黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验

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新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除

新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除张晓雪;孙秀兰;张银志【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2017(036)003【摘要】对经紫外照射诱变制备的新型黑曲霉FS-UV1在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中的pH、蛋白质质量浓度、蛋白酶活性变化以及脱除机制进行了研究.在发酵过程中,pH值不断下降,由初始pH 5.9下降为1.83.蛋白质质量浓度在发酵48 h后达到最大,为10.07 g/L,而酸性蛋白酶活性则在72 h达到最高,为0.98 U/mL.新型黑曲霉FS-UV1孢子悬液对AFB1无脱除效果,而菌丝体对AFB1具有吸附作用,发酵液则对AFB1具有降解作用,其中发挥降解作用的可能是蛋白质.对FS-UV1在pH 7的模拟肠道环境中脱除黄曲霉毒素B1(AFB1)的效果进行了评价.脱除48 h 时,在pH 7的模拟肠道环境中对AFB1的脱除率为87.3％.【总页数】5页(P266-270)【作者】张晓雪;孙秀兰;张银志【作者单位】江南大学食品学院,江苏无锡214122;江南大学食品学院,江苏无锡214122;食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】IS201.3【相关文献】1.发酵工艺条件对黑曲霉产黄曲霉毒素B1降解酶的影响 [J], 雷娇;宋宏新;李鹏娟;薛海燕;肖瑜;徐丹2.黑曲霉菌降解黄曲霉毒素B1的影响因素的研究 [J], 陈志辉;徐馨;李仲玉;程宝晶3.饲料发酵耦合黄曲霉毒素B1的生物脱除方法研究 [J], 李加友;褚云峰;陆筑凤;苗圣威;李俊峰;杨青4.响应面优化黑曲霉生物发酵花生粕脱除黄曲霉毒素研究 [J], 邱天宇;王海鸣;朱瑜;杨阳;纪剑;孙秀兰5.黑曲霉降解黄曲霉毒素B1的研究及转录组分析 [J], 杨阳;邱天宇;袁晓;孙嘉笛;张银志;孙秀兰;纪剑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究

黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究孙继祥【摘要】The effects of additives,feeding time and feeding quantity on Saccharifying enzyme production by Aspergillus niger fermentation were investigated throug single factor test with the activity of Saccharifying enzyme as indicator.Then the effects of fermentation conditions on Saccharifying enzyme production were investigated by orthogonal experiments.The results suggested that the addition of（NH4） 2SO4 could enhance 17 % enzyme activity,the optimum feeding time was 48h,the best feeding quantity was 6 mL,feeding could prolong fermenting cycle from previous 96 h to 120 h,and the optimum fermentation conditions were 15 % inoculating quantity,50 mL liquid-filling in 250 mL triangle flask,and initial pH value as 4.5.%以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。

通过正交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。

1 冯东阳黑曲霉的培养

黑曲霉的培养一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。

是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、葡糖酸和没食子酸等。

生长适温37℃，最低相对湿度为88%。

从土壤中获取菌种，接种到查氏培养基中进行培养。

二、实验试剂和材料1、试剂碳酸钠3g磷酸二氢钾硫酸镁1g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g蒸馏水1000ml2、器材培养皿、试管、灭菌锅、三角瓶三、实验过程和步骤（一）、查氏培养基配制1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。

2 熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。

3定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至1000ml。

4 调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH5.0-6.0。

若偏碱，则用1mol/L HCl调节。

5 分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，共20支。

余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。

6 加塞、包扎、标记：试管加棉花塞，5支一捆包扎好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。

用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。

7 灭菌：0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

8 搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。

9 倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。

10 无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。

（三）、接种培养将配置好的土壤悬液10ml接种到装有查氏培养基60ml的锥形瓶中，在恒温培养箱中静置培养6-7天（23～28℃培养），观察培养结果。

一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法[发明专利]

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510677600.6(22)申请日 2015.10.19CGMCC No.10789 2015.05.07C12N 1/14(2006.01)C12N 9/62(2006.01)C12R 1/685(2006.01)(71)申请人山东隆科特酶制剂有限公司地址276499 山东省临沂市沂水县城北工业园(72)发明人王兴吉韩龙张杰(54)发明名称一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法(57)摘要本发明公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)TP-235，保藏编号为CGMCC 10789，该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852u/mL。

本发明建立的液态发酵酸性蛋白酶的方法，生产的酸性蛋白酶最适pH 范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h 后剩余酶活为58.4％，具有良好的耐酸性和耐热性，可广泛应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。

