋白可溶与不溶形式之间的比例。当采用一般的裂解缓冲液如1×His Bind Binding 缓冲液（包括500mM NaCl）时，一些包含疏水或膜相关结构域的蛋白可能被归于不溶部分。在裂解缓冲液中加入毫摩尔的非离子型或双性去污剂可以将由于与细菌脂或膜结合而不溶的蛋白组分转变成可溶组分。包含高电荷结构域的目的蛋白可能与其他一些细胞元件关联（如可能与DNA 结合）。在这种情况下目标蛋白可能与细胞残余在一起，理论上可以在裂解缓冲液中加入盐或用Benzonase 核酸酶消化核酸来解决这类问题。Trx•Tag、GST•Tag和Nus•Tag融合标签都是高度可溶的多肽，可增加目的蛋白的溶解性。许多蛋白需要形成二硫键才得以正确折叠并产生活性，Rosetta-gami菌株不仅是硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变体，还是谷胱甘肽还原酶（gor）突变体，这进一步增强了二硫键的形成。如果目的蛋白中含有一个或更多的关键二硫键，pET-32a-c(+)载体与Rosetta-gami菌株的组合可能是最佳的选择。
不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。许多pET 载体具有同样的限制性酶切位点，那么可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的PCR 克隆策略。
蛋白组学定量蛋白质组学.ppt
2
常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
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（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
31
MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
32
MCAT策略流程：定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
37
羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
38
缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
蛋白质表达中的质量控制系统
蛋白质表达中的质量控制系统蛋白质表达是细胞内重要的生命过程之一，对维持生物体的正常代谢、生长发育和免疫防御等方面起着重要的作用。
但是在蛋白质表达的过程中，由于各种因素的影响，蛋白质的合成和折叠状态可能存在一定的异常，这时就需要靠细胞内的质量控制系统来修复或清除这些问题蛋白质，以保证正常的生物活动。
一、蛋白质表达过程中的质量控制细胞内的质量控制系统可以被分为三个部分：伴侣蛋白机制、泛素-蛋白酶体系统和自噬途径。
（一）伴侣蛋白机制伴侣蛋白机制是通过一系列特异性蛋白伴侣来协助保持蛋白合成的正常过程。
最常见的是分子伴侣热休克蛋白（HSP，heat shock proteins）家族，这一家族的蛋白可以与异常的蛋白结合，避免它们因折叠状态的异常而聚集和产生毒性。
（二）泛素-蛋白酶体系统泛素-蛋白酶体系统主要负责对异常蛋白进行降解。
这个系统通过标记蛋白表面的泛素蛋白结构，让蛋白能被特异性的酶体进行降解。
这个过程可以通过磷酸化、氧化、甲基化等多种方式引发，从而产生异常的蛋白。
（三）自噬途径自噬途径可以通过吞噬一部分蛋白和其他类似的细胞器或结构，将其转运到自噬体或吞噬体，最终被降解和回收利用。
这个过程可以帮助减少异常蛋白的数量和聚集状态，防止其对细胞产生毒性。
二、蛋白质表达及其质量控制在疾病相关方面的应用(一)癌症治疗在肿瘤细胞中，由于缺氧等因素影响，会导致许多异常的蛋白质被产生出来，这些异常的蛋白质经常成为靶点，在治疗中被选择。
因此，如果在癌症治疗中使用一些针对特定靶点的质量控制机制已经是一个热门领域。
(二)神经退行性疾病治疗神经退行性疾病具有蛋白异常聚集，导致细胞死亡的特点。
以阿尔茨海默症为例，这种疾病的脑细胞中有一类叫做“Tamm-Horsfall-like glycoprotein”的蛋白。
这种蛋白会把蛋白质碎片掩藏进细胞内蛋白质结构的可伸缩性区域，防止其干扰细胞的功能，进而减少了病变发生的风险。
因此，对于神经退化疾病的治疗也可以参考细胞内质量控制的机制。
蛋白表达系统分类-概述说明以及解释
蛋白表达系统分类-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白表达系统是一种重要的生物技术工具，被广泛应用于抗原制备、药物研发、基因工程、蛋白质学等领域。
它通过利用生物体内特定的遗传信息和代谢途径，将外源基因转化为蛋白质产物。
蛋白表达系统的分类主要根据基因表达介体的类型，可以分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统。
真核细胞表达系统主要利用哺乳动物细胞或昆虫细胞等真核细胞作为基因表达的宿主，能够产生复杂的蛋白质结构和正确的糖基化修饰。
而原核细胞表达系统则采用细菌或酵母等原核细胞作为基因表达的宿主，具有表达速度快、成本低等优势。
不同类型的蛋白表达系统具有各自的特点和适用领域。
真核细胞表达系统适用于需要复杂蛋白质结构和糖基化修饰的研究和应用，比如抗体制备和疫苗研发。
原核细胞表达系统则更多应用于产生大量重组蛋白质的需求，比如重组酶的制备和蛋白质互作研究。
随着生物技术的不断发展，蛋白表达系统也在不断创新和完善。
例如，通过引入特定的转化子和表达载体，蛋白表达系统的产量和纯度得到了显著提高。
同时，基因工程技术的进步也为蛋白表达系统的开发提供了更多的机会和可能性。
未来，随着对蛋白质功能和结构的深入研究，蛋白表达系统将在生物医学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。
综上所述，蛋白表达系统是一种关键的生物技术工具，通过利用生物体内的遗传信息和代谢途径，转化外源基因为蛋白质产物。
其根据基因表达介体的类型可分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统，各具特点和适用领域。
随着科学技术的进步，蛋白表达系统的发展前景是十分广阔的。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以描述文章的组织和布局，以及每个章节的内容概述。
以下是一个可能的写作示例：在本文中，将对蛋白表达系统进行分类，并深入探讨每个分类的特点、应用领域和发展历程。
本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分首先对蛋白表达系统进行概述，介绍其在生物医学领域的重要性和应用价值。
蛋白表达及纯化PPT课件
萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白 质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中 。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分 离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质 分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离 开。
亲和层析
利用基因工程改造的蛋白质分 子上的特定标签与固相载体上 的配体结合进行分离纯化。常 用的亲和层析包括His-tag亲 和层析、GST亲和层析等。
离子交换层析和凝胶过滤 层析
与抗体药物的纯化类似，离子 交换层析和凝胶过滤层析也可 用于重组蛋白药物的进一步纯 化和精制。
蛋白质相互作用研究中的纯化应用
02
蛋白纯化方法
沉淀法
盐析法
通过加入高浓度的盐溶 液，改变蛋白质的溶解
度使其沉淀下来。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低蛋白 质溶解度的原理，使其
沉淀。
聚合物沉淀法
利用聚合物与蛋白质的 相互作用，使蛋白质沉
淀。
低温沉淀法
在低温条件下，通过改 变蛋白质的溶解度使其
沉淀。
离心法
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将 不同大小的蛋白质颗粒分 离开。
扩展床吸附技术
将大颗粒的介质填充于柱中，使流动相能够通过吸附作用去 除杂质，提高纯化效果。
集成化与自动化技术
集成化分离系统
将多个分离步骤集成在一个系统中， 实现连续的分离纯化，提高生产效率。
自动化控制技术
通过自动化控制系统，实现分离纯化 的全流程监控和自动调节，减少人为 误差和操作时间。
蛋白质表达
• mRNA的生物合成 • 蛋白质生物合成 • 原核生物表达系统 • 真核生物表达系统 • 蛋白质的纯化方法
mRNA的生物合成 (转录)
• 目的基因 • RNA聚合酶 • 启动子 • 转录终止信号 • 转录因子等等
启动子
• 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异 结合的部位。 某个基因是否表达决定于特 定的启动子的起始转录。
宿主染色体DNA整合
