放射性配体受体结合实验方法介绍重点

TG 作用 , 这与袁淑云等

[1,3]

报道用家兔作为降脂试验动物的结果是一致的。本次试验同时显示纳豆胶囊毒理学两阶段毒性实验结果为阴性 , 表明此胶囊为实际无毒物质。

参考文献 :

[1]袁淑云 . 纳豆激酶粗提液对小鼠实验性高脂血症的降

脂作用 . 现代医院 ,2005,15:10212.

[2]武井直树 , 李麒 . 纳豆在保健和医疗上的应用价值 . 中国

微生态学杂志 ,2002,14:2432246.

[3]段智变 , 江晓 , 江汉湖 . 纳豆粗提物抗兔高脂血症及抗氧

化作用的研究 . 营养学报 ,2004,26:2962299.

[4]刘宇峰 , 王金英 , 孙岸 , 等 . 纳豆激酶制剂—恩开胶囊

的生产工艺中试研究 . 生物技术 ,2000,10:48249.

(收稿日期 :2006-11-15

中图分类号 :R144文献标识码 :B文章编号 :1002-3127(2007 03-0231-02

・方法研究・

放射性配体受体结合实验方法介绍

班婷婷 , 吴强恩 , (复旦大学公共卫生学院 ,

关键词 :放射性配体受体结合法 ; 经验介绍 ; 作者简介 :班婷婷 , 硕士研究生 , 研究方向 :农药毒理学。

assays , RRA , RRA 系统时 , 恼 , 现根据我们实验室多年的经验 , 将部分内容方法操作步骤报道如下 , 以供同行参考。 1受体标本的制备和保存

一般有差速离心和蔗糖密度梯度离心 , 前者较为常用。应在脱离正常供血环境后迅速在 0~4℃条件下匀浆。有报道 , 脑组织标本切成小块后以原状态冻存于-70℃ ~-80℃ , 能保存 6个月以上 , 或者将组织块或所需组织的悬浮液保存在 -70℃可保存 6个

月 , 受体不失活 [122]

。 2降低非特异性结合的方法

我们用组织提取受体进行 3

H 2G ABA (γ2氨基丁酸实验时 , 吸附在滤纸上的游离型标记配体的含量较多 , 非特异性结合很高 , 可考虑如下几方面降低其含量 :

(1 加样顺序 :最好先加膜受体饱和管以壁减少

3

H 2G ABA 在管壁上的吸附。若先加 3

H 2G ABA 则非特异

性结合管所加入的非标记性配体会将管壁的 3

H 2G ABA

置换出来 , 而使非特异结合管的每 min 放射性计数

(CPM 值偏高。 (2 用抽滤法分离放射性配体 2受体复

合物时 , 最好能预先寻找合适的滤膜冲洗时间。我们

进行 G ABA A 受体实验时发现 5~6s 分离较好 , 如图 1。整个冲滤过程最好控制在 20s 以内。 (3 滤膜最好

用体积分数为 011%的聚乙烯亚胺 (PEI 至少浸泡 2h 以上

, 目的是饱和膜上的非特异性结合位点。另外在使用时以新鲜浸泡为好 , 否则会使非特异性结合位点

重新暴露。表 1为 3

H 2G ABA 实验中其他条件相同时 , 表 1用不同浸泡液浸泡滤膜后所测数据 , 可见用体积分数为 011%的 PEI 浸泡效果好。

图 1不同冲洗时间对 G ABA A 受体特异性结合的影响

3决定在 RRA 系统所适用的受体Π蛋白浓度

由图 2可见 , 为了寻找最大的特异结合点 , 向体系中加入不同浓度的受体标本

, 随着受体浓度的增加其

・

132・毒理学杂志 2007年 6月第 21卷第 3期 J T oxicol June 2007V ol 121 N o 13

表 1不同浸泡液浸泡滤膜后对 G A BA A 受体特异性结合的影响

滤膜浸泡液

特异性结合的CPM (Πmin

体积分数为 011%PEI

83315质量浓度为 1%的 BS A (牛血清白蛋白 38315质量浓度为 5%的 BS A

45110011mm ol ΠL G ABA

4091550mm ol ΠL T ris 2HCI (缓冲液

54510

特异结合也增加 , 但增加到某一程度其特异性结合的增加开始钝化 , 由此可求出受体浓度 2特异性结合的反应曲线。一般取其直线部分的中央值作为 RRA 测

定时使用的受体标本浓度。但一般不主张用过多的组织制备样本来增加受体浓度 , 因为制备标本时组织匀浆太浓会导致杂质不易去除

。

图 2不同蛋白浓度对 G ABA A 受体特异性结合的影响

4孵育时间

温度对 RRA 的特异性结合有影响。孵育一般在 0~37℃环境下进行 , 用标记药物作为配体时 ,37℃保

温通常能得到较好结果。温度高 , 达到反应平衡的时

间短 ; 但低温条件下对保持配基及总体蛋白质不易受到破坏 , 重复性较好。不同受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、孵育温度、配基及受体浓度的不

同而不同。测定最佳孵育时间时 , 应当选用浓度最低一点的放射性配基。如图 3, 我们用终浓度为5nm ol ΠL 的 3

H 2G ABA 测定 25℃条件下大鼠海马 G ABA A 受体的特异性结合情况 , 蛋白浓度约为011g ΠL , 发现约 120min 时反应达到最高点 , 其后以分解为主

。

图 3不同孵育时间对 G ABA A 受体特异性结合的影响

5非标记配基浓度对特异性结合的影响

测定非特异结合的非标记配基浓度应当通过实验

合理选定。如测定不同浓度 G ABA 对 3

H 2G ABA 结合的影响 , 得到如图 4所示的曲线异结合被抑制 , 随 G , 到

达 , , 、滤膜等所引起 , 具有容 , 不被非标记配基抑制。但继 , 则特异结合也将被抑制 , 曲线又开始下降。合理的选择是平台部分。从图可见 ,

实验时可以用浓度约为 10-4

m ol Πl 的 G ABA

。

图 4不同 G ABA 浓度对 G ABA A 受体特异性结合的影响

总之 , 建立正确的放射性配体受体结合方法才能得出可靠的数据。以上是方法建立过程中的几点心得 , 与各位共享。

(致谢 :衷心感谢复旦大学药学院放射药学教研室钟高仁老师和放射医学研究所的朱国英老师、陈红红老师的指点和帮助。