基因工程常用技术

（一）基因组文库的建立
cDNA文库：从某一生物或特定器官和组织中 获得的总DNA，经反转录产生cDNA，以 cDNA构建的克隆群体就叫这种生物（或器官 和组织）的cDNA文库。
主要优点：⑴筛选目的基因较容易，因为一个 完全cDNA基因文库所含的克隆数，比一个完 全的基因组DNA文库所含的克隆数要少的多⑵ cDNA克隆中不存在内含子序列，这有利于在 原核细胞中表达。
Southern杂交
图.Southern转移和分子杂交的过程
Northern杂交
又称RNA印迹技术，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到NC滤膜上进行杂交的一项技术。
由J.C.Alwinex等在1979年建立 它与Southern杂交十分相似，不同之处只是从
凝胶中转移到滤膜的是RNA而不是DNA 类似的转移蛋白质的方法叫Western杂交 应用Northern杂交技术可以了解特定基因的表
转染：转化的特殊形式，是用离体状态的噬菌体、 病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成
❖ 关键：①受体细胞是否处于感受态。诱导方法 为：快速生长的细菌+0℃、CaCl2低渗溶液→ 细胞肿胀呈球状（感受态）+DNA→吸附 +42℃短暂处理+MgCl2→吸收②为防止限制， 提高转化效率，可选用无限制作用的突变体。
达情况。
原位杂交
在Southern杂交技术的基础上发展起来的
菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中 的菌落印迹到NC滤膜上，溶菌，使变性的 DNA与滤膜牢固结合。然后按照Southern杂交 的方法进行分子杂交和显影。常用于目的克隆 （菌落）的筛选。（见下图）
细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品， 步骤包括组织固定、脱水、石蜡包埋和切片。 转移至滤膜并在原位进行杂交，放射性同位素 标记的DNA或RNA探针与待测DNA的互补配 部位，可通过放射性自显影显示出来。
第十四章 基因工程常用技术
教学目的和要求
1. 了解基因工程常用技术 2. 掌握细菌的转化和转染 3. 理解定点突变的诱发因素 4. 掌握核酸分子杂交 5. 理解PCR技术 6. 理解DNA序列分析方法 7. 了解基因组文库的构建方法
基因工程常用技术
①凝胶电泳 ②细菌的转化和转染 ③核酸分子杂交 ④定点突变 ⑤PCR ⑥RFLP ⑦RAPD ⑧DNA序列分析 ⑨目的基因的分离和转基因植物、转基因动物等
DNA分子（来源不同）；基因组DNA（不同 生物）→长度不同的限制性片段。对于一种酶 和一种DNA来说，所产生的限制性片段都是 特异的，所以，这些片段的电泳图谱可以作为 这种DNA的“指纹”，故又叫指纹分析。
RAPD：随机扩增多态性，用于DNA“个性”
DNA样品→PCR扩增→得到一组数目及长度 不同的DNA片段→电泳，EB染色→电泳图谱
优点和问题：可对痕量DNA进行大量扩增。 TagDNA聚合酶复制忠实性差，错误掺入率为 2×10-4，30轮后可达0.25%，比Klenow酶高4 倍。
应用 ①gene扩增②探针制备③临床④法医学
RFLP和RAPD技术
RFLP：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism）
待测片段克隆到M13载体上，其优点①制备 足够的DNA片段②使用一种通用引物③M13 复制产生的单链DNA释放到细胞外。
目的基因的分离
通常是先建立基因文库，然后从基因文库中筛 选和鉴定含目的基因的克隆。
基因文库（gene library）：是指含有插入片 段的重组体DNA分子的一个集合体，这些分 子加在一起就构成了一个生物体的整个基因组。
定点突变的诱发
▪ 这项技术是加拿大的M.Smith70年代创造，获 1993年诺贝尔化学奖。
▪ 也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。 即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸酶、 诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将预先确 定的碱基改变引入人工合成的寡核苷酸再组入 基因中，然后将已知缺失、插入、碱基替换、 移码等不同类型的突变基因导入受体细胞，再 进行选择、分析突变表型。
➢ 这里仅介绍寡核苷酸定点突变
寡核苷酸定点突变
原理及步骤
核酸分子杂交
1968年由Boy Britten等人发明 原理：DNA或RNA（带互补的特定核苷酸序
列）→混合（退火）→同源区段形成双链结 构→杂种核酸分子（来源不同） 类型：Southern杂交；Northern杂交；原位 杂交（boltting） Southern杂交：将电泳凝胶中的DNA片段转 移并结合在适当ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ滤膜上，然后通过同DNA 或RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图
技术。
凝胶电泳：
分辨DNA范围 琼脂糖凝胶 几百-2万bp
使用浓度 0.3-2.0%
聚丙烯酰胺凝胶 6-1000bp
3-20%
凝胶电泳制备方法：
样品制备→凝胶制备→电泳→染色→观察。应 用于分析；纯化。
细菌的转化和转染
转化：指受体细胞从周围介质总共吸收外来 DNA片段，使其基因型和表型发生相应变化
DNA序列分析
Maxam-Gilbert和W.Gilbert建立 基本原理：DNA片段（末端带有放射性标记）
→特定位点断裂→一组长度不同的片段→电泳 自显影X光片上显示谱带→读出DNA碱基顺序。 步骤：化学降解时，将DNA样品分为四份，放 入不同的反应系统中。见下图
双脱氧-M13体系DNA序列分析法
需要：引物（一对）；酶（如TagDNA聚合 酶）；dNTP ；缓冲液；水（超纯水）
PCR扩增的几个方面
关于扩增参数：①启动温度②循环 “变性” （94℃；30′）→“退火”（温度由引物确定； 30′）→“延伸”（72℃；时间由扩增的长度而 定）。注：退火温度[±4×(G+C)+2(A+T)]③ 循环次数 25~30次④最后延伸时间要长一些。
PCR技术
PCR：polymerase chain reaction的缩写 叫做聚合酶链式反应技术 1985年，美国Kerry Mullis发明 荣获1993年诺贝尔化学奖 原理：引物延伸反应产生的子链DNA经热变
性为单链后，有可作为模板，在引物和DNA 聚合酶的作用下指导新的子链的合成。