(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页CN 105199969 A 2015.12.30C N 105199969A1.一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)TP-235，菌株保藏号为CGMCC 10789。

2.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵平均产酸性蛋白酶活为21800u/mL-21900u/ml。

3.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵产酸性蛋白酶最适作用pH范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃。

黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究

第14卷第3期武汉科技学院学报Vo1.14No.3 2001年9月JOURNAL OF WUHAN INS TITUTE OF SCIE NCE AND TECHNOLOGY Sep.2001黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究王亚林严建芳(武汉工业学院生物与化学工程系武汉430022)摘要研究了黑曲霉液体培养生产植酸酶的发酵工艺,研究了培养基碳源、诱导物、表面活性剂等因素对产酶的影响,对发酵时间、p H变化规律等进行了研究和分析。

关键词植酸酶黑曲霉发酵X中图分类号Q815;Q814.9植酸酶作为一种饲料和食品添加剂,在国内外已开始得到广泛应用,特别是由于其在改善环境方面的作用,更是受到人们的极大关注。

植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量较高而具有较大的开发价值。

目前,美国、荷兰和丹麦等国已先后运用发酵法生产植酸酶,我国也已在进行这方面的研究开发。

可以预计,植酸酶制剂将有良好的市场前景。

1材料与方法1.1菌种黑曲霉(Aspergillus niger)W S201,武汉工业学院微生物室保存。

1.2培养基1.2.1种子培养基:豆芽汁蔗糖培养基。

1.2.2摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO4# 7H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。

1.3培养方法配制培养基时适当加热、摇动或搅拌,使淀粉溶解成液态或胶状,121e灭菌20min。

在30?1e下摇床培养3~5d(转速220~250r/min)。

1.4植酸酶的测定植酸酶活力的定义:37e,pH5.5条件下每分钟从植酸钠中释放出1L mol无机磷所需的酶为1u。

酶活测定方法:取0.1ml含酶液加至一洁净试管中;加入0.9ml反应液,反应液为含0.5%植酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5),在37e恒温反应30min;加入1ml10%三氯醋酸终止反应;加入2ml显色液,摇匀后静置15~30min显色,显色液由1%钼酸铵50ml与3.66X收稿日期:2001-06-26作者简介:王亚林,男,副教授,在读博士生;研究方向:发酵工程、生化工程32武汉科技学院学报2001年g FeSO4#7H2O混合配制。

泸型大曲黑曲霉产酸性蛋白酶条件的优化及其酶学性质的研究

９％（／）ｐ６，ｆｒｅｔｔｎｔｅｉ５ｏｒ，ｅｅｔｔｎｔｅｔｒ８℃，ｎ．％ｉｏｕａｏ．ｈｃｖｙｏ５ｍＬｇ，Ｈ．ｅｎａｏｍ０ｈｕｓｆ０ｍｉｉｓｍｒｎａｏｍｐｒｕｅｉ２ｉｅａｓａｄ６０ｎｃｌｔｎＴｅａｔｉｆｉｉｔ
ａｉｒｔａｅｒａｈｄｔ４５Ｕｇ．ｗｈｃｓｉｃｅｓｄｂ．％ａｅｐｉｚｄＴｅｅｚｍａｉｐｏｅｉｓｗａｌｏｃｄｐｏｅｓｅｃｅｏ２３０／ｉｈｗａｎｒａｅｙ６６４ｔｆｒｏｔｍｉｅ．ｈｎｙｔｒｐｒｅｓａｓｃｔｓｄｅ．ｈｎｙｃｅｐｉｌｔ５，Ｈ３５，ｎｓｓａｌｅｏ０．，，ａＦｉｃｅｓｄｔｅａｔｉｏｔｉｄＴｅｅｚｍｅａｔｄｏｔｕｍａｌａ％ｐ．ａｄｗａｔｂｅｂｌｗ５％ＣｕＫＣ，ｅｎｒａｅｈｃｉｔｔｙ５ｖｙｓｍｅｅｔｎｈｎｃｎｅｔｔｎｉ２ｏｘｅｔｗｅｏｃｎｒｉｓｍｍｏ／Ｌ，ｉｈｃｉｉｆａｉｒｔａｅｗａｅｒａｅｆｒａｄｎｅ，ｅ，ａｏＬｗｈｌｔｅａｔｔｏｃｄｐｏｅｓｓｄｃｅｓｄａｔｄｉｇＦ “ Ｆ “ ｅｖｙｅ
ｗｅｅｐｏｏｔｎｏｗｅｔｒｎａｄｓｙｅｎｍｅｌａ：ｃｒｏｒ．ｇ）Ｎ４１．％（ｇｗｔｏｄｎａａｉｈｎｔｒｐｒｏｆｈａｂａｎｂａａｗｓ６，ｏｎｆｕ０／，ＨＣ５ｇ）ａｒｌｉｇｃｐｃｔｈｉｏ４ｌ１％（ｇ２／，ｅｈｙ

黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育

Ｌ，Ｈ．～６０。ｐ５０．
１３培养条件．
将孢子菌悬液按体积分数０１．０的接种量，接种到发酵培养基中，Ｏ℃转速为１０ｒｍｎ３５ｉ的条件下／培养７ｄ离心收集上清液，，既为粗酶液。
基金项目：秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（项目编号：１０Ａ７）２１１１６。０
中图分类号：９３Ｑ３文献标志码：Ａ文章编号：６２７８（０２０－０２０１７－３２１）１７－９０５
黑曲霉产酶发酵的历史十分悠久，可用于生产淀粉酶、眭蛋白酶、酸纤维素酶、果胶酶、柠檬酸、没食子酸等多种酶制剂和食用酸，是公认的可用于食品生产的高安全性真菌【。此外，曲霉在生物工程ｌ】黑
，
要作用。目前，Ｊ已采用基因重组技术从大肠杆菌中提取该酶，由于大肠杆菌表达水平低、但提取困难，使其实际应用受到限制。而黑曲霉的ｐ葡萄糖苷酶基因表达水平较高，一利用黑曲霉作为其生产
菌株有突出优势。研究表明，黑曲霉产生的胞外蛋白酶能降解外源基因所表达的蛋白，使表达产物不能积累。为使黑曲霉表达异源ｐ葡萄糖苷酶的效果更好，－必须在不改变蛋白质外泌能力的前提下，使其胞外蛋白酶活性缺失【。本实验旨在通过紫外诱变方法筛选酸性蛋白酶缺失，Ｂ葡萄糖苷酶活性基８Ｊ而－
收稿日期：０２Ｏ－９２１－２０
１期
刘畅等
黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育
１４紫外诱变条件的筛选．
黑曲霉经固体斜面培养后，用无菌水洗下新鲜孢子，制成孢子悬浮液，用灭菌吸管吸取１Ｌ孢子０ｍ（数量为１１ｍＬ于培养皿中，１紫外灯下照射，Ｏ～Ｏ个／）于５ｗ停止照射后涂布平板，用锡箔纸包裹平板，完全避光２，４ｈ后拆开锡箔纸再培养４，８ｈ计算致死率。通过改变紫外照射时间、Ｊ照射距离和孢子悬液的浓度，选择最适的诱变条件。１５酸性蛋白酶缺陷菌株的筛选．１５１平板初筛将诱变后的黑曲霉孢子涂布于酪蛋白平板和ｐ葡萄糖苷酶筛选平板，．．－３Ｏ℃培养４８

酸性蛋白酶实验方案

酸性蛋白酶降解猪瘦肉肉实验方案一、实验目的①购得黑曲霉发酵生产的酸性蛋白酶，并在其最适条件下进行研究②研究该酸性蛋白酶降解瘦肉的降解肉类效果、对酵母生长的影响。

③根据实验前后的含氮量，研究该酸性蛋白酶对瘦肉的降解度二、实验原理①酸性蛋白酶特性：活力定义：一个酶活力指1g酶粉成1ml酶液在40℃.PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个活力单位（u/g或u/ml）pH范围：2.5～4.0（最适PH3.5）最适温度：55℃，低于40℃稳定性状：褐色或灰色粉末，由黑曲霉经发酵提炼而成而成，易溶于水用途：生化研究。

水解蛋白, 具有较强的水解能力能力，能将大分子的蛋白质水解成氨基酸等②水解度(DH)的计算公式:DH( %)) =水解液中总氨基态氮/原料中总氮含量[1]③凯氏定氮法测总氮：凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。

