实验十三动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
实验十三 动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
2007-2
实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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三、实验操作
（2）磷酸的鉴定 ）
管号 测定管 对照管 水解液 5%H2SO4 钼酸铵 10d _ _ 10d 5d 5d 氨基萘酚 磺酸 20d 20d 颜色变化 ? ?
放置3分钟，沸水浴 分钟 分钟， 放置 分钟，沸水浴4分钟，观察表较颜色差别 分钟
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
3
二、实验原理
1.核蛋白的提取： 核蛋白的提取： 核蛋白的提取 三氯醋酸 肝组织匀浆 核蛋白沉淀 核蛋白沉淀
原因： 原因：三氯醋酸可沉淀蛋白质
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
2 .从核蛋白中提取核酸 从核蛋白中提取核酸
10%NaCl
核蛋白
核酸钠 + 蛋白质沉淀
原因： 溶液中： 原因：10%的NaCl溶液中：核酸的溶解度高 的 溶液中 蛋白质的溶解度低
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二、实验原理
2 .从核蛋白中提取核酸 从核蛋白中提取核酸
10%NaCl
核蛋白
核酸钠 + 蛋白质沉淀
95%乙醇 乙醇
核酸钠沉淀 核酸钠沉淀
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
3.核酸（DNA、RNA）成分的鉴定 核酸（ 核酸 、 ）
（3）核糖的鉴定 ） 浓硫酸 核糖 糠醛 3，5-二羟基甲苯 ， 二羟基甲苯 绿色化合物
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
3.核酸（DNA、RNA）成分的鉴定 核酸（ 核酸 、 ）
生化实验核酸实验报告
实验名称：动物组织中核酸的提取与鉴定实验日期：2023年11月15日实验目的：1. 学习和掌握动物组织中DNA和RNA的提取方法。
2. 了解核酸的组成成分，并进行鉴定。
3. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质。
实验原理：核酸是生物体内重要的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
DNA主要存在于细胞核中，而RNA主要存在于细胞质中。
本实验通过提取动物组织中的DNA和RNA，并对其进行鉴定，以了解核酸的基本特性。
实验材料：1. 动物组织（如肝组织）2. 提取试剂：酚/氯仿、Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、SDS、RNA酶、蛋白酶K、乙醇、异丙醇等3. 实验仪器：高速离心机、电热恒温恒湿箱、紫外可见分光光度计、凝胶成像系统、移液器、玻璃棒等实验步骤：一、DNA的提取1. 将动物组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl和SDS，充分混匀。
2. 加入蛋白酶K，置于55℃水浴中消化1小时。
3. 加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，静置10分钟。
4. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
5. 加入等体积的氯仿，充分混匀，静置10分钟。
6. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
7. 加入2倍体积的95%乙醇，混匀，静置2小时。
8. 12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
9. 用75%乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于适量Tris-HCl缓冲液中。
二、RNA的提取1. 将动物组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl和SDS，充分混匀。
2. 加入RNA酶和蛋白酶K，置于55℃水浴中消化1小时。
3. 加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，静置10分钟。
4. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
5. 加入等体积的氯仿，充分混匀，静置10分钟。
6. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
7. 加入2倍体积的95%乙醇，混匀，静置2小时。
动物组织中核酸的提取及其组成成分的鉴定
加数滴使呈碱性
10
10
硝酸银
灰褐色沉淀
核糖鉴定
试剂(滴)
核酸水解液 5% H2SO4 3,5-二羟甲苯
管号
1#实验管
2#对照管
4
–
–
4
6
6
沸水加热5min,比较两管颜色.
