1双抗体夹心法
双抗夹心法-ELISA
双抗夹心法ELISA（TAS-ELISA）步骤：1、准备可控温培养箱或摇床和样品。
样品用液氮或研钵研磨碎，再用组织：1×GEB 缓冲液=1:10（g:ml）浓度液提取。
2、用碳酸盐包被缓冲液稀释一抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的一抗100μl。
将加入一抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
3、一抗包被结束时，在水池中倒出剩余液体，用1×PBST洗4-5次，每次将酶标板在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
4、每孔加入100μl事先处理好的样品，每批实验均需加入阳性对照和样品提取液（GEB）。
将加入样品的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
5、样品包被时间结束时，在水池中快速倒出剩余样品液体，用1×PBST洗7次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体。
6、用ECI抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的二抗100μl。
将加入二抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
7、二抗包被结束时，在水池中快速倒出剩余抗体，用1×PBST洗8次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体和气泡。
8、在二抗包被结束前15min中准备底物显色液。
PNPP/1×PNP Buffer=1mg/ml的浓度配制，避光保存。
每孔加入底物100μl。
将加入底物的酶标板用锡箔纸包裹，置于37℃下孵育1小时。
9、显色30min时用肉眼观察显色结果，阳性孔应该显色，GEB孔应该无色。
直到显色1h时，阴性仍然无色就在酶标仪上测405nm处的OD值，求出阴性对照的OD值的值N，若样品OD值P≥2N，则视为阳性，否则为阴性。
试剂：。
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)1
精选版课件ppt
15
注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
精选版课件ppt
16
思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
7. 终止反应：各孔加终止液50μl （2mol/L H2SO4 ）。 8. 比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔
OD值。
精选版课件ppt
12
6.显色
各孔（包括空白对照）加底物 A液50μl（1滴），底物B液 50μl（1滴），置37℃避光温 育15min
7.终止反应
各孔加终止液50μl （2mol/L H2SO4 ）
精选版课件ppt
13
OPD（邻苯二胺）经酶 作用后的显色反应
终
终
止
止
前
前
终
终
止
止
后
TMB四甲基联苯胺经酶作后
用后的显色反应
精选版课件ppt
14
结果判断：
计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1 结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
精选版课件ppt
17
精选版课件ppt
18
2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分
化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Bispecific T-cell Engager, BiTE）是一种新型的免疫治疗方法，它通过结合两种抗体，使T细胞与癌细胞之间建立联系，以增强抗肿瘤免疫反应。
本文将详细介绍双抗体夹心法的原理，并探讨其在肿瘤治疗中的应用前景。
一、双抗体夹心法的原理双抗体夹心法的原理主要依赖于两种单克隆抗体的结合。
第一种抗体（抗CD3抗体）结合在T细胞表面的CD3ε亚单位上，激活T细胞并诱导T细胞释放细胞毒素。
第二种抗体（抗肿瘤特异性抗原抗体）结合在肿瘤表面的抗原上，将T细胞与癌细胞相连接，形成一个免疫复合体，使T细胞能够直接杀伤癌细胞。
具体而言，双抗体夹心法的应用分为三个步骤：诱导，连接，杀伤。
1. 诱导：双抗体夹心法的第一步是将抗CD3抗体结合在T细胞表面的CD3ε亚单位上。
CD3ε是T细胞受体复合物的一部分，其结合后能够激活T细胞，并使其释放细胞毒素。
2. 连接：第二步是将抗肿瘤特异性抗原抗体结合在癌细胞表面的抗原上。
这些抗体能够选择性地识别并结合在癌细胞表面的抗原上，将T细胞与癌细胞连接在一起。
3. 杀伤：在连接完成后，通过T细胞释放的细胞毒素直接引起癌细胞的死亡。
这些细胞毒素能够穿透癌细胞的细胞膜，并激活细胞死亡信号通路，引发癌细胞的凋亡。
二、双抗体夹心法在肿瘤治疗中的应用前景双抗体夹心法作为一种新型的免疫治疗方法，具有许多优势，使其在肿瘤治疗中有着广阔的应用前景。
1. 高度特异性：双抗体夹心法通过选择性地结合在癌细胞表面的抗原上，避免了对正常组织的损伤，减少了治疗的毒副作用。
2. 改善免疫细胞活性：双抗体夹心法能够激活T细胞，并增强其杀伤癌细胞的能力。
相比传统的免疫治疗方法，其疗效更加显著。
3. 克服肿瘤免疫逃逸：由于双抗体夹心法能够直接将T细胞与癌细胞相连接，并诱导细胞毒素的释放，从而通过双重机制克服了肿瘤免疫逃逸现象。
4. 适应范围广泛：双抗体夹心法可以应用于各种类型的癌症，包括但不限于白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌等，具有较强的普适性。
llissa步骤
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
ELISA相关仪器试剂设备
(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
NaCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
检测新冠抗原的双抗夹心法原理
检测新冠抗原的双抗夹心法原理
新冠抗原的双抗夹心法（又称为双抗原夹心法）是一种常用的新冠病毒检测方法。
其原理如下：
1. 检测原理：
- 新冠抗原的双抗夹心法是基于免疫学原理进行的检测方法。
该方法利用单克隆抗体和标记物标记的检测抗体与新冠病毒抗原结合，形成夹心复合物。
- 检测时，将待检标本（如鼻腔或咽部拭子）加入检测试剂中，使病毒抗原与检测抗体结合。
如果标本中存在新冠病毒抗原，则夹心复合物会形成。
2. 结果解读：
- 当存在新冠病毒抗原时，夹心复合物将被形成，并可视为
阳性结果。
- 如果标本中没有新冠病毒抗原，则不会形成夹心复合物，
