黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验

2014级生物工程专业实验(II)

黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶

一、实验目的

掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。

二、实验材料

2.1菌株

黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。

2.2 实验试剂

糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。

2.3实验设备

DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。

三、角蛋白酶液态发酵实验

3.1工艺流程

3.2培养基及培养条件

3.2.1种子培养基及培养条件

（1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。

(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。

3.2.2发酵培养基及培养方法

发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。

3.3 检测方法

3.3.1菌体浓度的测定

干重法。

3.3.2还原糖的测定

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。

(1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。向9支比色管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。

表1 葡萄糖标准曲线的制作

管号葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL 最终浓度/(mg/mL)

1 0 0.5 0

2 0.05 0.45 0.1

3 0.1 0.

4 0.2

4 0.1

5 0.35 0.3

5 0.2 0.3 0.4

6 0.25 0.25 0.5

7 0.3 0.2 0.6

8 0.35 0.15 0.7

9 0.4 0.1 0.8

3.3.3酸性蛋白酶活力的测定

Folin-酚法。

16周实验日程安排

1、6.11日（周日）

种子培养基的准备

（1）固体麸皮种子：实验室研究生事先准备

（2）液体种子：周日9:00接种，研究生事先准备。

2、6.12日（周一）

（1）下午14:30：实验准备、种子培养基、发酵培养基的配制

（2）发酵罐操作、电极校正现场培训(第一组15:30；第二组16:30)

3、6.13 日（周二）

（1）9:00 发酵罐接种培养(两组同时进行)

（2）安排同学值班，每8 h取样一次

（3）大肠杆菌质粒提取、酶切、电泳

3、6.14日（周三）

（1）取样分析检测各项指标

（2）安排同学值班

4、6.15日（周四）

（1）取样分析检测各项指标

（2）安排同学值班、测酶活试剂准备

5、6.16日（周五）

（1）9:00 上罐结束，完成清洁卫生

（2）完成发酵各项参数的测定

需要准备的材料：

1.种子培养基：液体，4瓶（50mL/500mL）；固体，25g(干重)

2.发酵培养基：

3.5 L

3.发酵罐灭菌、电极校正：牛皮纸、棉线、无水亚硫酸钠、pH缓冲液、打火机、

酒精、相关药品试剂等。

组长：联系电话：小组成员：

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