核糖 浓酸 糖醛 + 3,5二羟甲苯
3H2O
绿色复合物
脱氧核糖鉴定
试剂(滴)
核酸水解液 5% H2SO4 二苯胺试剂
管号
1#实验管
RCF在离心管内不相同，靠转子外最大, 靠中心轴最小，有表可查。
离心机种类及用途
1、低速离心机 常规使用,台式,最大速度3 000~6 000r/min,
RCF可达6 000g。常用于收集细胞、细胞核或 叶绿体等较大的细胞器、抗原-抗体复合物等 粗颗粒沉淀。 2、高速离心机
较大立式，常有制冷系统。最高速率可达 25 000r/min、RCF达60 000g。用于分离微生 物细胞、线粒体、溶酶体等细胞器和蛋白质沉 淀物。
开 始 做 实 验 ！
亚细胞结构的分离
生物颗粒在离心场中所需离心加速度和时间
离心加速度 时间
沉降的组分
100g 4 000g 15 000g 30 000g 100 000g
5min 10min 20min 30min 3~10h
真核细胞 叶绿体 细胞碎片 细胞核 细菌、线粒体 溶酶体、细菌细胞碎片 核糖体
实验步骤
猪
3、超速离心机
一类速度非常高的离心机，最大转速 可超过30 000r/min，最大RCF可达600 000g ，用于沉淀核糖体、膜泡等小的细胞器和 生物大分子。具有精密的制冷、真空装置 4、微。量离心机
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
实验目的：
1. 了解动物组织中核酸的提取方法；
2. 掌握核酸鉴定实验的基本步骤；
3. 实验中验证提取的核酸是否具有一定的纯度。
实验原理：
动物组织中的核酸主要包括DNA和RNA两种类型，可利用
溶解细胞膜、蛋白质酶解、沉淀和洗涤等步骤提取核酸，并通过酶切鉴定分离所得核酸的类型。
核酸的鉴定主要通过比色、电泳或光谱等方式识别。
此外，核酸的纯度可通过测量260
nm和280 nm的光密度比值来评估。
实验步骤：
1.取动物组织，并将其切碎放入离心管中；
2.加入溶解液（如Tris-HCl缓冲液 pH 8.0），彻底溶解组织；
3.加入蛋白酶，使蛋白质完全酶解，生成核酸；
4.加入溶液（如EDTA），停止蛋白酶的作用；
5.加入酒精，将核酸沉淀下来；
6.用乙醇洗涤核酸沉淀，去除杂质；
7.将核酸用去离子水溶解，并进行测量；
8.通过酶切反应鉴定核酸的类型；
9.通过比色、电泳或光谱等方式识别核酸；
10.通过测量260 nm和280 nm的光密度比值来评估核酸纯度。
实验结果：
提取的核酸样品通过酶切反应鉴定为DNA。
通过比色、电泳
或光谱等方式识别，验证了核酸的存在。
通过测量260 nm和280 nm的光密度比值为1.8，表明核酸具有一定的纯度。
实验结论：
本实验成功提取了动物组织中的DNA核酸，并通过酶切反应鉴定了其类型。
通过比色、电泳或光谱等方式识别，验证了核酸的存在，并通过测量260 nm和280 nm的光密度比值评估了核酸的纯度。
动物组织中核酸的提取与鉴定
动物组织中核酸的提取与鉴定
一、生物大分子制备方法基本设计思路
流程：选材→破碎→抽提→浓缩→分离纯化 破碎方法：机械、物理、化学、生物 浓缩方法：沉淀（盐析，可逆变性，有机溶剂等） 生化实验三大分离技术： 离心技术 层析技术 电泳技术
二、实验方法及设计流程
1、提取（3课时） 猪肝 → 匀浆→ 三氯醋酸沉淀核蛋白→ 离心（3200-3500 rpm，5min）
复习与计思路， 写出核酸提取制备的设计原理。
2、样品如何判断是DNA、还是RNA,反应条 件如何？
3、造成产量偏低的原因，从提取过程分析。
动物组织中核酸的提取与鉴定实验方案
实验原理
本实验运用盐溶液法用动物肝脏分离制备DNA 核酸在细胞内都与蛋白质结合成核蛋白，要分离核 酸必须使核酸与蛋白质分离并除去蛋白质。 已知在0.14mol/LNaCl溶液中核糖核蛋白溶解度最 大，而脱氧核糖核蛋白溶解度最小，在1mol/LNaCl 溶液中脱氧核糖核蛋白溶解度增大，核糖核蛋白的 溶解度则明显下降，根据这种特异性即可把这两种 核蛋白分开
动物猪肝猪羊兔组织捣碎机离心机量筒烧杯锥形瓶玻璃棒离心管称量瓶滴管等实验步骤取动物肝脏浸入预先在冷水浴中冷却的014mollnacl001molledta溶液反复洗涤几次直至组织无血为止将洗净的组织剪成碎块称取10g加入20ml014mollnacl001molledta溶液在组织捣碎机中匀浆44000rmin离心15分钟后弃上清液在沉淀中加入4倍体积的低温014mollnacl001molledta溶液搅匀后离心弃上清液如此反复23次保留沉淀实验步骤将沉淀物悬于5倍体积的014mollnacl001molledta溶液中搅匀边搅拌边滴加sds溶液直至sds的最终浓度达10gl为止然后加入固体nacl使nacl最终浓度达1moll继续搅拌3045min以确保nacl全部溶解将上述混合液倒入一个具有塞的锥形瓶中加入等体积的氯仿异戊醇振荡10min在室温3000rmin离心10min此时可见3层小心吸取上层水相记录体积放入锥形瓶中再加入氯仿异戊醇混合物振荡离心如此反复抽提数次直至界面处不出现蛋白凝胶为止最后一次离心后小心吸取上层溶液计量体积放入干燥小烧杯加入2倍体积的预冷95乙醇产生沉淀后4000rmin离心10min弃去上清液沉淀即为dna实验步骤加2倍体积预冷乙醇如用滴管滴加边加边慢慢顺一个方向在烧杯中搅动有粘稠维丝物缠在玻璃棒上直至再无丝状物缠上为止将玻璃棒上的dna取下依次用75乙醇95无水乙醇洗一次放入干净量瓶中至于干燥器中抽干十二烷基硫酸钠sds组织捣碎机离心机宝山壁画宝山壁画是引人注目的昂贵文物