视为阴性结果。
- 结果的解读一般通过观察夹心复合物的形成与否来确定。
双抗原夹心法通常具有灵敏度高、快速、简便等优点，可用于新冠病毒的早期筛查和日常监测。
需要注意的是，该方法仅能检测当前感染的新冠病毒抗原，无法判断过去曾被感染或正在恢复中的个体。
因此，在诊断新冠病毒感染时，常需结合临床症状、流行病学史和其他检测方法来进行综合判断。
ELISA操作流程
ELISA操作流程（一)、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5~20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2。
洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体,加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2—3次，每次3—5min；3. 封闭：按200—250ul/孔加入封闭液,室温2—3小时或37℃1-2小时,也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液;4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品（含未知抗原）稀释至所需浓度；5。
标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤);6.加样：按排列顺序依次加入50—100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50—100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9。
洗板：同步骤2；10。
加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12。
结果判定：可于白色背景上,直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+"、“—”号表示。
也可在酶标仪上于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性.方法二间接法（用于检测未知抗体）1。
包被:用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次;2.洗板：次日弃去孔内液体,在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280—300ul/孔），漂洗2—3次，每次3—5min；3. 封闭:按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1—2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Bispecific T cell Engager, BiTE）是一种重要的免疫疗法，通过结合两种不同的抗体来激活T细胞，从而识别和杀灭肿瘤细胞。
本文将详细介绍双抗体夹心法的原理及其在肿瘤治疗中的应用。
一、双抗体夹心法的原理双抗体夹心法的原理基于免疫细胞的活性调节和识别机制。
该技术使用两种单克隆抗体分子，一种与肿瘤细胞特异表面抗原（Tumor-associated Antigen, TAA）结合，另一种与T细胞表面的CD3结合。
这两种抗体通过产生连接两种细胞的跨膜结构域，使得肿瘤细胞与T细胞得以紧密结合。
双抗体夹心法的最重要的作用是调节T细胞的活性。
正常情况下，T细胞通过TCR（T细胞受体）与抗原递呈细胞上的MHC（类II主组织相容性复合物）结合，并受到CD28等共刺激分子的刺激，从而产生免疫应答。
然而，许多肿瘤细胞会通过降低MHC复合物的表达来逃避T细胞的识别和攻击。
而双抗体夹心法通过绕过MHC表达，直接连接T细胞与肿瘤细胞，弥补了MHC缺失的不足。
此外，在双抗体夹心法中，T细胞的激活也是通过与肿瘤细胞结合的抗体调控的。
特异性的抗体分子与肿瘤细胞表面的TAA结合后，可以同时与T细胞上的CD3结合，激活T细胞，从而引发细胞免疫应答，产生细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocytes, CTLs)。
二、双抗体夹心法在肿瘤治疗中的应用双抗体夹心法作为一种新型的肿瘤免疫疗法，具有较高的疗效和安全性，广泛应用于肿瘤治疗中。
1. 白血病的治疗双抗体夹心法被广泛应用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）。
该疾病常见于儿童和年轻人，传统治疗方法的有效性较低。
而双抗体夹心法可以通过激活T细胞，识别并杀灭B-ALL细胞，显著提高治疗效果。
2. 非小细胞肺癌的治疗双抗体夹心法也被用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。
NSCLC是一种常见的恶性肿瘤，传统的放化疗方法效果有限。
双抗体夹心法实验步骤
双抗体夹心法实验步骤1. 前言双抗体夹心法是一种非常常用的免疫检测方法，广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域。
这种方法利用两个专一性强的抗体共同夹持待测物质，从而形成类似“夹心”的结构，可以大幅度提高检测的精准度和准确性。
本文将详细介绍双抗体夹心法的实验步骤。
2. 实验器材1. 96孔微孔板2. 吸头或移液器3. 洗板缓冲液4. 夹心板抗原或抗体5. 试剂盒中提供的初级抗体（通常是兔抗)6. 试剂盒中提供的生物素化二级抗体（通常是山羊抗）7. 过氧化物酶（HRP）结合酶标记荧光素底物8. 磷酸化蛋白酶抑制剂3. 实验步骤3.1. 板面涂覆1. 取出一张96孔微孔板；2. 加入200 μl 夹心板抗原或抗体（1-5 μg / ml 的浓度在PBS缓冲液中）。
在室温下静置2～12小时使其附着于微孔板上；3. 弃去液体，在孔内加入300 μl 1％牛血清蛋白（BSA）的PBS缓冲液，在常温下保存微孔板。
3.2. 洗涤1. 取出洗板缓冲液，并将96孔微孔板中的PBS液体涂覆洗净（如果您使用的是自己配制的洗板缓冲液，请按照所使用的方案操作）；2. 重复1次。
3.3. 初次抗体夹心反应1. 取出您的实验物质，并将其加入到96孔微孔板中的每个孔中，通常情况下是50μl（如果您没有在预处理中加入样品，则当前步骤可以忽略）。
2. 在4℃条件下，静置2个小时；3. 弃去孔中的液体，在平板中添加330μl PBS缓冲液；4. 重复步骤 2 次。
3.4. 二次抗体夹心反应1. 在96孔微孔板中的每个孔中加入100μl色素化的抗原抗体，通常情况下是1000～5000倍的稀释度，在PBS缓冲液中（如果用于夹心的是抗体，则当前步骤可以忽略）；2. 在4℃条件下，静置2个小时；3. 弃去孔中的液体，在平板中添加330μl PBS缓冲液；4. 重复步骤 2 次。
