放射性配体受体结合实验方法介绍重点
受体与配体结合试验的测定方法
受体与配体结合试验的测定方法直接测定法：1. 放射性同位素法（Radioligand Binding Assay）：这种方法通过使用放射性同位素标记的配体来测定受体与配体结合的情况。
标记的配体包含一种放射性同位素，如3H或125I。
实验中，将放射性标记的配体加入到含有受体的体外反应体系中，然后通过测定结合与非结合配体的量来计算受体与配体的结合亲和力。
这种方法常用于研究受体的亲和力、结合位点及受体的浓度。
2. 荧光共振能量转移法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）：FRET基于两个荧光标记的分子之间的能量转移。
通过在受体和配体的分子中标记荧光染料，并在荧光染料的发射和捕获波长上进行测量，可以确定受体和配体之间的相互作用及结合状态。
这种方法的优势是能够在活细胞或组织中进行实时监测。
间接测定法：1. 生物活性测定法（Bioassay）：这种方法通过研究受体与配体结合后的生物学效应来间接测定受体与配体的结合情况。
例如，可以通过测定细胞增殖、酶活性、信号传导通路等生物学效应来评估受体与配体之间的结合情况。
这种方法的优势是可以直接测定受体配体的生物学活性，但缺点是无法精确测定结合亲和力。
2. 反应动力学分析法（Kinetic Analysis）：这种方法通过测定受体与配体结合过程中的动力学参数来间接测定结合情况。
例如，可以使用BIAcore系统等生物传感器技术来实时监测受体和配体之间的结合和解离过程，并从中得到结合速率常数、解离速率常数等动力学参数。
这种方法的优势是可以测定结合反应速率和平衡常数，但需要专门的仪器设备。
此外，还有一些衍生的测定方法，如表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、放大荧光极化法（Amplified Fluorescent Polarization Assay, AFP）等，这些方法广泛应用于生物医学研究中。
受体的放射配体结合分析法【58页】
（三） 受体亚型
受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在 一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物 学上具有不同的效应。
1、用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂 （拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择 性。如，对于α肾上腺受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩 的用较拮弱抗（作α用2）强，（而α1育）亨，宾对则胃相肠反道。平滑肌舒张的拮抗作 2、用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某 些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力， 但是亲和力不同。
细胞核、浆 、膜 3.受体的增溶和进一步纯化
沉淀：完整细胞、核受体
图8.10 分离细胞组分的一般方法
四、温育 条件
缓冲液
通过多次预实验确定 某个受体的最适离子 强度和pH
时间与温度
最适的时间为完全平 衡时间
温度根据目的不同而 不同（0—37OC）
结合配体和游离配体的分离
目 的 ： B/F的 分 离 ， 一般RIA的分离方法可用于RBA 注意配体与受体的解离速度
5、 识别能力（Recognition）和生物效应一致性
受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万 生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的 生理（药理）效应相一致。表现在：（1）、在组织分 布上的一致。（2）、在浓度上的一致。受体主要存在 于相应配体发挥生理或药理效应的器管，称之为靶器管。 有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则 有明显的器管专一性。配体和受体结合的有效浓度通常 也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。
图8.8 Scatchard作图中的正负协同作用 （1） 无协同作用；（2）负协同作用；（3）正协同作用
放射性配体与受体结合分析实验方法
放射性配体与受体结合分析实验方法放射性配体与受体结合分析方法（Radioligand Binding Assay，RBA）是一种常用的生物化学实验方法，用于研究受体与其配体之间的结合亲和性和数量。
该方法通过标记配体的放射性同位素来实现，可以精确测定受体与配体之间的亲和力。
RBA方法的原理是将受体样品与放射性标记的配体一起孵育，使二者发生结合。
非结合的配体随后通过洗涤的步骤去除，然后测定剩余的结合复合物中的放射性信号。
根据放射性信号的强度，可以计算出受体与配体结合的比例和结合亲和力。
RBA方法需要一些实验材料和设备，包括放射性标记的配体、受体样品、未标记的配体（用于测定非特异性结合）、放射性检测设备（例如放射计或闪烁计数器）以及用于孵育和洗涤的缓冲液。
实验步骤一般包括以下几个关键步骤：1.准备标记配体：将配体与放射性同位素结合，这通常涉及到将配体与放射性同位素联结的化学反应。
常用的放射性同位素包括^3H（氚）和^125I（碘）等。
此步骤需要进行放射性安全操作。
2.孵育样品：将受体样品与标记配体一起在适当的缓冲液中孵育。
孵育条件（温度、时间等）需根据具体受体和配体的特性进行优化。
3.洗涤步骤：通过洗涤去除未结合的配体。
洗涤步骤可以进行多次，以确保只保留结合复合物。
这一步骤是为了去除非特异性结合而采取的，可以使用高浓度的未标记配体等进行竞争性结合。
4.结合复合物的测定：将洗涤后的样品放入放射性检测设备中，测定放射性信号的强度。
放射性信号的强度与结合复合物的量成正比，可以通过标准曲线或计算公式来计算受体与配体的结合亲和力。