动物组织核酸的提取与鉴定
动物组织核酸的提取与鉴定一.目的要求（1）了解生物大分子制备的基本技术。
（2）学习和掌握用盐溶法从动物组织提取分离DNA的原理和操作技术。
（3）学习和掌握鉴定核酸的方法。
二. 材料与用品材料与试剂实验对象动物肝脏仪器：匀浆器（研钵）、冰盒、离心机、电磁炉、玻棒、冰箱。
试剂：0.9%生理盐水、20%三氯醋酸、95%乙醇、10%NaCL溶液。
三. 原理动物含有丰富的DNA，可作为提取DNA的良好材料，在细胞核内，核酸通常与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白的形式存在。
在不同浓度的盐溶液中，脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白的溶解度有很大差别。
当NaCl浓度为0.14mol/L时，脱氧核糖核蛋白的溶解度极低，仅为其在纯水中溶解度的1%，而核糖核蛋白的溶解度相当大，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开。
提取出来的脱氧核糖核蛋白须除去蛋白质。
当脱氧核糖核蛋白与氯仿-异戊醇混合液一起振荡时，蛋白质变性而与核酸分开，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间，DNA溶于在水相中。
经过分离后，再用乙醇将水相中的DNA沉淀出来。
为了防止脱氧核糖核酸酶（DNase）的作用而引起DNA降解损失，在用于提取的缓冲液中均含有0.001mol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螯合剂，以除去保持DNase活性所必须的Mg2+。
为了防止DNA的变性，操作尽可能在低温下进行。
四. 内容与方法1. 提取DNA（1）取动物肝脏在冰浴上去除脂肪和结缔组织，切成小块，称取20g，加入60mL预冷的0.14mol/L NaCl – 0.01 mol/L EDTA溶液，在组织捣碎机中高速匀浆5~10min。
（2）匀浆后的组织糜于4℃、10000r/min离心10min，弃去上清液。
在玻璃匀浆器中，用4倍体积的低温0.14mol/L NaCl – 0.01 mol/L EDTA溶液洗涤沉淀，然后按上述操作进行离心，弃去上清液。
动物组织中的核酸提取与鉴定
动物组织中核酸的提取与鉴定一、原理根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。
二、试剂1.地衣酚（orcinol）试剂：称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。
2.二苯胺试剂：称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。
3. 0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；4. 1mol/L氯化钠溶液，250ml；5. 95%乙醇（冷）；6. 氯仿；7. 异戊醇三、器材a)冷冻离心机（3000rpm）b)组织捣碎机或组织匀浆器c)不锈钢剪刀d)冰浴e)试管、试管夹f)量筒、吸管g)带塞比色管、带塞离心管h)玻棒、烧杯i)电炉等三、方法1. 制匀浆将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl 溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。
将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。
上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。
2. 核酸的抽提2.1RNA的提取0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。
用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。
低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。
动物组织中核酸的提取与鉴定
1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷 钼酸，后者在还原剂的作用下。还 原成蓝色的钼蓝。 2、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针 状结晶 3、戊糖 （1）核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生 成糖醛，后者和3，5-二羟甲苯缩 合而成绿色化合物。 （2）脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟 （基）-γ-酮（基）戊醛，它与二 苯胺作用生成蓝色化合物