3.5. 酶标记亚细胞ALP反应1. 在96孔微孔板中的每个孔中加入100μl碱性磷酸酶[ALP]标记的生物素化羊抗体，通常情况下是5000倍稀释度（如果您使用的不是生物素化羊抗体，则当前步骤可以忽略）；2. 在4℃条件下，静置2个小时；3. 弃去孔中的液体，在平板中添加330μl PBS缓冲液；4. 重复步骤 2 次。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理随着生物技术的不断发展，研究人员不断努力寻找更有效的药物疗法来治疗各种疾病。
双抗体夹心法（或称抗体夹心法）作为一种新兴的治疗策略，正在受到越来越多的关注。
本文将介绍双抗体夹心法的原理和应用。
1. 基本概念双抗体夹心法是一种利用两种不同抗体与同一抗原结合的策略。
通常情况下，这两种抗体分别被称为抗原抗体和效应抗体。
抗原抗体与目标抗原结合，然后效应抗体与抗原抗体结合，形成一个“夹心”结构，从而实现对目标抗原的高度特异性识别和调控。
2. 原理解析双抗体夹心法的原理基于两种抗体结合抗原的能力和效应抗体的调控作用。
首先，抗原抗体具有高度特异性，可以选择性地识别和结合目标抗原。
其次，效应抗体具有特定的功能，例如抑制、促进或激活细胞免疫应答等。
当抗原抗体与目标抗原结合时，效应抗体可以通过结合抗原抗体来调控目标抗原的生物活性。
这可以通过以下几种方式实现：2.1. 抗体依赖性细胞毒性（ADCC）效应抗体可以结合至抗原抗体的Fc区域，激活免疫细胞，如自然杀伤细胞（NK细胞）以及单核细胞等，通过ADCC机制杀伤抗原阳性细胞。
这种机制在治疗癌症等疾病中已经被广泛应用。
2.2. 免疫调节效应抗体可以通过影响信号通路、改变细胞素产生及调节免疫细胞的功能，来调控免疫应答。
这种机制在治疗自身免疫性疾病、感染性疾病等方面具有良好的应用前景。
2.3. 抗体依赖性细胞捕获（ADCP）效应抗体不仅可以激活免疫细胞来杀伤抗原阳性细胞，同时还可以通过ADC机制让免疫细胞吞噬抗原阳性细胞。
这种机制在治疗炎症性疾病、感染性疾病等方面显示出潜力。
3. 应用前景双抗体夹心法作为一种新型的治疗策略，具有广泛的应用前景。
它可以用于治疗多种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等。
临床试验已经显示，双抗体夹心法在治疗某些肿瘤中取得了显著的疗效。
此外，由于效应抗体具有多样化的功能，双抗体夹心法还具有潜力用于精准医学和个体化治疗。
尽管双抗体夹心法在治疗领域中有着广阔的应用前景，但仍然面临一些挑战。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Bispecific T-cell Engagers, BiTEs）是一种新型的抗体工程技术，通过同时结合两个不同的抗原靶标，激活并增强人体免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。
该技术的原理基于特异性结合抗原的单克隆抗体，并通过连接肿瘤细胞和T细胞，促进肿瘤细胞的杀伤作用。
1. 双抗体夹心法的结构双抗体夹心法的结构可以分为四个部分：单链Fv抗体、连接剂、单链Fv抗体、连接剂。
其中，单链Fv抗体是双抗体夹心法的关键组成部分，它可以同时结合两种不同的抗原靶标，例如肿瘤细胞上的特定抗原和T细胞上的CD3ε。
连接剂则起到连接作用，将两个单链Fv抗体相互连接在一起，形成抗体结构。
2. 双抗体夹心法的原理双抗体夹心法的原理是通过两个单链Fv抗体同时结合肿瘤细胞和T细胞，将它们紧密地连接在一起。
当双抗体夹心法与肿瘤细胞结合时，它可以释放活化信号，激活附近的T细胞。
同时，双抗体夹心法也能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，并促使T细胞产生细胞毒性溶解素和细胞因子等效应分子，进一步增强其杀伤作用。
3. 双抗体夹心法的应用双抗体夹心法作为一种新型的免疫治疗技术，已经在临床试验中显示出良好的疗效，并在一些特定类型的恶性肿瘤治疗中取得了显著的进展。
例如，针对B细胞淋巴瘤的双抗体夹心法已经获得了FDA的批准，并成功实现了临床应用。
此外，双抗体夹心法还可以用于其他类型的恶性肿瘤治疗，如乳腺癌、肺癌等。
4. 双抗体夹心法的优势和挑战双抗体夹心法相比传统的单克隆抗体治疗具有一些明显的优势。
首先，双抗体夹心法可以同时结合两种不同的抗原靶标，通过激活T细胞的杀伤作用，增强肿瘤细胞的杀伤效果，并减少肿瘤细胞对治疗的耐药性。
其次，双抗体夹心法可以有效地激活免疫系统，提高肿瘤治疗的整体效果。
然而，双抗体夹心法在应用过程中也存在一些挑战，如制备成本高、体内稳定性等问题，需要进一步研究和改进。
总结：双抗体夹心法是一种基于抗体工程技术的新型免疫治疗方法，通过同时结合两个不同的抗原靶标，激活并增强人体免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。
双抗体夹心法检测步骤
双抗体夹心法检测步骤双抗体夹心法，这个名字听起来像个高大上的科学玩意儿，其实就是一种检测技术，简单易懂，就像做个蛋糕，咔咔咔几步就搞定。
咱们得准备好材料，得有两种抗体，一个“上夹”，一个“下夹”，再加上一个我们想要检测的东西，像什么病毒、细菌之类的。
想象一下，这就像是给一个小小的蛋糕中间夹了个好料，味道才会好嘛。
好啦，第一步，先把那“下夹”抗体放到一个小盘子里。
就像是在蛋糕底下铺一层底座，得稳稳当当的。
把咱们要检测的样本放进去，嘿，这时候就像是在底座上放上了蛋糕的心坎儿，所有的好东西都在里面了。
样本中的目标物质就像小猫扑向小鱼，迫不及待地和“下夹”抗体结合。
这时，咱们得耐心等一会儿，让它们充分“亲热”一下。
等这一步完成后，就得加入“上夹”抗体了。
这个抗体可是个不简单的角色，得好好发挥它的作用。
它就像是“盖子”，把蛋糕的最上层盖上去，确保里面的东西牢牢“锁”住。
然后，再加一些洗涤液，像是在清理蛋糕外边的多余奶油，洗去不必要的东西，让剩下的都清清爽爽。
这一步可得细心，不然蛋糕的形状可就毁了哦。
就得加上一个报告的东西，通常是个酶或者荧光染料，哎呀，想象一下，像是给蛋糕撒上了一层闪闪发光的糖霜，真是美味又诱人。
这些东西跟目标物质结合后，就能通过特定的反应产生颜色变化，或者说是荧光，这就是我们的“信号”，告诉我们“嘿，有东西在这里哦”。
最后一步，咱们就得通过仪器来测量这个信号的强度，越强表示样本中目标物质的含量越高，就像蛋糕越高代表做得越成功。
这时候，咱们的检测就大功告成了。
把所有的数据整理好，形成一份报告，就可以和小伙伴们分享了，大家都来看看这个“美味”的蛋糕，啊不，是这个检测结果。
整个过程听起来是不是简单又有趣？这就像做一顿丰盛的晚餐，得准备好材料，控制好火候，还得注意每一步的细节。
双抗体夹心法，虽然听上去复杂，但其实在生活中处处可见，只要你用心去做，就能成功。
只要我们能掌握好这些小窍门，以后遇到检测再也不怕啦！这技术就像生活中的小帮手，随时随地给你带来便利。
双抗体夹心法实验步骤
双抗体夹心法实验步骤引言双抗体夹心法（Bispecific T-cell Engager, BiTE）是一种新型的免疫治疗策略，能够激活T细胞，使其对恶性肿瘤细胞产生特异性杀伤作用。
