细胞工程技术ppt精品课程课件讲义

• 2.细胞脱核方法：
• *紫外照射法：可使细胞核萎缩，获胞质体。 • *显微手术法：在显微操作器控制下，用微吸管 从细胞中吸取核质体。 • *松胞菌素质B（CB)法:用低浓度（1~5ug/ml) CB 试剂作用于培养中细胞群，可诱导细胞核分裂而 细胞质不分裂，形成多核细胞，引起细胞膜破裂， 离心后获取细胞核和胞质体。
（C核融合 ）
• →杂种细胞克隆扩增。
• 3.杂种细胞的筛选：
c甲
• 甲C
BrdU
( HGPRT+ /TK- )
x→ (HGPRT- /TK+ )
c甲同核体
c甲乙同核体 c乙同核体 c乙
[ 诱变] • 乙C
MNNG
• HAT培养基筛选————→
c甲乙同核体
（杂种细胞基因互补）
三.杂交瘤单克隆抗体制备技术
（原理见P191鄂著）
二.细胞融合技术
• 1.细胞杂交（Somatic Cell Hybridization): • 指两个或两个以上的细胞融合成一个杂种细胞 (hybrid cell)的过程。P199 • 2.原理：p203图6-3 • 同或异种C
促融剂
异核体
C分裂
Leabharlann Baidu
同核体
筛选
聚乙二醇 （c质融合）
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细胞工程技术
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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• *细胞工程（Cell Engineering):指应用细胞生物学和分子 生物学技术，人为改变细胞的结构和性状，使之满足某 种研究和应用的需要。（P199)
• 3.单克隆抗体制备技术路线：P208图6-8 • 目的抗原A • 免疫 x 诱变处理 [ 突变骨髓瘤C] （ 不能分泌抗体 体外增殖旺，可传代 HGPRT- 或TK)
• [致敏小鼠脾C] • (可分泌抗A抗体 • 体外增殖力差 • HGPRT+ ,TK+ ）
细胞融合所获混合C群
小鼠脾C
• HGPRT+ • TK+
• 1.概念：P219 • *细胞拆合：是把细胞核与胞质分离，然后 用显微操做技术把不同来源细胞质，细胞核配合， 形成有增殖活力核-质杂交细胞。 • *显微操作技术：指在高倍显微镜下，利用显微 操作器进行细胞工程操作的方法。显微操作器是 用来控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械 装置。
• *细胞脱核技术：把细胞核从细胞中分离出来， 获得无核的胞质体和无细胞质的核质体的技术。
一.建立突变细胞系
• 1.Mutant Cell Line：指人为培养获得的突变性质 一致，性状均一，可离体培养增殖 • ，遗传的细胞群。 • 2.突变细胞系的来源： • *自然突变：机率低，方向不定。可从突变 个 体分离培养突变体细胞，扩增建系。 • *人工诱变：可定向诱变，突变率较高。筛 选 突变细胞扩增培养。如：
• 1.概念：该技术综合运用了多项细胞生物学方法， 可针对各种有抗原活性的物质制备所需要的特异 抗体，是细胞工程学的一项杰出成就。一旦一种 杂交瘤单克隆抗体细胞系建成，即可长期保存， 大量扩增，用于生产目的抗体。
• 2.原理：用目的抗原致敏的脾细胞（B淋巴细胞） 能分泌特异抗体，但不能在体外长期培养增殖。 骨髓瘤细胞可在体外大量长期增殖，但不能分泌 抗体。将骨髓瘤细胞与脾细胞融合，所获杂交细 胞既可体外大量长期增殖，又可分泌抗体。克隆 扩增的杂交细胞系是能分泌针对单一抗原决定簇 的单克隆抗体。P207
• 2.哺乳动物克隆繁殖技术的生物学意义：
• 1）是人为创造的超自然的无性繁殖技术，无生
物进化意义*。 • 2）利用动物体细胞核与卵细胞质体杂交，由杂 交体发育成胚体。该技术可以大量复制遗传性状 完全一致的动物个体，这是自然界高等生物有性
繁殖所不能及的。（克隆低等动物70年代就问世
了） • 3）高等动物高分化态的体细胞核基因组，仍可 去分化，重新启动胚胎发育，重现细胞的全能性，
• HGPRT +
TK+
BrdU
甲基硝基亚硝基胍
HGPRT
—
（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷）
TK—
(胸苷激酶缺陷）
定向诱变剂的发现具有重要意义。
• 3.突变细胞的筛选与克隆扩增------人工选择培养 基技术 *HAT培养基可筛选保留HGPRT+和TK+细胞 （H:次黄嘌呤，A:氨基喋呤，T:胸腺嘧啶） *含MP(6-巯基嘌呤）和AG(6-杂氮鸟嘌呤）的培养 基可筛选保留HGPRT--细胞。
• 3.CB法细胞脱核实验：见P221 实验过程。 • 4.显微注射法核移植实验：
• 核移植:是通过显微操作技术将一个细胞的细胞核,移植到去 核的
• 受体 卵母细胞或卵子内,组建成新的重组细胞,然后移植于
•
动物,在其体内发育成一新个体.
• 核移植实验步骤:见P222实验。 • 1）同步化大鼠成纤维细胞（供核C)制备： • 2）从供卵母鼠收集卵母细胞： • 3）卵母细胞的盲吸法去核（获胞质体）： • 4）显微注射法核移植（获核质杂交体） ：P222 图6-11 • 结果分析：p223图6-12
• *范例：基因诱变→筛选，扩增突变细胞系。
•
• • • •
细胞杂交→筛选，扩增杂种细胞株。
转基因技术→转基因生殖细胞→转因生物。 克隆动物技术→细胞拆合，核-质杂交→杂交体发育 →克隆动物。 干细胞培育人工器官→分离干细胞→体外培养诱导 目 的组织器官生成→回植体内。 基因敲除技术→从细胞中敲除目的基因→检测效应。
骨髓瘤C
HGPRT或TK-
杂交瘤C
HGPRT+ TK+
同核杂种C
无力传代 自然消除
HAT 筛除
HAT 筛留
杂交瘤细胞克隆培养 （目的抗体鉴定） 杂交瘤单克隆抗体
细胞株（抗A)
冻存留种。 C扩增培养， 杂交瘤C液注入 收集C提取液， 小鼠腹水扩增 获高纯抗体。 获低纯抗体。
四.细胞拆合与显微操作技术
图6-13
*哺乳动物克隆技术及研究进展
• 1.概念： • *Clone: 译意为无性繁殖系。
• *Cell Clone:混合细胞群→筛选靶细胞→克 隆扩增遗传性状完全一致的细胞群。
• *Molecular Clone: 目的基因转化受体细胞→筛选 转化细胞→克隆扩增转化细胞获得大量目的基因 拷贝。 • *Animal Clone:指人为通过无性繁殖技术，繁育 遗传性状完全一致的动物。