动物组织中核酸 的提取与鉴定
实训原理
实训试剂及 仪器
实训步骤
动物组织细胞中的核酸大部分与蛋白质 结合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核 蛋白，并用95%乙醇加热除去沉淀上的脂 类杂质，然后用10%氯化钠从核蛋白上分 离出核酸（以钠盐形式存在），加入乙醇 可以析出。
析出的核酸均有核苷酸组成，在单核苷酸 中含有磷酸、有机碱或戊糖。核酸经硫酸 水解后可游离出这三类物质，此三类化合 物可用下列方法鉴定：
核糖的鉴定 取中试管2支，分别标明测定管 与对照管，然后依次加入下列各试剂。
管号
测定管 对照管
水解液
4滴 -
5%H2SO4
4滴
3 ， 5- 二 羟 甲苯试齐
6滴 6滴
实验步骤
脱氧核糖的鉴定 取长试管2支，分别标明测 定管与对照管，然后依次加入下列各试剂
管号 测定管 对照管
水解液 20滴 -
5%H2SO4 -
实验步骤
（三）核酸水解 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸 馏水2ml。振摇至沉淀溶解后， 加入10％H2SO42mL摇匀，于 沸水浴中加热10分钟，即得核酸 水解液，用流水冷却后进行定性 试验。
实验步骤
（四）RNA与DNA成分的鉴定 1、嘌呤碱的鉴定 取中试管2支，分别标明测定管
与对照管，依次加入下列各试剂。
实验步骤
（二）分离提取 1、取全部匀浆于离心管内，加20%三氯醋酸5ml，用 玻璃棒搅匀，静置3分钟后，以3000转/分离心10分钟。 2、弃上清液，沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水 浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免 酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 3、倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCl溶液 4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出； 冷却后再离心。 4、将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可 能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白 色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒 入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白 色沉淀即为核酸钠。
核酸提取操作与含量测定
异硫氰酸胍/苯酚法
Ø 步骤:
• 材料准备：尽量新鲜。 • 裂解变性：异硫氰酸胍。使细胞及核蛋白复合物变性，释放
RNA，有效抑制核酸酶。
• 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 • 洗涤：70％乙醇。 • 沉淀：异丙醇、无水乙醇。
3. 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量）
4. 低温沉淀，延长沉淀时间 5. 加辅助物，促进沉淀 6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤
液吸出，勿倾倒
q 异硫氰酸胍/苯酚法
Ø 原理： • 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体
上的蛋白变性，核酸释放； • 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别
Ø 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的 方法
q 蛋白质的去除：
Ø 酚/氯仿抽提 Ø 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） Ø 高盐洗涤 Ø 蛋白酶处理
q 多糖的去除：
Ø 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
Ø 用多糖水解酶将多糖降解。
核酸提取操作与含量测定
l 核酸分离提取的原则是什么？要达到哪些要求？ l DNA和RNA提取总需要注意的要点有哪些？ l 核酸如何定量测定，简单说说它们的依据呢？
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物
信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的 污染应降低到最低程度；