该方法利用两种单克隆抗体分别与T细胞和肿瘤细胞表面的抗原结合，形成一个桥梁，从而实现T细胞的选择性激活和肿瘤细胞的杀伤。
本文将详细介绍双抗体夹心法实验的步骤。
材料与方法材料准备1.双抗体夹心法的融合蛋白（可以商购或自行制备）；2.T细胞和肿瘤细胞系（根据需要选择合适的细胞系）；3.细胞培养基和细胞培养所需的添加剂；4.离心管、培养皿、离心机等常规实验仪器。
方法步骤步骤一：培养T细胞和肿瘤细胞系1.将T细胞和肿瘤细胞系分别接种到含有适当培养基和添加剂的培养皿中；2.放置于37°C、5% CO2的培养箱中培养，定期观察细胞的生长情况。
步骤二：表达和纯化双抗体夹心法融合蛋白1.将含有双抗体夹心法融合蛋白的表达载体转染至适当的宿主细胞中；2.观察细胞的转染效率，选择合适的条件进行表达和培养；3.收集细胞培养上清液，使用亲和层析等方法进行双抗体夹心法融合蛋白的纯化。
步骤三：构建双抗体夹心法实验模型1.取一定数量的T细胞和肿瘤细胞，进行细胞计数并调整细胞浓度；2.在离心管中混合适量的T细胞和肿瘤细胞，使其形成一个混合细胞悬液；3.加入适量的双抗体夹心法融合蛋白，使其与T细胞和肿瘤细胞表面的抗原结合。
步骤四：观察和分析实验结果1.将双抗体夹心法实验模型培养一定时间后，观察细胞的形态和数量变化；2.使用流式细胞仪等方法进行细胞表面标记物的检测；3.分析并比较实验组和对照组的结果，评估双抗体夹心法的治疗效果。
结果与讨论通过双抗体夹心法实验步骤的操作，我们可以获得T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用结果，并评估双抗体夹心法作为一种免疫治疗策略的疗效。
根据实验结果的分析，我们可以进一步优化双抗体夹心法的设计和应用，以提高其治疗效果。
结论双抗体夹心法作为一种新型的免疫治疗策略，在恶性肿瘤的治疗中具有很大的潜力。
elisa法类型
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附测定）是一种常用的免疫学检测技术，用于定量或定性分析抗原或抗体。
根据不同的实验设计和应用，ELISA可以分为几种基本类型：1. 双抗体夹心法（Sandwich ELISA）：- 用于检测抗原。
- 包被抗体固定在微孔板上，待检样本中的抗原与包被抗体结合，然后加入酶标记的抗体，形成抗原-包被抗体-酶标记抗体复合物。
- 最后加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析抗原含量。
2. 间接法（Indirect ELISA）：- 用于检测抗体。
- 抗原固定在微孔板上，待检样本中的抗体与抗原结合，然后加入酶标记的抗体，形成抗原-待检抗体-酶标记抗体复合物。
- 最后加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析抗体含量。
3. 竞争法（Competitive ELISA）：- 用于检测小分子抗原。
- 抗原和酶标记的抗原竞争性地与固定在微孔板上的抗体结合。
- 加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析抗原含量。
4. 捕获法（Capture ELISA）：- 用于检测特定的抗原或抗体。
- 抗原或抗体被固定在微孔板上，待检样本中的相应物质与之结合。
- 加入酶标记的抗体或抗原，形成复合物。
- 最后加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析待检物质。
5. 斑点ELISA（Dot-ELISA）：- 类似于间接法，但使用硝酸纤维素膜作为固相载体，适用于检测抗体。
6. 块状ELISA（Block ELISA）：- 类似于双抗体夹心法，但在加入酶标记抗体之前，会加入一块状的抗体，以增强检测的特异性。
这些类型的ELISA可以根据实验的具体需求和条件进行选择和调整。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法是一种重要的治疗手段，它在抗体研究和免疫治疗领域中发挥着重要作用。
本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。
一、双抗体夹心法的原理双抗体夹心法是一种通过结合多个抗体来增强其特异性和亲和力的技术。
它主要由两种抗体构成：第一种是能够选择性结合靶标的单克隆抗体（mAb1），第二种是结合到mAb1的另一种抗体（mAb2）。
mAb1和mAb2之间的结合可以增强mAb1的亲和力和特异性，从而提高治疗效果。
具体来说，双抗体夹心法的原理如下：mAb1选择性地结合到疾病相关的靶标上，如肿瘤细胞表面的特定抗原。
mAb2选择性地结合到mAb1的Fc区域，形成了一个抗体-抗体结构。
通过这种结构，mAb2可以作为受体结合在靶细胞上，从而增强了mAb1的亲和力和特异性。
这种夹心结构有效地增加了抗体与靶标的结合力，提高了治疗效果。
二、双抗体夹心法的应用双抗体夹心法在肿瘤治疗中有广泛的应用。
它可以通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制肿瘤细胞生长和扩散。
此外，双抗体夹心法还可以降低副作用并提高治疗效果。
1. 免疫细胞介导的肿瘤治疗：通过使用双抗体夹心法，可以将免疫细胞与肿瘤细胞紧密结合，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
这种方法有效地促进了肿瘤的消灭，可以作为免疫治疗的一种重要策略。
2. 靶向药物输送：双抗体夹心法可以将药物通过结合到mAb2上，从而实现药物的靶向输送。
这种方法可以减少对正常细胞的毒性作用，提高药物的疗效，并降低药物副作用。
3. 诊断影像学：利用双抗体夹心法可以选择性地结合到患者体内的病变部位，从而实现准确的诊断和影像学观察。
这种方法可以提高疾病的检测率，提供更可靠的诊断依据。
双抗体夹心法的原理和应用使其成为免疫治疗领域的研究热点之一。
随着技术的不断进步和创新，相信双抗体夹心法将在未来的医疗实践中发挥越来越重要的作用。
结语双抗体夹心法是一种利用多抗体结合的技术，通过增强抗体的特异性和亲和力来提高治疗效果。
双抗体夹心荧光免疫层析法
双抗体夹心荧光免疫层析法
双抗体夹心荧光免疫层析法是一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法。
它的原理是利用抗体的标记物（如荧光颗粒）与待测物的络合物在层析时被相应的配体捕获，并显色于硝酸纤维素膜上的检测线。
这种方法主要用于检测多抗原位点的生物大分子，具有操作简单、快速、灵敏度高等优点。
在使用这种方法时，需要根据配套使用的荧光免疫分析仪进行检测，以判定阴性或阳性结果。
双抗体夹心荧光免疫层析法在生物检测领域中应用广泛，为疾病的诊断和预防提供了重要的技术支持。
1双抗体夹心法