RBA方法具有一些优点和应用前景。
首先，该方法可以在体外定量测定受体与配体之间的结合亲和力。
这对于研究生物体内的受体配体相互作用具有重要意义。
其次，该方法具有高灵敏度，能够测定非常低浓度的受体或配体。
此外，RBA方法还可以用于筛选新药物的受体结合亲和性，以及衡量药物对受体的亲和力的影响。
放射配体受体结合试验方法与技术
第五节放射配体受体结合实验方法与技术一、基本概念1、受体（receptor）一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。
2、配体（ligand）能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。
3、判断受体的标准真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。
4、受体的基本分类化学门控离子通道受体；G蛋白耦联受体。
5、受体调节的方式1）共价调节（covalent modification）尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。
以乙酰胆碱受体为例，细胞内c AMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加8～10倍。
2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。
3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。
由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。
4）链锁反应（receptor cascades）另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。
称之为放大性的链锁反应。
二、放射配体结合法的应用领域1、阐明药物作用机制；2、新药设计和药物筛选；3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；4、测定组织或血液中药物浓度；5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。
三、放射受体结合实验技术简介1、放射配体的选择需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。
放射性配体受体结合实验方法介绍重点
TG 作用 , 这与袁淑云等[1,3]报道用家兔作为降脂试验动物的结果是一致的。
本次试验同时显示纳豆胶囊毒理学两阶段毒性实验结果为阴性 , 表明此胶囊为实际无毒物质。
参考文献 :[1]袁淑云 . 纳豆激酶粗提液对小鼠实验性高脂血症的降脂作用 . 现代医院 ,2005,15:10212.[2]武井直树 , 李麒 . 纳豆在保健和医疗上的应用价值 . 中国微生态学杂志 ,2002,14:2432246.[3]段智变 , 江晓 , 江汉湖 . 纳豆粗提物抗兔高脂血症及抗氧化作用的研究 . 营养学报 ,2004,26:2962299.[4]刘宇峰 , 王金英 , 孙岸 , 等 . 纳豆激酶制剂—恩开胶囊的生产工艺中试研究 . 生物技术 ,2000,10:48249.(收稿日期 :2006-11-15中图分类号 :R144文献标识码 :B文章编号 :1002-3127(2007 03-0231-02・方法研究・放射性配体受体结合实验方法介绍班婷婷 , 吴强恩 , (复旦大学公共卫生学院 ,关键词 :放射性配体受体结合法 ; 经验介绍 ; 作者简介 :班婷婷 , 硕士研究生 , 研究方向 :农药毒理学。
assays , RRA , RRA 系统时 , 恼 , 现根据我们实验室多年的经验 , 将部分内容方法操作步骤报道如下 , 以供同行参考。
1受体标本的制备和保存一般有差速离心和蔗糖密度梯度离心 , 前者较为常用。
应在脱离正常供血环境后迅速在 0~4℃条件下匀浆。
有报道 , 脑组织标本切成小块后以原状态冻存于-70℃ ~-80℃ , 能保存 6个月以上 , 或者将组织块或所需组织的悬浮液保存在 -70℃可保存 6个月 , 受体不失活 [122]。
2降低非特异性结合的方法我们用组织提取受体进行 3H 2G ABA (γ2氨基丁酸实验时 , 吸附在滤纸上的游离型标记配体的含量较多 , 非特异性结合很高 , 可考虑如下几方面降低其含量 :(1 加样顺序 :最好先加膜受体饱和管以壁减少3H 2G ABA 在管壁上的吸附。
放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
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内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
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实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
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实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
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低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
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数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机 GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
