HPLC分析方法开发与验证解读

水溶液中添加0.1%（体积）的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左 右，用作流动相正好抑制硅羟基的活性，所以开发液相分析方法时 流动相首选水加0.1%的磷酸，然后再以此为基础做优化。 在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是 ：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的 酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋 酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右。流动相里有时会需要调节 pH值到碱性，具体pH要视色谱柱的耐受范围而定。
• 分离基于样品的极性差异。 • 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱
• 常用的流动相∶
– 非极性有机溶剂，如己烷 – 乙酸等为添加剂
• 常用固定相∶
– 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。
分配色谱的分离机理
分配色谱概述
• • • 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相：
液相方法开发
创诺集团分析技术研究所
纪伟
20160903
液相色谱原理
仪器原理
色谱分离机制
液相色谱的分离机理
• • 正相 反相
•
• •
体积排除
离子交换 其他
– 不同的分离模式是不同的机理
吸附色谱的分离机理
• 随着样品在固定 相上的吸附能力 由大到小 • 在色谱柱上的保 留由长到短
吸附色谱概述
水相：
对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加 盐，从而改善峰形、提高分离度。
流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三 氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸 和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长 下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长 下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而 做液质就要考虑首选三氟乙酸了。
离子交换树脂的分离机理
离子交换色谱概述
• 适用于离子型化合物的分离 • 分离基于离子的带电特性
• 洗脱次序受多种因素的影响
– 填料（离子交换树脂）的种类∶阴/阳，强/弱，交换基团 – 样品分子特性
– 盐的种类、浓度
– 温度及pH值 – 有机溶剂
S P C S P C t S P S 样 品 P 填 料
2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤
3 选择仪器类型，确定检测器及其参数
4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件
5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等
6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤
分析方法开发
选HPLC参数时的基本考虑
• 溶解度 - 选择流动相的条件 • 分子量 - 在样品预处理时有用
• 官能团 - 有否离子化基团 保留特性如何
• 检测特性 - 有否紫外吸收 荧光 • 找出样品中不同组份之间的差异
– 摸索条件的重要线索
HPLC方法建立的步骤
1 了解样品的有关情况，明确分析目的
– 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 – 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法
•
常用固定相：
– 碳十八、碳八、胺基等基团 – 反相色谱固定相多为键合相
体积排除色谱的分离机理
凝胶色谱概述
• • 凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小
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• • •
洗脱次序：大分子先被洗脱
流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测
•
在缓冲盐做流动相时，出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖 尾或峰型太宽而不能达到基线分离时，可以考虑使用离子对试剂，常用的 离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐，但是流动相里使用离子 对试剂时，系统需要的平衡时间长，样品保留时间不是很稳定，因为离子 对试剂的背景吸收基线会很差，且做完样品后需要长时间清洗，所以我们 尽量不使用离子对试剂。 使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致 基线漂移严重的问题，可以考虑在乙腈里加入10%的水，水中预先加入10 倍水溶液浓度的缓冲盐，这样梯度中A、B两项盐的浓度相同，可以避免基 线漂移严重的问题。 原料药一般结构式比较大，分子构成比较复杂，开发分析方法时用水加磷 酸效果可能效果不好，通常还要求最少尝试2和6.5两个pH值的磷酸盐缓冲 溶液，并依据结果对流动相进行pH优化，如效果不理想再进一步尝试其它 缓冲盐溶液。开发中间体或者IPC的分析方法时可以根据经验酌情简化流动 相的选择过程。
pKa 2.1 3.1 3.8 4.7 4.8 5.4 7.2 8.3 9.2 9.2 9.8 10.3 10.5 10.5 10.7 12.3
pH范围 1.1~3.1 2.1~4.1 2.8~ 4.8 3.7~5.7 3.8~5.8 4.4~6.4 6.2~8.2 7.3~9.3 8.2~10.2 8.2~10.2 8.8~10.8 9.3~11.3 9.5~11.5 9.5~11.5 9.7~11.7 11.3~13.3
7a 回收纯化物质
7b 定量校正
7c 定性方法
8 方法论证进入常规实验室
流动相的选择
有机相： 常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈：
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生 反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏 度； 乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很 少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截 止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂 质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有 时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选 择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。
液相柱---保留值与pH的关系
方法稳定区
中性组份
酸性组份
方法波动区(pKa+1.5)
方法稳定区
碱性组份
反Fra Baidu bibliotekHPLC常用缓冲液
pH < 2.5 磷酸 0.1% 三氟乙酸 0.1%
缓冲液 磷酸盐pK1 柠檬酸盐pK1 甲酸盐 柠檬酸盐pK2 乙酸盐 柠檬酸盐pK3 磷酸盐pK2 羟甲基甲胺 氨 硼酸盐 甘氨酸 1-甲基-哌啶 四氢化吡咯 二乙胺 三乙胺 磷酸盐pK3