双抗体夹心法,属于非竞争联合测定.它是检测抗原最经常运用的ELISA,实用于检测分子中具有至少两个抗原决议簇的多价抗原,而不克不及用于小分子半抗原的检测.其根本工作道理是：运用衔接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决议簇联合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.因为反响体系中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,是以复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在办法可检测规模内).测定复合物中的酶感化于参加的底物后生成的有色物资量(OD值),即可肯定待测抗原含量. 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不合的抗原决议簇联合,则属于双位点夹心法.若采取固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子联合,则是双抗原夹心法.操纵步调：⑴将特异性抗体包被固相载体McAb.孵育一准时光,使形成固相抗体,洗涤除去未联合的抗体和杂质.⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反响,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未联合物资.⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未联合酶标抗体.⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产品,经由过程比色,测标本中抗原的量.现多采取针对单一抗原决议簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样品和酶标抗体可一次性参加,简化流程,缩短反响时光.若标本中待测抗原浓渡过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体联合而不形成上述夹心复合物(相似于免疫沉淀反响中抗原多余时的后带现象),使最终成果低于现实含量(钩状效应),甚至消失假阴性现象.是以对此类标本应恰当稀释后再测定.别的,当血清中消失类风湿因子（RF）时,类风湿因子（RF）可充当抗原,而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而消失假阳性成果.此法是测定抗体最经常运用的办法,属非竞争联合实验.其道理是将抗原衔接到固相载体上,样品中待测抗体与之联合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体联合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,肯定待测抗体含量.操纵步调⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未联合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻拦待检血清中非特异IgG 吸附固相.⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分联合,洗涤除去未联合的非特异抗体及其他血清成分.⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物.⑸加底物显色.间接法因为采取的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),是以该法只须要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各类与抗原响应的抗体,具有更普遍的通用性.3.竞争法竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定,也可反抗体进行检测.其办法和特色是：①酶标识表记标帜抗原（抗体）与样品或尺度体中的非标识表记标帜抗原或抗体具有雷同的与固相抗体（抗原）联合的才能;②反响体系中,固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量,且前者的联合位点少于酶标识表记标帜与非标识表记标帜抗原（抗体）的分子量和;③免疫反响后,联合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或尺度品中非标识表记标帜抗原（抗体）的浓度成反比.操纵步调⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未联合物.⑵参加待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争联合.洗涤除去未联合到固相上的游离酶标抗原及其他未联合物.⑶加底物显色.色彩深浅与待测抗原量成反比.同理,也可用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争联合酶标抗体.待检抗原竞争克制酶标抗体和固相抗原联合,即待检抗原越多,显色越浅.以抗原测定为例,先将特异性抗体衔接于固相载体,分别设置对比管和样品测定管;对比管中仅加酶标抗原,加样后,无非标识表记标帜抗原竞争,酶标抗原即与固相抗体充分联合;而测定管抗原与后者的联合受到克制而削减.加酶底物显色后,对比管因固相抗体上联合的酶标抗原多,显色深,测定管则依被检抗原和酶标抗原竞争联合固相抗体程度不合而显色深浅有异：被检抗原多,酶标抗原与固相抗体联合少,底物显色反响弱,色浅;反之呈色深.即联合于固相的酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相干.盘算测定管与对比管色彩深度（OD值）之差,即可肯定被检抗原量.捕获法（亦称反向间接法）ELISA,重要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定.以今朝最经常运用的IgM测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时消失,则后者可干扰IgM的测定.是以捕获法的工作道理设计为：先将针对IgM的第二抗体（如羊抗人IgMμ链抗体）衔接于固相载体,用以联合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异）,洗涤出去IgG等无关物资,然后参加特异抗原与待检IgM联合;再参加抗原特异的酶标抗体,最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物,加酶底物感化显色后,即可对样品中待检IgM是否消失及其含量进行测定.ELSA法因为测定敏锐.特异.操纵轻便.易于主动化,且无放射性污染等诸多长处,使其不但成为今朝运用最广并且成长最快的一种免疫测定技巧.