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电热恒温水温箱
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实验材料与仪器
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实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
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RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
受体的放射配体结合分析法
通常按C区和染色体DNA结合的结构特征，将核 受体分为三类： 1、 糖皮质激素受体类 包括糖皮质激素受体 （GCR）、盐皮质激素受体（MR）、孕激素受 体（PR）及雄激素受体（AR）等。 2、 甲状腺激素受体类 包括甲状腺激素受体 （ TR ）、维生素 D3 受体（ VDR ）、维甲酸受体 （RAR）及维甲酸X受体（RXR）等。 3、 雌激素受体类 主要为雌激素（ER）。
（三） 受体亚型
受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在 一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物 学上具有不同的效应。 1 、用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂 （拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择 性。如，对于α肾上腺受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩 的拮抗作用强（ α1 ），对胃肠道平滑肌舒张的拮抗作 用较弱（α2），而育亨宾则相反。 2、用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某 些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力， 但是亲和力不同。 3、用分子生物学技术可观察到，同一种受体的不同亚 型的分子结构类似，但基因的编码和氨基酸序列有一 定的差异。
第八章 受体的放射配体结合分析法
第一节概述 受体（Receptor）
细胞膜上或细胞内的一些与生物活性物质相互作用并引 起特异性生物效应的大分子。
一、受体的分类及亚型
在细胞内的定位可将受体分为膜受体、核受体 （一） 膜受体（membrane receptors） 由胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分组成，配体在 细胞外侧同受体的胞外部分或跨膜部分上的特定 结合位点结合后，受体的分子构型发生变化，通 过膜内部分启动相应的信息传递机制，引起细胞 功能变化。根据受体的分子结构和受体后信息传 递方式，膜受体又分为四种：
5、 识别能力（Recognition）和生物效应一致性 受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万 生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的 生理（药理）效应相一致。表现在：（ 1）、在组织分 布上的一致。（ 2 ）、在浓度上的一致。受体主要存在 于相应配体发挥生理或药理效应的器管，称之为靶器管。 有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则 有明显的器管专一性。配体和受体结合的有效浓度通常 也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。 6、 需具有内源性配体 一般受体都有内源性配体，如果通过外源性配体发现某 种蛋白分子具有类似受体的结合特性，但未能找到内源 性配体，则称之为孤儿受体（ Orphan receptor ），还 不能看做肯定是真正的受体。
受体与配体结合试验的测定方法
【实验方法】
2. RRA实验加样： • RRA实验加样，依表中所列顺序加入试管。P2制 备物最后加，每个测定点都取双复管平行实验。 • 每个配基浓度有4管，两个总结合管T（取平均 值），两个非特异性结合管N（取平均值）；做6 个浓度（见表2），所以共有24管，注意加样顺 序，见表1：
【实验方法】
【实验方法】
1. 脑P2部分（吗啡受体粗膜）制备：（实验老师事 先已完成） • 大鼠断头处死，取出全脑，弃去小脑，清除表面 的脑膜及血管。称重后加10倍体积Tris-HCl溶液， 用玻璃匀浆器研碎，制成10％匀浆。4℃，1000g 离心10分钟，弃去沉淀。上清离心16000g，4℃20 分钟后保留沉淀。加50mM Tris-HCl缓冲液混悬 均匀，30℃保温30分钟，以去除内源性阿片样物 质，再次离心16000g，4℃20分钟。保留沉淀并将 其混悬于50mM Tris-HCl缓冲液中。使其蛋白浓度 为16.7mg/ml，然后分装，置－20℃冰箱保存备用。 此制备物即为阿片受体粗膜（P2）。
f相应浓度总计数总结合量总计数b相应浓度特异性结合量总计数总计数cpm相应浓度nm总结合tcpm非特异结合ncpm特异结合scpm游离配基浓度fnm特异结合的配基浓度bnm实验结果与分析绘图
中国协和医科大学药理学实验
放射配体受体结合实验
Radio-ligand Receptor Binding Assay
【实验结果与分析】
绘图： （1）饱和曲线：见图4 • B为纵坐标，F为横坐标，计算出总结合，非特 异结合，特异性结合，作图即可得到受点结合 曲线。 （2）Scatchard作图：见图5 • B/F为纵坐标，B为横坐标绘制Scatchard图形， 所得图形为双曲线，用电子计算机绘图，找出 渐近线，分别算出高低亲和力结合的最大结合 数量KD值。
放射性配体受体结合试验