三、实验试剂和仪器①实验试剂：新鲜瘦猪肉(市售) ；酸性蛋白酶(5. 0×105IU/ g) (广州市凯升生物有限公司)、凯氏定氮法相关试剂②实验仪器：凯氏定氮蒸馏装置,雷磁酸度计,恒温水浴锅,电子天平、电磁炉四、实验方法①新鲜猪瘦肉预处理从市场上购得猪肉，清水洗净后，用小刀精心除去脂肪，将猪肉用自来水冲洗，去血1h后，冷冻保藏，一段时间后取出并切成块状，然后经高压灭菌灭菌，用无菌水冲洗，放置冰箱冷冻备用[3]。

②猪肉酶解工艺流程猪肉糜(经预处理) →配制pH3.5的柠檬酸缓冲液→按固液比（m/V）1：1匀浆[1、3]→加酶保温酶解→100℃灭酶15min→4500r/min离心 15min→上清液过滤→猪肉蛋白酶解液[3]③单因素实验组别设置在酶解时间5h、 pH3.5条件下实验，设置一个不加入酶的空白对照，每组设置3组平行对照：＊温度条件：55℃、30℃＊酶液加入量：按3%（M/M）（酶：底物）加入量[1]＊酵母培养：加入蛋白酶按6.5U/mL（酶：培养基）比例、不加蛋白酶对照进行液体培养猪瘦肉用量：每组15g，共8组，共120g。

黑曲霉酸性蛋白酶酶学性质的研究

ＡＳ产酸性蛋白酶可以作为生物饲料添加剂．Ｎ。．
关键词：黑曲霉；酸性蛋白酶；酶学性质中图分类号：Ｑ５＋：Ｑ４．７１文献标识码：Ａ文章编号：１０ — ０４２０）３００ — ４５６９９９２，３０１０８（０６０ — ０５０
一
一
维普资讯
相应的酶液稀释适当的倍数。以每克鲜曲所含的酶
活力表示酶活（ｇ）Ｉ。Ｕ・
１．酸性蛋白酶酶学性质的研究．４２
１００
８Ｏ
妲
酸性蛋白酶最适反应ｐ用０１ｏ・Ｈ：．ｍｌ『乳酸和Ｌ０ｏ・乳酸钠缓冲溶液配制ｐ．ｍｔＬ２Ｈ值分别为２，．０２，３，３，４，４．．．．．１％的酪蛋白溶液，以５０５０５的．０此为底物测定酶活力。酸性蛋白酶最适反应温度：通过恒温水浴锅将反应温度分别调到３，３，４，４，５，５Ｉ０５０５０５ｃ，Ｃ以ｐ．的１％Ｈ３０＋酪蛋白溶液为底物测定酶活力。０酸性蛋白酶热稳定性：将抽提初酶液在８０ｃＩＣ的恒温水浴中保温１，３，１ｉ；固态酶，２，５０ｍｎ曲在８烘箱中保温５００００ｓ０ｃＣＩ，１，２，３，６，迅速取出后立即放入冰水中，再按常规方法适当稀释测
１．菌株的分离纯化．１２
采用常规稀释分离法。
１．酸性蛋白酶酶活测定．２２
质研究还比较少，作为饲料添加剂，它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影
响，而且还要受饲料中的部分金属离子的影响，而这些过程中酶活极易受损，从而影响其作为饲料添加剂的效果。鉴于此，本文对黑曲霉ＡＳ产酸性Ｎ。

黑曲霉菌实验报告

一、实验目的1. 学习并掌握黑曲霉菌的分离与鉴定方法；2. 了解黑曲霉菌的形态特征和生长习性；3. 掌握微生物实验的基本操作技能。

二、实验原理黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一种广泛分布于自然界中的真菌，具有较强的发酵能力和酶活性。

本实验通过分离纯化黑曲霉菌，对其进行形态特征观察和生长条件研究，以了解其生物学特性。

三、实验材料1. 实验试剂：改良马丁培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、无菌水、无菌棉塞、无菌吸管、无菌培养皿等；2. 实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、接种环等；3. 实验样品：土壤、谷物、植物性产品等。

四、实验方法1. 样品处理（1）取适量样品（如土壤、谷物等）置于无菌培养皿中，加入适量无菌水，用玻璃棒充分搅拌，制成悬浮液；（2）取适量悬浮液，用无菌吸管吸取一定量的样品，涂布于改良马丁培养基上；（3）将涂布好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时。

2. 分离纯化（1）观察培养基上生长的菌落，选取典型的黑曲霉菌菌落；（2）用接种环挑取菌落，分别接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（3）将接种好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时，观察菌落特征。