并且在办法学上的改良和衍化,使其不竭有各具特色的新测定法问世,如运用生物素-亲和素放大体系（biotin-axidin system,BAS）的ELISA;运用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（enzyme linked immunofluorecence assay,ELFIA）,黑点-ELISA（dot-ELISA）和酶联免疫电转移印迹法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB）以及酶联免疫化学发光测定（enzyme linked immunochemiluminescence assay,ELICLA）等.新办法不但进一步进步了测定敏锐.特异性,并且使ELISA技巧在进步主动化程度的同时,也便于单份样本测定和简化装备前提,尤其试用于急诊.社区诊所及家庭化验.膜载体的酶免疫测定固相膜免疫测定（solid phase membrane-based immuoassay ）与固相酶免疫测定（ELISA）相相似,其特色是以微孔膜作为固相.标识表记标帜物可用酶和各类有色微粒子,如黑色乳胶.胶体金.胶体硒等,以红色的胶体金最为经常运用.固相膜的特色在于其多孔性,像滤纸一样.固相膜可被液体穿过流出,液体也可以经由过程毛细管感化在膜上向前移行.运用这种机能树立了两种不合类型的快速检测办法.经常运用的固相膜为硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜.㈠黑点酶免疫吸附实验黑点-ELISA（dot-ELISA）实验道理与通例的ELISA雷同,不合之处在于黑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜,此外酶感化底物后形成有色的沉淀物,使NC染色实验办法为：加少量（1~2μl）抗原于膜上,因为NC膜吸附才能强,故需在湿润落后行封闭;然后滴加样品血清,个中的待检抗体即与NC膜上抗原联合;洗涤后再滴加酶标二抗,最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP标识表记标帜物,经常运用二氨基联苯胺）;阳性者即可在膜上消失肉眼可见的染色黑点.黑点-ELISA的长处为：NC膜吸附蛋白力强,微量抗原吸附完整,故检出敏锐度可较通俗ELISA高6~8倍;试剂用量教ELISA勤俭约10倍;操纵简略,实验及成果断定不需特别装备前提;吸附抗原（抗体）或已有成果的NC膜可长期保管（-20℃可长达半年）,不影响其活性.㈡免疫渗滤实验免疫渗滤实验（IFA）的基起源基本理是：一硝酸纤维素（NC）膜为载体,运用微孔滤膜的可滤过性,使抗原抗体反响和洗涤在一特别的渗滤装配上以液体渗滤过膜的方法敏捷完成.免疫渗滤实验最初是从黑点ELISA基本上成长树立起来的,运用的联合物是酶标识表记标帜的.20世纪90年月初成长了以胶体金为标识表记标帜物的金免疫渗滤实验（GIFA）,省却了酶对底物的反响,加倍简略.快速.渗滤装配是IFA中的重要试剂成分之一,由塑料小盒.吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分著称.塑料小盒可所以多种外形的,盒盖的中心有一向径约为0.4~0.8cm的小圆吸孔,盒内垫放吸水塑料,NC膜片安顿在正对盒盖的圆孔下,慎密封闭盒盖,是NC膜片贴紧水塑料.如斯即制备成一渗滤装配.全部反响进程都在渗滤装配中进行,是以又常称位扁平长方形渗滤装配为反响板.以双抗体夹心HCG为例,于小孔内滴加标本1~2滴,待完整渗入.此时标本中的HCG与NC膜上的抗βHCG相联合.再于小孔内滴加联合物试剂1~2滴,待完整渗入,金标识表记标帜的抗αHCG抗体与NC膜上的HCG形成双抗体夹心复合物.因胶体金为红色,在NC 膜上消失红色黑点.在膜中心有清楚的淡红色或红色黑点显示者断定为阳性反响;反之,则为阴性反响,黑点呈色的深浅响应地提醒阳性强度.有将包被黑点由圆点式改成短线条式的：质控黑点横向包被成横线条,如“－”‘反响黑点纵向包被成竖线条,如“│”;两者订交成“+”.如许,阳性反响成果在膜上显示红色的正号（+）,阴性成果则为负号（－）,目视断定直不雅.清楚明了.㈢免疫层析实验免疫层析实验（ICA）是继IFA之后反站起来的另一种膜固相免疫测定.与IFA运用微孔膜的过滤机能不合,ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管感化向另一端移动,如同层析一般.移动进程中被剖析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体联合而被固相化,无关物资则超出该区域而被分别,然后经由过程标识表记标帜物的显色来剖断实验成果.以胶体金为标识表记标帜物的实验称为金免疫层析实验（GICA）.ICA中所用的试剂全体为干试剂,它们被组合在一试剂条上.试剂条的底版为一单面胶塑料片,A.B 两头粘贴有吸水材料.加样端A为样品垫,可用的材料有滤纸.多孔聚乙烯和玻璃纤维等,按剖析物和试剂的不合选择适合的材料.B 端为吸水垫,材料则为吸水性强的滤纸为佳.G处为联合物垫,胶体金联合物湿润固定在玻璃纤维膜等材料上.G.B之间粘贴吸附有抗原或抗体的硝酸纤维素膜,抗原或抗体往往以直线的情势包被在膜上.一双抗体夹心法测HCG为例.试条中G处为金标识表记标帜的抗αHCG,NC膜上T处包被抗βHCG,C处包被抗小鼠IgG抗体.测试时在A端加尿液（或将A端浸入尿液中）,经由过程层析做HCG-HCG复合物;移行至T区,形成金-抗α-HCG-HCG-抗βHCG复合物,在T区显示红色线条,为阳性反响.多余的金标识表记标帜抗αHCG 移行至C区时被抗小鼠IgG抗体捕获,而显示出红色对比线条.如尿液中不含HCG,在T区不消失红色线条,仅在C区消失红色线条,实验成果为阴性.如C区无红色线条消失,暗示实验无效.双抗体夹心法⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产品,经由过程比色,测标本中抗原的量.双位点一步法操纵步调⑴将1个McAb与固相载体联络,形成固相McAb.洗涤除去未联合物.⑵同时参加待测标本和酶标McAb,孵育,使待检抗原和固相McAb及酶标McAb反响形成双抗体夹心复合物.洗涤除去未联合物.⑶加底物显色.间接法操纵步调⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未联合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻拦待检血清中非特异IgG 吸附固相.⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分联合,洗涤除去未联合的非特异抗体及其他血清成分.⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物.⑸加底物显色.双抗原夹心法操纵步调⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未联合物.⑵参加待检标本,孵育,使待检抗体和固相联合.洗涤除去未联合物.⑶参加酶标抗原,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物.洗涤除去未联合物.⑷加底物显色.竞争法操纵步调⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未联合物.⑵参加待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争联合.洗涤除去未联合到固相上的游离酶标抗原及其他未联合物.⑶加底物显色.色彩深浅与待测抗原量成反比.同理,也克用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争联合酶标抗体.待检抗原竞争克制酶标抗体和固相抗原联合,即待检抗原越多,显色越浅.。