③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时， 应去除RNA，反之亦然。
实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 实验总结与讨论
01
实验目的
掌握动物组织核酸的分离方法
01
掌握动物组织中DNA和RNA的分离原理及操作步骤。
02
了解不同动物组织中核酸的分布和含量差异。
03
掌握核酸分离过程中的注意事项和技巧，提高实验 效率。
3
了解不同测定方法的优缺点和应用范围，以提高 测定的准确性和可靠性。
02
实验原理
动物组织核酸的分离原理
动物组织中核酸的提取
动物组织中的核酸通常与蛋白质和其 他生物分子紧密结合，需要通过一系 列的分离步骤将其从其他组分中分离 出来。这些步骤包括细胞破碎、离心 分离、洗涤和沉淀等。
核酸的纯化
为了获得高纯度的核酸，需要使用各 种化学和物理方法去除杂质，如酚-氯 仿抽提、乙醇沉淀和离子交换等。
Northern杂交
利用标记的探针与核酸进行杂交，通过放射自显影或化学发光等方法 测定杂交信号强度，推算出核酸的含量。
04
实验结果分析
核酸分离结果分析
核酸分离纯度
通过观察电泳图谱，可以判断核酸是否成功分离，以及是否存在 杂质和降解。
核酸得率
通过称重和测量体积，可以计算出分离得到的核酸得率，以评估 实验效率。
对于病毒核酸，可以通过限制性 酶切和电泳检测，确定病毒的种 型。
核酸含量测定结果分析
吸光度测定
通过紫外可见分光光度计测定核 酸溶液的吸光度，可以计算出核 酸的浓度。
荧光定量PCR
利用荧光标记的特异性探针，通 过荧光信号的累积进行实时定量 检测，可以准确测定核酸的含量。
核酸化学—核酸的提取、分离和含量测定
5’
4’
1’
3’ 2’
(OH)
5’
4’
1’
3’ 2’
(OH)
核苷
H N
N
H
H N
9
N
H
腺嘌呤
HOH2C5′ O OH
4′
1′
3′ 2′
OH OH 核腺糖苷
A
G
C
U
dA
dG
dCLeabharlann dT核酸长链记录方式之演进
A T CGA TCG
5’
3’
P
OH
B 1’ R 2’ 3’
N
N H
N
A
7
6
5
1
8
9
4
2
3
鸟嘌呤guanine
O
N NH
N H
N
NH 2
G
嘧啶（Pyrimidine）
尿嘧啶 uracil
O
NH
胞嘧啶 cytosine
NH 2
N
4
5
3
6
2
1
胸腺嘧啶 thymine
O
NH
N
O
H
U
N
O
H
C
N
O
H
T
DNA中的四种碱基及它们间的氢键
胸腺嘧啶 T
胞嘧啶 C
腺嘌呤 A
DNA的粗提取与鉴定
1. NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L 时,DNA的溶解度最低。
2.DNA不溶于酒精溶液。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。
实验步骤 1、胀破细胞，得DNA溶液
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告1. 引言核酸（DNA和RNA）是生物体内存储遗传信息和调控基因表达的重要分子。
对于研究生物的遗传特征和进化过程，核酸的提取与鉴定是必不可少的实验步骤。
本实验旨在通过提取动物组织中的核酸，使用常用的鉴定方法分析核酸的质量和纯度。
2. 实验原理核酸提取与鉴定的基本原理是将动物组织中的核酸从其他的细胞组分（如蛋白质、唾液等）中分离出来，并通过吸光度测定和凝胶电泳等方法进行核酸的定性和定量。
2.1 核酸提取核酸提取的步骤包括细胞破碎、蛋白质的去除和核酸的沉淀。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、柱式提取法和商业试剂盒法等。
2.2 核酸定性和定量核酸的定性主要通过凝胶电泳进行，通过核酸带的迁移速度和分子量，可以初步判断核酸的纯度和是否受到降解。
核酸的定量则是通过吸光度测定，利用核酸特征的吸收峰波长（260 nm）测定核酸的浓度。
3. 实验材料与方法3.1 实验材料•动物组织样品•细胞破碎缓冲液•蛋白酶•酚-氯仿提取液•乙醇•TE缓冲液•焦亚硫酸铵•乙酸•0.8%琼脂糖凝胶3.2 实验步骤1.将动物组织样品切碎并加入细胞破碎缓冲液，用超声波破碎细胞壁。
2.加入蛋白酶进行蛋白质的消化。
3.加入酚-氯仿提取液，离心分离上层的核酸。
4.将上层的核酸转移到新离心管中，加入等体积的冷乙醇沉淀核酸。
5.离心沉淀的核酸，去除上层的乙醇并用TE缓冲液重悬核酸。
6.使用吸光度计测定核酸的纯度和浓度。
7.进行凝胶电泳，观察核酸的迁移带和分子量。
4. 结果与分析4.1 核酸提取结果通过核酸提取实验，成功从动物组织中提取到了核酸。
提取的核酸样品呈现无色透明的状态，说明核酸净化得较好。
4.2 核酸定性和定量结果将提取得到的核酸样品进行凝胶电泳，观察到了明显的核酸带。
通过与分子量标准品的比较，可以初步判断核酸的分子量范围是否正常。
通过吸光度测定，确定了核酸的浓度。