• 如果将目的DNA直接引入宿主生物的染色体中， 就能克服质粒丢失的问题。目的基因整合到宿 主染色体时，染色体整合位置必须在所需的编 码以外，即，DNA序列必须插入到染色体中特 定的非必要位点，两个DNA分子之间只要发生 同源重组即可。为了将DNA整合到染色体中， 插入DNA一般至少需要与染色体DNA有50个核 苷酸相同的序列。
标签 • 一个转录终止信号 • 一个分泌信号肽（分泌型）
融合蛋白
融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连 接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： • 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 • 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 • 增加目的蛋白的溶解性 • 作为抗原的标记蛋白 • 易于外源蛋白的纯化
• CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助 酶分子正确定向,以便DNA结合。
• CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合， 从而提高与其特定启动子结合的概率。
由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻 遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利 用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌 才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强 诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可 供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分 利用乳糖。
z：β-半乳糖苷酶 y：通透酶 a：转乙酰基酶
蛋白质表达PPT课件
提高蛋白质表达产量的方法与策略
01
优化基因序列
通过优化目的基因的序列，如提高启动子活性、调整密码子使用等，可
以提高蛋白质的表达水平。
02
宿主细胞选择与改造
选择合适的宿主细胞，并进行必要的改造，如细胞代谢途径的优化、细
蛋白质降解
通过细胞内的蛋白酶体系统降解蛋白 质，调节细胞内蛋白质的平衡和功能。
02
蛋白质表达系统
原核表达系统
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌表达 系统能够高效表达外源基因，
产生大量的重组蛋白质。
操作简便
原核表达系统相对简单，遗传 背景和培养条件较明确，便于 实验操作和基因工程改造。
表达产物易纯化
原核表达产物通常以可溶性或 包涵体的形式存在，易于分离 和纯化。
酵母表达系统在工业生产中具有一定的应 用价值，可以用于生产酶制剂、生物材料 等。
培养基廉价易得
表达量不稳定
酵母菌可以在相对简单的培养基中生长繁 殖，降低了生产成本。
酵母表达系统的表达量可能受到多种因素 的影响，如基因拷贝数、整合位点等，导 致表达量不稳定。
昆虫表达系统
高效表达外源基因
昆虫表达系统如杆状病毒表达系统能够 高效侵染昆虫细胞，并在短时间内获得
基因转染技术
基因转染技术是一种将外源DNA或RNA导入细胞的技术。通 过基因转染技术，可以将目的基因导入到细胞中，实现目的 基因的表达。
基因转染技术是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因转染 技术可以将目的基因导入到各种类型的细胞中，如原代细胞 、干细胞、肿瘤细胞等，实现目的基因的表达和功能研究。
重组蛋白的表达系统(详细版) PPT
图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个
弱启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共 表达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经
导致的目的基因转录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。 • P突在L、变42c体s℃p菌A时启株诱动中导子，重使P组L等宿蛋启主白动菌表子能达使够；得进c宿行sp主温A启在度动3依0子℃赖则时型被抑的高制表温重达（组。3蛋在7℃白温）表度抑达敏制，感，而型
低温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低 了使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。
典的lac启动子。 • 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达
到细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿
拉伯糖，本底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达
系统中最高效的启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启 动子来源于λ噬菌体，专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合 在宿主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）
中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。
Hale Waihona Puke 当受到诱导时，T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上，启动重 组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚 合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高效表达，其产率可以达到细
菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个 lac操纵子，其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。 lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶
蛋白诱导表达_2017年分子生物学实验 PPT
➢ 乳糖+阻遏蛋白，改变阻 遏蛋白的形状。
9.1.4 诱导原核表达的原理
E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一
种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，其 基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5
蛋白诱导表达_2017年分子生物学实验
9.1.1 实 验 目 的
1. 掌握蛋白质诱导表达的原理 2. 学习蛋白质诱导表达的方法 3. 了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点
需将编码所需蛋白的基因插入质 粒或其它载体,然后导入活细胞
外源基因的高效表达,获得有重要价 值的蛋白质产品
基因工程的最终目的
蛋白表达操作流程
lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能 进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。 IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结 合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源 基因大量转录并高效表达。
9.1.5 蛋白原核表达载体
• 具备与克隆载体相同的条件：自主复制 序列，可供筛选的遗传性状，MCS
• 还必须具有用于外源基因表达的启动子、 SD序列、及转录终止子等元件。
• pET系列：6 His Tag （660Da-2kDa） pGEX系列：GST （26kDa） pMAL系列：Maltose Binding Protein
（52kDa）
pET系列
pGEX系列
pMAL系列
9.1.6 融合蛋白
主要步骤
操作
制备表达载体
1. 酶切, 去磷酸化
2. 胶回收纯化
制备目的DNA
1. 质粒纯化/PCR
蛋白表达及纯化ppt课件
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