放射性配体受体结合试验1、定义:放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassay of receptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。
2、原理:1）、放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。
2）、放射配基与受体制备物（含受体的组织或细胞制备物）作用时，其结合形式有两种，一种是配基与受体的特异性结合，其特点是亲和力高；且由于受体有限，故具有饱和性。
另一种是配基与受体制备物的非受体分子的结合，称为非特异性结合。
其特点是亲和力低但结合点多，不易饱和。
用放射性配基研究特异性受体时，必须设法减除非特异性结合。
一般采用的方法是制备总结合管和非特异结合管，两者计数之差即为特异性结合量。
总结合管：将放射性配基与受体制备物反应，除去游离的放射性配基，测定结合的放射性配基的计数，（其中包含特异性结合与非特异性结合，称为总结合）。
非特异性结合管：将大量（一般为500－1000倍）非标记特异性配基与标记的放射性配基相混，然后共同与受体制备物反应。
由于非标记配基与标记配基两者比例悬殊，所以受体几乎全部被非标记配基饱和，标记配基只能与组织制备物中的非特异结合位点结合。
这时测出的标记配基的结合量，反映的是非特异结合量。
用总结合管的计数减去非特异结合管的计数，即可得到特异结合计数。
3、分类：RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。
1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。
2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
受体与配体结合试验的测定方法
【实验原理】
• 总结合管：将放射性配基与受体制备物反应，除去游离的 放射性配基，测定结合的放射性配基的计数，（其中包含 特异性结合与非特异性结合，称为总结合）。 • 非特异性结合管：将大量（一般为500－1000倍）非标记 特异性配基与标记的放射性配基相混，然后共同与受体制 备物反应。由于非标记配基与标记配基两者比例悬殊，所 以受体几乎全部被非标记配基饱和，标记配基只能与组织 制备物中的非特异结合位点结合。这时测出的标记配基的 结合量，反映的是非特异结合量。用总结合管的计数减去 非特异结合管的计数，即可得到特异结合计数。
【结论】
• 与受体结合的最大配基量为XXXX nM，即 脑P2部分样品受点的含量－最大结合量： XXXX nM。 解离常数KD为XXXX。
【参考文献】
• Mary J. Mycek, Richard A. Harvey, Pamela C. Chample. Lippincott Illustrated Reviews Pharmacology. Philadelphia: Lippincott Willams & Wilkins, 2002. 张德昌主编. 《医学药理学》. 北京：北京医科 大学中国协和医科大学联合出版社，1998. 《药理学实验讲义》. 中国协和医科大学药理 室, 2005年10月 左萍萍老师的课件
【实验结果与分析】
绘图： （1）饱和曲线：见图4 • B为纵坐标，F为横坐标，计算出总结合，非特 异结合，特异性结合，作图即可得到受点结合 曲线。 （2）Scatchard作图：见图5 • B/F为纵坐标，B为横坐标绘制Scatchard图形， 所得图形为双曲线，用电子计算机绘图，找出 渐近线，分别算出高低亲和力结合的最大结合 数量KD值。
受体的放射配体结合分析法
移项并稍加整理可得：
（8.5）
以[RL]/[L]对[RL]作图，即为Scatchard作图。在简单单位点系统，应得一直线。斜率是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于[RT]值（图8-4）。当KD相同而[RT]不同时，应得到相互平行但与横轴交于不同位置的直线（图8-5a）。当[RT]相同而KD不同时，各直线斜率不同但与横轴交于同一点（图8-5b）。
本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。核受体一般是由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质，不含糖基，无酶活性。氨基端是一个高度可变区，大约由25～603个氨基酸残基组成，与转录的特异性有关，具有转录激活作用。中间是DNA结合区，约由66～68个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强，同种激素的受体在不同种属间有完全相同的DNA结合部位。羧基端为激素结合区，大约由220～250个氨基酸残基组成，相同激素的受体在此区种属差异较小，而不同激素的受体即使是同一种属，差异性也较明显，因而决定了受体的特异性。与受体结合的染色体的DNA序列称为激素反应元件（hormoneresponse element,HRE）, HRE一般位于受调控基因启动子上游，一个基因的上游通常有多个HRE。根据受体与HRE结合的特征，将核受体分为两类：
饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。
饱和曲线的形状和KD有关。KD越小，即亲和力越高，曲线起始上升的越快，后续部分越早趋向水平（图8-2）。
如KD相同而[RT]不同，则各曲线的形状相似但高度不同（图8-3）。
图8-2KD对饱和曲线的影响图8-3[RT]对饱和曲线影响
放射配体与受体结合分析：筛选新的先导化合物有效方法之一
放射配体与受体结合分析：筛选新的先导化合物有效方法之一朱辉
【期刊名称】《国外医药：抗生素分册》
【年(卷),期】1998(019)004
【摘要】体外配体受体结合分析作为筛选先导化合物的筛选工具有较明显的优势,通过结合分析产生的构效关系数据是配体和受体作用的直接反映.在技术上,由于此方法是靶位筛选,因此仅需极少量的样品(常不超过lmg),方法灵敏、可靠,同时成本也降低.本文着重介绍通过结合分析过筛样品寻找特异先导化合物的原理、方法和特点.