3. 形态观察（1）用显微镜观察菌落形态特征，包括菌丝、分生孢子梗、分生孢子等；（2）记录菌落颜色、形状、大小、菌丝特征等。

4. 生长条件研究（1）将分离得到的黑曲霉菌接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（2）在不同温度、pH值、营养物质条件下，观察菌落生长情况；（3）记录菌落生长情况，分析生长条件对黑曲霉菌的影响。

五、实验结果与分析1. 分离纯化结果经过涂布培养和分离纯化，成功分离出黑曲霉菌。

菌落呈黑色，表面光滑，边缘整齐，具有明显的放射状沟纹。

2. 形态观察结果显微镜下观察，黑曲霉菌菌丝呈白色，具有分隔，分生孢子梗自菌丝顶端生出，呈直角或锐角，分生孢子球形，褐色。

3. 生长条件研究结果（1）温度：黑曲霉菌在25-37℃范围内生长良好，最适温度为37℃；（2）pH值：黑曲霉菌在pH值4.0-7.0范围内生长良好，最适pH值为6.0；（3）营养物质：黑曲霉菌在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上生长良好，适宜的营养物质为葡萄糖、酵母膏。

黑曲霉发酵产酸性蛋白酶

黑曲霉发酵产酸性蛋白酶江西科技师范学院生物工程专业《化工原理课程设计》说明书题目名称黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶专业班级 09级生物工程1班学号 20091466 20091479 20091470学生姓名钟鑫鑫张溧王涛指导教师常军博士2011 年10 月31 日前言蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。

在酸性环境下（pH 2.5-5.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。

该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒酱油造、饲料等。

其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以可澄清发酵醪液和成熟醪液。

酶作为一种新兴的物质以其高效，清洁的催化效果充斥着当今人类的思想，但是较高的技术要求和特殊菌株获得，使人们在酶这一产业发展中步履蹒跚，特别是发展中国家由于落后的科学技术，使他们在此项技术中发展更加困难，以中国为例在20世纪90年代就已经有酶企业投入生产，但是我的酶制剂销售额在世界市场只占4%，我国企业所用的酶制剂大多数是由丹麦的NOVO所提供的。

就目前情况看，世界各国都投入了大量资金用于酶事业的研究和生产。

相信在不久的将来酶一定会更加广泛的在生活中应用。

设计条件题目:1000L发酵罐，发酵生产酸性蛋白酶。

1发酵工艺1.1菌种的选择本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为3．350。

1.3菌种培养基的配制查氏培养基NaNO3 2gK2HPO41gK Cl 0.5gMgSO4 0.5gFeSO40.01g蔗糖30g琼脂15g水1000mLpH 自然121℃灭菌20min1.2发酵罐培养基的配制一般产酸性蛋白酶的微生物，它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源，按各种不同比例混合，添加无机盐配成各种培养基。

利用黑曲霉液态发酵制备生物酯化液及其应用

等物料，黑曲霉发酵液、己酸菌液等，按照实验配方,放入发
酵罐中，均匀混合并调整pH等，发酵30d＞设置不同酒精度、培养温度等条件，检测培养过程中反应体系的总酯量。
检测方法，总酸的测定：酸碱滴定法;pH的测定:pH计直接
测定；总酯的测定:蒸$ -皂化法冋;酒精度的测：比重瓶法;微量酯类的测定:色谱法叫
液体种子;然后按照5%的接种量将种子接入黑曲霉发酵罐，
在温度30V ,搅拌速度120r/min,通风量0.2m3/h的条件下发
酵72h，再经过离心分离浓缩等制得所需黑曲霉发酵酶液，并
将其储存在存储罐中备用。如图1所示，黑曲霉Mxzd-001菌
株接种到500mL液体发酵培养基中培养24h,即产生大量微
mature biological esteriEcation solution was prepared for the cellar test. The results show that the esterification liquid prepared by liquid
fermentation can make full use of the compound enzymes produced by Aspergillus Niger and effectively promote esterification, improve the
如表2所示，反应体系中含有一定量的乙醇、总酸、总酯等，为酯化提供物料基础。反应体系中适当的总酸和乙醇含量等有利于、醇等在酯化酶的用下向酯质转化，同时乙醇是极性溶剂，浓度加大时会抑制酶活性，制备黄浆水酯化液时适宜的乙醇含量控制在6%~9%左右。己酸菌液中含有一定的己酸、酯化酶等,己酸作为反应体系中的底物，同时己酸是极性溶剂，当其添加量过大时，可引起酶活性下降，从而降低催化效率,制备黄浆水酯化液时适宜的己酸菌液添