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哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的 感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时 间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源 基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出 目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、 增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。
3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助 载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达 体系中的杆状病毒。
蛋白质表达系统
大肠杆菌表达系统
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系 统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以 其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为 生产重组蛋白的最常用的系统。
蛋白质表达系统
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统
优点：蛋白翻译后加工机制最接近体内 的天然形式，最容易保留生物活性 。
缺点：表达量通常较低，稳定细胞系建 立技术难度大，生产成本高 。
蛋白质表达系统
蛋白质表达系统
杆状病毒系统的主要有点包括
1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白 的正确折叠、二硫键的搭配
2，蛋白翻译后的加工修饰； 3，表达水平高，可达总蛋白量的50%； 4，可容纳大分子的插入片段； 5，能同时表达多个基因。主要缺点是 外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控 之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡。
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、 稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达 载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目 的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周 期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载 体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由 于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。 诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以 开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高 蛋白产量。
蛋白质表达系统
优劣分析
1 原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统， 也是最经济实惠的蛋白表达系统。
代表：大肠杆菌表达系统。 优点：遗传背景清楚、成本低、表达量高和表
达产物分离纯化相对简单 缺点：蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键
的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有 生物活性的蛋白的几率较小。
蛋白质表达系统
酵母表达系统
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核 以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛 的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功 能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。
常用的酵母表达系统二：，甲醇营养型酵母表达系统 一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统 二，甲醇营养型酵母表达系统
蛋白质表达系统
酵母蛋白表达系统
代表：甲醇毕赤酵母 优点：表达量高，可诱导，糖基化机制
接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化， 易实现高密发酵 缺Biblioteka ：部分蛋白产物易降解，表达量不 可控
蛋白质表达系统
昆虫表达系统
昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数 高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。 利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载 体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具 有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化 及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其 最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外 源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达 多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在 此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒 包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病 毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用 于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆 位点和多角体蛋白启动子。
1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、 酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特 性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。
2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿 主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载 体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达 载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导， 外源基因可以在宿主中表达。
蛋白质的表达系统
蛋白质表达系统
什么是蛋白质表达？
蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵 母、动物细胞或者植物细胞表达外源 基因蛋白的一种分子生物学技术。在 基因工程技术中占有核心地位。
蛋白质表达系统概述
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助 成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因 在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成：
对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的 大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载 体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有 效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起 始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达 是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列 融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、 带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载 体。