恒河猴CD1d基因的克隆及其组织表达差异性分析

恒河猴CD1d基因的克隆及其组织表达差异

性分析

作者：张萍, 周慧芳, 孙正华, 邵晓丽, 张华堂, 徐小宁

【摘要】目的: 克隆非人灵长类疾病动物模型恒河猴的CD1d 基因并检测其在不同组织中的表达差异情况。方法: 提取恒河猴血液及各组织的RNA, 以反转录得到的cDNA为模板, 用特异性引物扩增CD1d; 以管家基因GAPDH为内参, 用半定量RT PCR的方法对CD1d 的组织表达差异性进行分析。结果: 成功扩增了恒河猴CD1d基因的编码区序列; 首次用半定量RT PCR的方法检测了CD1d mRNA在恒河猴部分组织中的表达情况, 发现其表达水平存在明显的组织差异性, 其中, 在肝脏、脾脏和心脏中的表达水平较高, 在血液、小肠和肺中次之, 在脑中表达最少。结论: 研究结果为今后表达恒河猴CD1d蛋白并制备其四聚体进而研究恒河猴NKT细胞在众多疾病中的作用奠定了基础; 组织表达差异的研究结果提示其在相关疾病的发生发展过程中可能扮演着重要的角色, 具体作用还有待深入研究。

【关键词】 CD1d; NKT细胞; 恒河猴; 组织分布

［Abstract］ AIM: To amplify the CD1d and analyze its tissue distribution in Rhesus macaque. METHODS: Extracting total RNA from different tissues of Rhesus macaque. CD1d amplification was

carried using specific primers and tissue distribution was analyzed by semi

quantification RT PCR, using the house keeping gene GAPDH as an internal control. RESULTS: The CD1d coding region was obtained in this experiment and tissue distribution was analyzed: a highest level of CD1d expression was detected in heart, liver and spleen, lower level in blood, lung, small intestine and stomach, and least in brain. CONCLUSION: The successful amplification of CD1d is useful to produce anti

CD1d antibody and CD1d tetramer to study NKT cells in Rhesus macaque. The expression profile of CD1d mRNA in Rhesus macaque is in accordance with the tissue distribution and the functions of NKT cells in other species. These results will provide important insights for future research on the relationship of CD1d/NKT cells and their roles in different tissues.

［Keywords］CD1d; NKT cells; Rhesus macaque; Tissue distribution

CD1家族是一类非经典的抗原递呈分子, 包括CD1a、 b、 c、 d 和e 5个成员, 其中CD1 a、 b、 c和e属于第Ⅰ组, CD1d属于第Ⅱ组。在灵长类中两类CD1分子均有表达, 但在小鼠等啮齿类动物中仅表达CD1d, 称为CD1d 1［1］。CD1家族成员在进化中表现的非常保守。与经典的抗原递呈分子MHC

Ⅰ结构类似, CD1d分子也包括胞膜外区（α 13）、跨膜区和胞质区, 并通过重链α3结构域与β2m非共价结合形成异源二聚体发挥抗原递呈的功能; 与MHCⅠ不同的是, CD1d递呈的是脂类抗原, 而非肽类抗原。作为抗原递呈分子, CD1d可以将外来或自身的脂类抗原递呈给CD1d限制性的NKT细胞。NKT细胞是一类数量很少但很重要的免疫细胞, 在细胞免疫和体液免疫中均起重要作用［2］。鉴于NKT 细胞表现出的CD1d限制性, 承载αGalCer（一种从海绵中提取的鞘糖脂）的CD1d四聚体已经成为检测和认定NKT细胞的关键性标记之一［3］, 因此, 克隆并表达功能性的CD1d已经成为研究NKT细胞的重要环节。

目前, 许多物种的CD1d基因序列已经得到了公布, 其编码区长度在不同物种中稍有差别, 人的CD1d基因编码区全长有1 008 bp, 恒河猴为1 014 bp, 小鼠CD1d 为1 011 bp。尽管如此, 不同物种间CD1d 的同源性及功能上均表现了高度的保守性。有研究表明, CD1d分子主要表达在脾细胞、树突状细胞（DC）和胃肠道上皮细胞上。Canchis 等［4］曾通过免疫组化染色方法检测到人的CD1d在小肠、肝脏、胰脏、肾脏、胃以及皮肤等组织中均有表达。Kasai等［5］结合原位杂交及免疫组化方法发现在大鼠的脾脏、胸腺、肝脏、肺、心脏、肾脏、小肠等组织中均有CD1d 1的表达。但尚未见到关于恒河猴的CD1d组织表达差异情况的详细报道。本试验中, 我们对人类疾病发生和治疗等研究中被广泛应用的非人灵长类动物模型恒河猴的CD1d

分子进行了克隆和研究。成功克隆了恒河猴的CD1d编码区序列, 并首次用半定量RT

PCR的方法检测了部分组织中CD1d的表达情况, 为今后研究CD1d/NKT细胞的分布及其在不同组织中的功能特点给出了提示。

1 材料和方法

1.1 材料恒河猴各组织总RNA由昆明动物研究所比较基因组学研究组提供; rTaq聚合酶 (DR001A)、 DNA Marker DL 2 000 (D501A)、pMD19T（D102A）载体、及其他生化常用试剂购自TaKaRa公司; 大肠杆菌DH5α为中科院昆明动物研究室免疫生物学实验室制备并保存; RNAprep培养细胞总RNA提取试剂盒（DP430）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP21402）、 pfu高保真聚合酶（EP10101）、 TIANscript M MLV逆转录酶（ER10404）购自Tiangen公司; iCyclerTM Thermal Cycler PCR仪购自Bio Rad公司; Sal I （ER0641）和BamH I （ER0051）内切酶购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 组织cDNA模板的获得取10 μL总RNA(约5 μg), 按TIANscript M MLV逆转录酶的说明书进行反转录: 加入2 μL dNTP (10 mol/L)和2 μL oligo (dT)引物(10 μmol/L), 混匀后70℃反应5 min; 冰上冷却, 加入1