菌种报告-黑曲霉

菌种报告—黑曲霉一、黑曲霉简介①、黑曲霉（Aspergillus niger）属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。

可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，是重要的发酵工业菌种。

②、培养温度23～28℃，好氧二、使用注意事项①、是四类病原微生物，即在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。

但由于生长快速，极易通过空气扩散污染环境，对产品的生产检验人员与环境构成威胁。

故操作过程要在阳性室生物安全柜中进行。

②、所有的培养物、储存物及其它的废物在释放前，均应121℃，30min湿热蒸汽灭菌。

实验结束后，用0.1%的新洁尔灭擦拭台面，照紫外消毒。

菌种保存方案—黑曲霉（Aspergillus niger）1、实验材料：器具：-80℃冰箱，2～8℃冰箱，试管，电动助吸器，锥形瓶，恒温培养摇床，1ml移液管，10ml移液管，冷冻管，振荡器，棉塞，接种环，250ml盐水瓶，500ml 盐水瓶试剂：冻干菌种，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，TSA平板，SDA平板，20%甘油，含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水2、实验步骤：2.1 菌种复苏和复壮（改良马丁培养基）2.1.1 将干菌种（0代）按上述步骤转移到装有100ml改良马丁液体培养基的锥形瓶中复苏（第1代），23～28℃摇床震荡培养5天。

2.1.2 用接种环挑起活化后的孢子悬液，划线到改良马丁琼脂斜面复壮，接种10支试管（第2代），23～28℃静置培养5～7天。

2.1.3 向每支试管中加入5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水，反复吹打洗脱孢子。

将孢子悬液全部转移至250ml盐水瓶中，2～8℃冻存备用。

2.2 稀释倍数探索2.2.1 取1ml孢子悬液加入9ml生理盐水中，混匀得10-1管，同法依次稀释至10-6。

2.2.2 取10-3～10-6梯度稀释孢子悬液，1ml涂布SDA平板，各做3个平行。

黑曲霉液态发酵生产植酸酶的动力学研究_石坚

黑曲霉液态发酵生产植酸酶的动力学研究石　坚1　孙君社1　苏东海1　经　玲2(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;2.中国农业大学理学院,北京100083)收稿日期:2002-09-16作者简介:石　坚,硕士研究生;孙君社,博士,教授,研究方向为生物技术在农产品加工中的应用。

摘　要　对黑曲霉(Aspergillus niger N D313)液态发酵生产植酸酶的发酵过程和发酵动力学进行了研究。

在摇瓶试验得到基本发酵工艺参数的基础上,应用10L 生物反应器进行放大试验取得了较好的结果,其最大菌体量(干重)达到1.19g ·100mL -1,酶活力达到3.6u ·mL -1。

试验通过分批补料手段控制比生长速率的变化,得到了描述发酵过程的动力学模型并回归了模型参数。

利用数学计算软件对试验数据与模型进行拟合,结果证明所建立的动力学模型能较好地反映并预测植酸酶的发酵过程。

关键词　黑曲霉;植酸酶;液态发酵;动力学模型中图分类号　T Q 920.1 文章编号　1007-4333(2003)02-0045-04 文献标识码　AKinetics stu dy on the production of phytase in submergedfermen tation by Asp .nigerShi Jian 1,　Sun Junshe 1,　Su Don ghai 1,　Jin g Lin g 2(1.College of Fo od Science &Nutritio nal E n gineerin g ,China A gricu ltural University ,B eijin g 100083,China ;2.College of S cien ce ,China A gricultural U niversity ,Beijin g 100083,China )Abstract Based on the p rimary fermentation p arameters ob tained from flake cultures ,the law of g rowth and m etabolism of Asp .niger ND 313and the fermentation kinetic models were studied in an auto control b ioreactor .The fermentation in bioreactor was successfully p erformed with a maxim al biomass concentration (d ry m ass )of 1.19g ·100mL -1and a maximal enzym e activity of 3.6μ·m L -1.Then the kinetic formula of cell growth rate ,phytase produc -tion rate and glucose consumption rate were inferred by controling the specific biomass growth rate .The results of m athem atic fitting between model cal culated values and experimental val ues p roved the valid i ty and rationality of the kinetic model s .Key words Asp .niger ;phytase ;submerg ed -fermentation ;kinetics m odel 来源于微生物的植酸酶(Phy tase ,EC .3.1.3.8)能催化植酸,使其水解为各级磷酸肌醇、肌醇和正磷酸盐的混合物。

