微生物大小及菌群数量的测定实验

微生物大小及菌群数量的测定实验

王康周三下午第一排

摘要：本次实验中，通过校正目镜测微尺，然后将染色的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、

酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）至于镜下，分别测量长宽、并计算得到它们的大小；在血细胞计数板上滴加酿酒酵母，然后在高倍镜下进行计数，计算得到每毫升中酵母菌的总数。

关键词：测微尺；校正；血细胞计数板

前言：微生物细胞大小，是其形态特征重要标志之一。每一种微生物在一定条件下，有其

相对固有的大小形态。它是分类鉴定的依据之一。

微生物的大小测定可用测微尺测量，测微尺分为目镜测微尺和镜台测微尺两部分。镜台测微尺是特制的载玻片，其中央有一全长1mm的刻度标尺，等分成100小格，每格长度为10um，可用它来校正目镜测微尺每小格的长度。目镜测微尺是一块可放在目镜内的圆形薄片，其中央刻有50等分的小格，每小格的长度随目镜物镜放大倍数的大小而变动，在测量微生物菌体的大小之前，应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大倍数物镜下，目镜测微尺每小格所代表的实际长度，再以它作为测量微生物细胞的尺度，再计算出微生物的大小。

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3。以25个中方格为例，5个中方格总菌数为A，菌落稀释倍数为B，则 1mL菌液中总菌数=A÷5×25×104×B。

1．材料和方法

1.1材料

1.1.1菌种酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）枯草芽孢杆菌

（Bacillus subtilis）

1.1.2 溶液和试剂美蓝染液，蒸馏水

1.1.3 仪器和其他用品酒精灯，血细胞计数板，盖玻片，镊子，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，滴管等。1.2方法

1.2.1 菌体大小测定

1.2.1.1 目镜测微尺的安装把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

1.2.1.2校正目镜测微尺将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。用同样方法校正高倍镜和油镜。目镜测微尺每个的长度（μm）=两条重合线间镜台测微尺格数×10÷两条重合线间目镜测微尺的格数

1.2.1.3菌体大小测定将镜台测微尺取下，换上细菌染色制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。

1.2.1.4测定完毕测定完毕取出目镜测微

尺，将目镜放回镜筒，然后将目镜测微尺和镜台测微尺擦拭干净，放回盒内保存。1.2.2 显微镜计数

1.2.2.l菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

1.2.2.2 检查血细胞计数板

1.2.2.3 加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

1.2.2.4 显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

1.2.2.5 清洗使用完毕后将血细胞计数板及盖玻片进行清洗干燥，放回盒内。

2．结果与分析

2.1 结果

2.1.1 菌体大小测定

2.1.2 显微镜计数

2.2分析

2.2.1 由实验结果表-2、表-3，枯草芽孢杆菌长度为5.2μm，宽1.0μm，酿酒酵母的平均宽度为6.1μm长度7.6μm，同一种细菌或真菌不同细胞之间存在着个体差异，但变化相对较小，分类学指标价值大。

2.2.2由实验统计结果表-5，显微镜下每个中方格内酵母菌的数量为10～20个，各个中方格中总菌数差距不大，第二室的总菌数要与第一室的总菌数差不多，酿酒酵母液体培养基中每毫升的菌数为 6.9×107个，可见微生物在适宜的条件下繁殖迅速，数量大。

小结通过本次试验掌握了微生物大小和数量的测定技术，并达到实验观察的目的。但

仍然存在一些不足之处，所以通过本次实验，总结了几点注意事项：

（1）在校正目镜测微尺或观察时，光线不宜过强，否则难以观察，务必十分小心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。

（2）菌体个体较小，在进行细胞测定大小时一般用油镜，以减少误差。

（3）计数板上的技术室的刻度非常精细，清洗时切勿使用刷子，也不要用酒精灯烘烤。（4）取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡。

（5）活菌是透明的，计数时应适当减低视野亮度，以增大反差。

（6）进行显微计数时，先在低倍镜下找到大方格的位置，再将其移至高倍镜下观察和计数。（7）计数时四边不能均计数，应按照“计左不计右，计上不计下”的原则。

（8）遇到有出芽的酵母菌，只有当芽体与母细胞一样大时才计为两个。

参考文献

【1】沈萍陈向东，《微生物实验》，高等教育出版社

【2】沈萍陈向东，《微生物》，高等教育出版社