【总页数】3页(P257-259)
【作者】朱辉
【作者单位】国家医药管理局
【正文语种】中文
【中图分类】R965.1
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1.小鼠腹腔巨噬细胞PAF受体放射配基受体结合分析方法 [J], 彭珊瑛;欧阳雪宇;王文杰
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3.白三烯C_4(LTC_4)放射受体结合方法的建立及二苯乙烯低聚体和LTC_4受体结合特性 [J], 侯艳宁;朱秀媛;程桂芳
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TG 作用 , 这与袁淑云等
[1,3]
报道用家兔作为降脂试验动物的结果是一致的。
本次试验同时显示纳豆胶囊毒理学两阶段毒性实验结果为阴性 , 表明此胶囊为实际无毒物质。
参考文献 :
[1]袁淑云 . 纳豆激酶粗提液对小鼠实验性高脂血症的降
脂作用 . 现代医院 ,2005,15:10212.
[2]武井直树 , 李麒 . 纳豆在保健和医疗上的应用价值 . 中国
微生态学杂志 ,2002,14:2432246.
[3]段智变 , 江晓 , 江汉湖 . 纳豆粗提物抗兔高脂血症及抗氧
化作用的研究 . 营养学报 ,2004,26:2962299.
[4]刘宇峰 , 王金英 , 孙岸 , 等 . 纳豆激酶制剂—恩开胶囊
的生产工艺中试研究 . 生物技术 ,2000,10:48249.
(收稿日期 :2006-11-15
中图分类号 :R144文献标识码 :B文章编号 :1002-3127(2007 03-0231-02
・方法研究・
放射性配体受体结合实验方法介绍
班婷婷 , 吴强恩 , (复旦大学公共卫生学院 ,
关键词 :放射性配体受体结合法 ; 经验介绍 ; 作者简介 :班婷婷 , 硕士研究生 , 研究方向 :农药毒理学。
assays , RRA , RRA 系统时 , 恼 , 现根据我们实验室多年的经验 , 将部分内容方法操作步骤报道如下 , 以供同行参考。
1受体标本的制备和保存
一般有差速离心和蔗糖密度梯度离心 , 前者较为常用。
应在脱离正常供血环境后迅速在 0~4℃条件下匀浆。
有报道 , 脑组织标本切成小块后以原状态冻存于-70℃ ~-80℃ , 能保存 6个月以上 , 或者将组织块或所需组织的悬浮液保存在 -70℃可保存 6个
月 , 受体不失活 [122]。
2降低非特异性结合的方法
我们用组织提取受体进行 3
H 2G ABA (γ2氨基丁酸实验时 , 吸附在滤纸上的游离型标记配体的含量较多 , 非特异性结合很高 , 可考虑如下几方面降低其含量 :
(1 加样顺序 :最好先加膜受体饱和管以壁减少
3
H 2G ABA 在管壁上的吸附。
若先加 3
H 2G ABA 则非特异
性结合管所加入的非标记性配体会将管壁的 3
H 2G ABA
置换出来 , 而使非特异结合管的每 min 放射性计数
(CPM 值偏高。
(2 用抽滤法分离放射性配体 2受体复
合物时 , 最好能预先寻找合适的滤膜冲洗时间。
我们
进行 G ABA A 受体实验时发现 5~6s 分离较好 , 如图 1。
整个冲滤过程最好控制在 20s 以内。
(3 滤膜最好
用体积分数为 011%的聚乙烯亚胺 (PEI 至少浸泡 2h 以上
, 目的是饱和膜上的非特异性结合位点。
另外在使用时以新鲜浸泡为好 , 否则会使非特异性结合位点
重新暴露。
表 1为 3