黑曲霉液态发酵产糖化酶条件的研究

３．ＡｎｈｕｉＳｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＥｎｇｉｎｅｅｉｒｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｙｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｂｏｚｈｏｕ，Ａｎｈｕｉ２３６８２０，Ｃｈｉｎａ）
ｍａｔｅｒｉｌａｄｏｐｅｐｔｏｎｅ，２９℃ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｃａｌｌｂｅｕｓｅｄａｓｈｅｔｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｍａｘｉｍｕｍｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；ｌｉｑｕｉｄ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ
葡萄糖淀粉酶简称糖化酶，可水解淀粉、糊精、
黑曲霉。１．１．２实验试剂可溶性淀粉、葡萄糖、酵母膏、琼脂、蛋白胨、硫酸铜、次甲基蓝、亚铁氰化钾、氢氧化钠、硫酸亚铁、
１．１－３实验主要仪器恒温培养箱、立式自动电热压力蒸气灭菌锅、数
糖原等物质，产物为葡萄糖。在工业发酵生产酒精、有机酸、氨基酸等过程中淀粉液化后的糖化酶作用

黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应

６．ｐ０，Ｈ５．。５
紫外线诱变处理：接种环取新鲜ＰＡ斜面用Ｄ上的黑曲霉孢子少许，加入无菌水中进行稀释，用血球计数板进行计数，每毫升溶液中孢子量约使为５０００个，０１ｍ取．Ｌ涂布初筛平板。３ ℃恒温０培养４ｈ让孢子萌发，用１紫外灯照射８，然后５ｗａ后紫外灯与平板垂直距离３ｍ）在黑暗的ｒｎ（ｉ０ｅ，培养箱中继续培养３ｄ挑取透明圈大的菌落用作，亚硝基胍诱变处理菌株。亚硝基胍诱变处理：接种环取新鲜ＰＡ斜用Ｄ面上经紫外线诱变处理的黑曲霉孢子少许，入加无菌水中进行稀释，用血球计数板计数，使每毫升溶液中孢子量约为５０个，３ｍ孢子悬液，００取Ｌ加入等体积的亚硝基胍溶液（＃ｍ）充分混合，３ｍＬ，于３ ℃振荡处理１，出稀释涂平板，００取ｈ３ ℃培养３ｄ挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验。选，育出黑曲霉Ａｐ５０ — 变异株。ｓ６９７１３黑曲霉Ａｐ５０ — ．ｓ６９７固体发酵条件培养时间６，３０ｏ后３２变０ｈ前０ｈ３Ｃ，０ｈ５ｏＣ温培养，培养基ｐ．，Ｈ５０培养基持水量５％左右，０
黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造刘克武黄新河，，赵巍
（四川大学生命科学学院，四川成都６０６）１Ｏ４
摘要：从麸醋母曲中分离出黑曲霉Ａｐ５０并以此为诱变出发菌株，ｓ６９采用紫外线照射结合亚硝基胍诱变剂处理，筛选出酸性蛋白酶高产变异株Ａｐ５０．。用盐溶加温提取法从Ａｐ５０－ｓ６９７ｓ６９７固体发酵物料中提取酸性蛋白酶粗酶液，Ｄ．经Ｃ３０型中空纤维柱超滤浓缩，用于食醋酿造物料蛋白的酶解催化，可大幅度提高醋液中氨基

黑曲霉发酵产性蛋白酶

文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.江西科技师范学院生物工程专业《化工原理课程设计》说明书题目名称黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶专业班级 09级生物工程1班学号学生姓名钟鑫鑫张溧王涛指导教师常军博士2011 年10 月31 日前言蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。

在酸性环境下（pH 2.5-5.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。

该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒酱油造、饲料等。

其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以可澄清发酵醪液和成熟醪液。

就目前情况看，世界各国都投入了大量资金用于酶事业的研究和生产。

相信在不久的将来酶一定会更加广泛的在生活中应用。

设计条件题目:1000L发酵罐，发酵生产酸性蛋白酶。

黑曲霉LH2446产纤维素酶液体发酵条件的研究

第27卷第3期江西农业大学学报Vol.27,No.3 2005年6月Acta Agriculturae Universitatis J iangxiensis June,2005文章编号:1000-2286(2005)03-0466-03黑曲霉LH2446产纤维素酶液体发酵条件的研究汪世华1,2,胡开辉2,黄碧芳2,余文英2,彭利民3 (1.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002;2.福建农林大学生命科学院开放实验室,福建福州350002;3.武汉隆华生物股份有限公司技术中心,湖北武汉430000)摘要:采用诱变后的黑曲霉LH2446液体发酵生产纤维素酶。