elisa双抗体夹心法原理
elisa双抗体夹心法原理
Elisa双抗体夹心法是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断
中的免疫分析方法。
该方法基于酶标记抗体-抗原-抗体反应原理，能够检测并定量分析样品中特定抗原的存在和浓度。
在Elisa双抗体夹心法中，首先需要将待测样品加入到涂有特
定抗体的微孔板中，使抗原与抗体发生特异性结合。
然后加入酶标记的第二抗体，并进行孵育，使其与未结合的抗原发生特异性结合。
随后，通过洗涤步骤将未结合的物质去除，只留下结合了酶标记抗体的复合物。
在样品中加入底物后，酶标记的第二抗体会催化底物发生化学反应，产生可检测的信号。
通过测量反应产物的光强度，可以间接地评估待测样品中抗原的浓度。
Elisa双抗体夹心法的灵敏度高、特异性强，且操作相对简便。
它广泛应用于疾病的诊断、药物研发、生物学研究等领域。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
１。
双抗体夹心法双抗体夹心法,属于非竞争结合测定、它就是检测抗原最常用得ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇得多价抗原,而不能用于小分子半抗原得检测。
其基本工作原理就是:利用连接于固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体—抗原－酶标抗体免疫复合物。
由于反应系统中固相抗体与酶标抗体得量相对于待测抗原就是过量得,因此复合物得形成量与待测抗原得含量成正比(在方法可检测范围内)、测定复合物中得酶作用于加入得底物后生成得有色物质量(OＤ值),即可确定待测抗原含量、若固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同得抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法。
若采用固相载体上得抗原与酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则就是双抗原夹心法、操作步骤:⑴将特异性抗体包被固相载体MｃAb。
孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合得抗体与杂质。
⑵加待检标本,孵育,使标本中得抗原与固相载体上得抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物、洗涤除去其她未结合物质。
⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。
洗涤除去未结合酶标抗体。
⑷加底物显色。
固相上得酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原得量、现多采用针对单一抗原决定簇特异性得单克隆抗体做固相化与酶标抗体,则受检样品与酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间、若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体与固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时得后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象。
因此对此类标本应适当稀释后再测定。
另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体—类风湿因子－酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果、２。
间接法此法就是测定抗体最常用得方法,属非竞争结合试验、其原理就是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原—受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体得抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中得抗体结合,形成固相抗原-受检抗体—酶标二抗复合物,测定加底物后得显色程度,确定待测抗体含量。
操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。
洗涤除去未结合得抗原及杂质。
⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异ＩgＧ吸附固相。
⑶加待检血清,孵育,使固相抗原与待检抗体充分结合,洗涤除去未结合得非特异抗体及其她血清成分。
⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原－待检抗体-酶标抗抗体(或酶标ＳPA)复合物。
⑸加底物显色、间接法由于采用得酶标二抗就是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgＧ),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应得抗体,具有更广泛得通用性。
3、竞争法竞争法ＥLISA可用于抗原与半抗原得定量测定,也可对抗体进行检测。
其方法与特点就是:①酶标记抗原(抗体)与样品或标准体中得非标记抗原或抗体具有相同得与固相抗体(抗原)结合得能力;②反应体系中,固相抗体(抗原)与酶标抗原(抗体)就是固定限量,且前者得结合位点少于酶标记与非标记抗原(抗体)得分子量与;③免疫反应后,结合于固相载体上复合物中被测定得酶标抗原(抗体)得量(酶活性)与样品或标准品中非标记抗原(抗体)得浓度成反比。
操作步骤⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体、洗涤除去未结合物。
⑵加入待检标本与酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争结合。
洗涤除去未结合到固相上得游离酶标抗原及其她未结合物。
⑶加底物显色。
颜色深浅与待测抗原量成反比。
同理,也可用固相抗原与酶标抗体作试剂,使固相抗原与标本中得待检抗原竞争结合酶标抗体。