H 2G ABA 实验中其他条件相同时 , 表 1用不同浸泡液浸泡滤膜后所测数据 , 可见用体积分数为 011%的 PEI 浸泡效果好。
图 1不同冲洗时间对 G ABA A 受体特异性结合的影响
3决定在 RRA 系统所适用的受体Π蛋白浓度
由图 2可见 , 为了寻找最大的特异结合点 , 向体系中加入不同浓度的受体标本
, 随着受体浓度的增加其
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132・毒理学杂志 2007年 6月第 21卷第 3期 J T oxicol June 2007V ol 121 N o 13
表 1不同浸泡液浸泡滤膜后对 G A BA A 受体特异性结合的影响
滤膜浸泡液
特异性结合的CPM (Πmin
体积分数为 011%PEI
83315质量浓度为 1%的 BS A (牛血清白蛋白 38315质量浓度为 5%的 BS A
45110011mm ol ΠL G ABA
4091550mm ol ΠL T ris 2HCI (缓冲液
54510
特异结合也增加 , 但增加到某一程度其特异性结合的增加开始钝化 , 由此可求出受体浓度 2特异性结合的反应曲线。
一般取其直线部分的中央值作为 RRA 测
定时使用的受体标本浓度。
但一般不主张用过多的组织制备样本来增加受体浓度 , 因为制备标本时组织匀浆太浓会导致杂质不易去除。
图 2不同蛋白浓度对 G ABA A 受体特异性结合的影响
4孵育时间
温度对 RRA 的特异性结合有影响。
孵育一般在 0~37℃环境下进行 , 用标记药物作为配体时 ,37℃保
温通常能得到较好结果。
温度高 , 达到反应平衡的时
间短 ; 但低温条件下对保持配基及总体蛋白质不易受到破坏 , 重复性较好。
不同受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、孵育温度、配基及受体浓度的不
同而不同。
测定最佳孵育时间时 , 应当选用浓度最低一点的放射性配基。
如图 3, 我们用终浓度为5nm ol ΠL 的 3
H 2G ABA 测定 25℃条件下大鼠海马 G ABA A 受体的特异性结合情况 , 蛋白浓度约为011g ΠL , 发现约 120min 时反应达到最高点 , 其后以分解为主。
图 3不同孵育时间对 G ABA A 受体特异性结合的影响
5非标记配基浓度对特异性结合的影响
测定非特异结合的非标记配基浓度应当通过实验
合理选定。
如测定不同浓度 G ABA 对 3
H 2G ABA 结合的影响 , 得到如图 4所示的曲线异结合被抑制 , 随 G , 到
达 , , 、滤膜等所引起 , 具有容 , 不被非标记配基抑制。
但继 , 则特异结合也将被抑制 , 曲线又开始下降。
合理的选择是平台部分。
从图可见 ,
实验时可以用浓度约为 10-4
m ol Πl 的 G ABA。
图 4不同 G ABA 浓度对 G ABA A 受体特异性结合的影响
总之 , 建立正确的放射性配体受体结合方法才能得出可靠的数据。
以上是方法建立过程中的几点心得 , 与各位共享。
(致谢 :衷心感谢复旦大学药学院放射药学教研室钟高仁老师和放射医学研究所的朱国英老师、陈红红老师的指点和帮助。
参考文献 :
[1]小川纪雄 , 冯剑波 . 脑受体 . 北京 :北京医科大学中国协
和医科大学联合出版社 ,1997.
[2]贺师鹏 , 胡雅儿 , 夏宗勤 . 受体研究技术 . 北京 :北京大学
医学出版社 ,2004.
(收稿日期 :2006-11-20
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