确立了产酶最佳条件:5%稻草粉为碳源,1%的黄豆粉为氮源,培养基起始pH值为pH6.5,250mL三角瓶中装培养基75mL,培养时间为60h,温度为30℃。

在最适条件下产纤维素酶的最高产量为23600U/g。

关键词:纤维素酶;液态发酵;产酶条件中图分类号:Q55 文献标识码:AStudi es on the Opti m u m Conditi ons for Sub merged Fer ment ati on of Aspergillus n iger LH2446to Produce Cellul aseWANG Shi-hua1,2,HU Kai-hui2HUANG B i-fang2,Y U W en-ying2,PENG L i-m in3 (1.Key Laborat ory of B i opesticide and Che m ical B i ol ogy,M inistry of Educati on,China,Fujian,Agri2 culture and Forestry University,Fuzhou350002,China;2.Open Laborat ory of College of L ife Science,Fu2 jian Agriculture and Forestry University,Fuzhou350002,China;3.W uhan Longhua B i otechnol ogy Co. L td.,W uhan430000,China) Abstract:The study was conducted t o exp l ore the op ti m u m conditi ons f or submerged fer mentati on of A s2 pergillus niger LH2446t o p r oduce cellulase.It was f ounded that the op ti m um conditi ons were as foll ows:the carbon s ource was6%stra w power;the nitr ogen s ource was1%bean cake;75mL media were filled in the 250mL flask with medium pH6.5,culture ti m e60h and culture te mperature30℃.Under the op ti m um con2 diti ons,t o the highest out put of cellulase was23600U/g.Key words:cellulase;sub merged fer mentati on;op ti m u m conditi ons纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称,主要有C1酶和Cx酶,C1酶和Cx酶协同作用可将天然纤维素降解为葡萄糖。

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2014级生物工程专业实验(II)
黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶
一、实验目的
掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。

二、实验材料
2.1菌株
黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。

2.2 实验试剂
糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。

2.3实验设备
DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。

三、角蛋白酶液态发酵实验
3.1工艺流程
3.2培养基及培养条件
3.2.1种子培养基及培养条件
（1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。

将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。

(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。

3.2.2发酵培养基及培养方法
发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。

培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。

3.3 检测方法
3.3.1菌体浓度的测定
干重法。

3.3.2还原糖的测定
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。

(1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。

向9支比色管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。

以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测定OD值。

结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。

表1 葡萄糖标准曲线的制作
管号葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL 最终浓度/(mg/mL)
1 0 0.5 0
2 0.05 0.45 0.1
3 0.1 0.
4 0.2
4 0.1
5 0.35 0.3
5 0.2 0.3 0.4
6 0.25 0.25 0.5
7 0.3 0.2 0.6
8 0.35 0.15 0.7
9 0.4 0.1 0.8
3.3.3酸性蛋白酶活力的测定
Folin-酚法。

16周实验日程安排
1、6.11日（周日）
种子培养基的准备
（1）固体麸皮种子：实验室研究生事先准备
（2）液体种子：周日9:00接种，研究生事先准备。

2、6.12日（周一）
（1）下午14:30：实验准备、种子培养基、发酵培养基的配制
（2）发酵罐操作、电极校正现场培训(第一组15:30；第二组16:30)
3、6.13 日（周二）
（1）9:00 发酵罐接种培养(两组同时进行)
（2）安排同学值班，每8 h取样一次
（3）大肠杆菌质粒提取、酶切、电泳
3、6.14日（周三）
（1）取样分析检测各项指标
（2）安排同学值班
4、6.15日（周四）
（1）取样分析检测各项指标
（2）安排同学值班、测酶活试剂准备
5、6.16日（周五）
（1）9:00 上罐结束，完成清洁卫生
（2）完成发酵各项参数的测定
需要准备的材料：
1.种子培养基：液体，4瓶（50mL/500mL）；固体，25g(干重)
2.发酵培养基：
3.5 L
3.发酵罐灭菌、电极校正：牛皮纸、棉线、无水亚硫酸钠、pH缓冲液、打火机、
酒精、相关药品试剂等。

组长：联系电话：小组成员：
4
组长：联系电话：小组成员：
5。