待检抗原竞争抑制酶标抗体与固相抗原结合,即待检抗原越多,显色越浅。
以抗原测定为例,先将特异性抗体连接于固相载体,分别设置对照管与样品测定管;对照管中仅加酶标抗原,加样后,无非标记抗原竞争,酶标抗原即与固相抗体充分结合;而测定管抗原与后者得结合受到抑制而减少。
加酶底物显色后,对照管因固相抗体上结合得酶标抗原多,显色深,测定管则依被检抗原与酶标抗原竞争结合固相抗体程度不同而显色深浅有异:被检抗原多,酶标抗原与固相抗体结合少,底物显色反应弱,色浅;反之呈色深。
即结合于固相得酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相关、计算测定管与对照管颜色深度(ＯＤ值)之差,即可确定被检抗原量。
4。
捕获法捕获法(亦称反向间接法)EＬISA,主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IｇM)得测定。
以目前最常用得IgM测定为例,因血清中针对某种抗原得特异性IgＭ与IgG同时存在,则后者可干扰IgM得测定、因此捕获法得工作原理设计为:先将针对IgM得第二抗体(如羊抗人IｇMμ链抗体)连接于固相载体,用以结合(“捕获”)样品中所有IgM(特异或非特异),洗涤出去IgG等无关物质,然后加入特异抗原与待检IｇM结合;再加入抗原特异得酶标抗体,最后形成固相二抗－ＩgM—抗原－酶标抗体复合物,加酶底物作用显色后,即可对样品中待检ＩgＭ就是否存在及其含量进行测定。
5。
其她ELSAELSＡ法由于测定灵敏、特异、操作简便、易于自动化,且无放射性污染等诸多优点,使其不仅成为目前应用最广而且发展最快得一种免疫测定技术。
而且在方法学上得改进与衍化,使其不断有各具特点得新测定法问世,如应用生物素－亲与素放大系统(ｂiｏtiｎ—axｉdin system,ＢAS)得ELＩSA;利用酶催化底物发荧光得酶联免疫荧光测定(eｎｚｙmｅlinkeｄiｍmunoflｕoreceｎce aｓｓａy,EＬＦIＡ),斑点—EＬISA(dot-ＥLＩSA)与酶联免疫电转移印迹法(ｅｎｚyｍe lｉnkｅd imｍunoelectrotｒanｓfｅｒblot,EITB)以及酶联免疫化学发光测定(enzyme lｉｎｋeｄｉmmunochemiｌｕｍinescｅnce asｓａy,EＬICLA)等、新方法不仅进一步提高了测定灵敏、特异性,而且使ELISA技术在提高自动化程度得同时,也便于单份样本测定与简化设备条件,尤其试用于急诊、社区诊所及家庭化验、膜载体得酶免疫测定固相膜免疫测定(solid phase membｒane—ｂased immuoasｓaｙ)与固相酶免疫测定(EＬIＳA)相类似,其特点就是以微孔膜作为固相。
标记物可用酶与各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金、胶体硒等,以红色得胶体金最为常用。
固相膜得特点在于其多孔性,像滤纸一样。
固相膜可被液体穿过流出,液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行、利用这种性能建立了两种不同类型得快速检测方法、常用得固相膜为硝酸纤维素(nｉtｒoｃeｌlulose,NC)膜。
㈠斑点酶免疫吸附试验斑点-ＥＬISA(doｔ－ELISA)实验原理与常规得EＬISA相同,不同之处在于斑点-ELＩSA所用载体为蛋白质具有极强吸附力(近１00%)得硝酸纤维素(ＮC)膜,此外酶作用底物后形成有色得沉淀物,使NC染色实验方法为:加少量(１～2μｌ)抗原于膜上,由于NC膜吸附能力强,故需在干燥后进行封闭;然后滴加样品血清,其中得待检抗体即与NC膜上抗原结合;洗涤后再滴加酶标二抗,最后滴加能形成不溶有色物得底物溶液(如HRＰ标记物,常用二氨基联苯胺);阳性者即可在膜上出现肉眼可见得染色斑点。
斑点-ELＩSA得优点为:NC膜吸附蛋白力强,微量抗原吸附完全,故检出灵敏度可较普通ELＩＳA高6~8倍;试剂用量教ELISA节约约1０倍;操作简单,实验及结果判断不需特殊设备条件;吸附抗原(抗体)或已有结果得NC膜可长期保存(—2０℃可长达半年),不影响其活性。
㈡免疫渗滤实验免疫渗滤实验(IＦＡ)得基本原理就是:一硝酸纤维素(NC)膜为载体,利用微孔滤膜得可滤过性,使抗原抗体反应与洗涤在一特殊得渗滤装置上以液体渗滤过膜得方式迅速完成。
免疫渗滤实验最初就是从斑点ELISA基础上发展建立起来得,应用得结合物就是酶标记得。
20世纪9０年代初发展了以胶体金为标记物得金免疫渗滤实验(GＩFA),省却了酶对底物得反应,更加简单、快速。
渗滤装置就是IFA中得主要试剂成分之一,由塑料小盒、吸水塑料与点加了抗原或抗体得硝酸纤维素膜片三部分著称、塑料小盒可以就是多种形状得,盒盖得中央有一直径约为０.４～０、8cm得小圆吸孔,盒内垫放吸水塑料,NＣ膜片安放在正对盒盖得圆孔下,紧密关闭盒盖,就是ＮＣ膜片贴紧水塑料。
如此即制备成一渗滤装置。
整个反应过程都在渗滤装置中进行,因此又常称位扁平长方形渗滤装置为反应板、以双抗体夹心ＨCG为例,于小孔内滴加标本１～2滴,待完全渗入。
此时标本中得HCＧ与NC膜上得抗βHCG相结合。
再于小孔内滴加结合物试剂１~2滴,待完全渗入,金标记得抗αＨCG抗体与NＣ膜上得HCG形成双抗体夹心复合物、因胶体金为红色,在ＮC膜上出现红色斑点。
在膜中央有清晰得淡红色或红色斑点显示者判断为阳性反应;反之,则为阴性反应,斑点呈色得深浅相应地提示阳性强度。
有将包被斑点由圆点式改成短线条式得:质控斑点横向包被成横线条,如“－"‘反应斑点纵向包被成竖线条,如“│";两者相交成“+”。
这样,阳性反应结果在膜上显示红色得正号(+),阴性结果则为负号(－),目视判断直观、明了、㈢免疫层析实验免疫层析实验(ICA)就是继IFA之后反站起来得另一种膜固相免疫测定。
与IFA利用微孔膜得过滤性能不同,ＩCA中滴加在膜一端得样品溶液受膜得毛细管作用向另一端移动,犹如层析一般。
移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域得抗原或抗体结合而被固相化,无关物质则越过该区域而被分离,然后通过标记物得显色来判定实验结果。
以胶体金为标记物得实验称为金免疫层析实验(GＩCA)。
ＩCＡ中所用得试剂全部为干试剂,它们被组合在一试剂条上。
试剂条得底版为一单面胶塑料片,A、B两端粘贴有吸水材料。
加样端A为样品垫,可用得材料有滤纸、多孔聚乙烯与玻璃纤维等,按分析物与试剂得不同选择合适得材料。
Ｂ端为吸水垫,材料则为吸水性强得滤纸为佳、Ｇ处为结合物垫,胶体金结合物干燥固定在玻璃纤维膜等材料上。
G、B之间粘贴吸附有抗原或抗体得硝酸纤维素膜,抗原或抗体往往以直线得形式包被在膜上、一双抗体夹心法测HCＧ为例。
试条中G处为金标记得抗αHＣG,NＣ膜上T处包被抗βＨCG,C处包被抗小鼠IｇG抗体。
测试时在A端加尿液(或将A端浸入尿液中),通过层析做ＨCG－ＨCG复合物;移行至T区,形成金-抗α－HCG-HCＧ-抗βＨＣＧ复合物,在T区显示红色线条,为阳性反应、多余得金标记抗αHCG移行至Ｃ区时被抗小鼠ＩgG抗体捕获,而显示出红色对照线条。