5. 结论通过本实验，成功提取到了动物组织中的核酸，并通过凝胶电泳和吸光度测定等方法对核酸进行了定性和定量分析。
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。
制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。
但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。
Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组DNA 紫外吸收法二苯胺Key words:poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine引言：制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。
核酸的提取及含量的测定
地依酚试剂
RNA含量
2.0
40
2.0
80
2.0
2.0
2.0
2.0
0
2.0
120 160 200
各管混匀，置沸水浴25min，冷却，670nm空白管调零，测 各管吸光度
⒉ 计算
标准曲线测得的 × 15/0.5×匀浆总体积/4 × 1/肝重(g) RNA的μ g数
= 1.0g肝组织中含RNA的μ g数
⒋ 纯化RNA
核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙 醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加 1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的 RNA提取液
㈡ 实验操作
新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液， 加0.14mol/LNaCl溶液制成20%匀浆
取匀浆4mL,3500rom离心 15min, 沉淀 上清液,倒入另一离心管,记录体积 加入等体积氯仿-异戊醇混 合液,剧烈震荡10min (用 吸管反复吹打至发白为 止),3500rpm,15min
㈠ 测糖法
核糖
浓HCl,FeCl3
△ 3H2O
糠醛+3,5-二羟甲苯→绿色化合物 （地依酚） 670nm比色
㈡ 实验操作
⒈ 标准曲线的绘制及样品测定
标 1 RNA标准 液 蒸馏水 0.4 1.6 2 0.8 1.2 准 3 1.2 0.8 管 4 1.6 0.4 5 2.0 0 0 2.0 0.5 1.5 空白管 测定管
核酸的提取及含量测定
• 核酸是具有重要生物化学功能的生物大分子， 根据其分子所含糖的种类不同，核酸分为两 大类，含核糖的称为核糖核酸(RNA)，含脱 氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸(DNA)， DNA是遗传信息的携带者，与生物的生长、 繁殖、遗传和变异有密切关系，RNA参与蛋 白质的生物过程，由于核酸具有如此重要的 生物学功能，对核酸的结果与功能的研究已 成为当前生物科学的重要课题之一。
实验十三 动物DNA提取及鉴定
实验十三动物DNA提取及鉴定一、实验目的1．用改变盐浓度和酒精的方法提取DNA；2．用二苯胺法鉴定DNA的特性。
二、实验准备（按每小组2人计算）1．仪器（通用）微量进样器（各种型号）、搅拌机2、组织捣碎机2、冰箱1、DNA检测仪1、水浴锅1 2．器械镊子2、玻璃棒2、滴管2、量筒（100ml 2个，250ml 2个，500ml2个，1000ml2个）、烧杯(100ml 1个；50ml 2个；500ml 2个)、试管（20ml 2个）、试管夹2、带盖离心管（50ml,2个）。
3．药品95%酒精（冰冷预置24hr）4瓶蒸馏水5L0.1g/L柠檬酸钠溶液2000ml2mol/LHCl 4000ml；0.015mol/L HCl 2000ml二苯胺试剂（1g二苯胺+2.7ml 浓H2SO4，定溶于100ml冰醋酸中）现配现用。
4．耗材纱布4卷、滤纸4盒5．材料鸡血细胞液（每大组30人一只鸡的新鲜血液）三、实验原理当NaCl的浓度为2mol/L时，它可溶解DNA；当NaCl的浓度为0.14mol/L时，DNA 可从液体中析出。
同时DNA不溶于酒精，而细胞中的某些物质则可溶于酒精。
以此原理，可提纯DNA。
四、实验步骤1．制备鸡血细胞：取0.2g/L柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。
将宰杀活鸡流出的鸡血(约180ml)注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液于柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。
然后，将血液倒入离心管中，用1000rpm离心2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。
实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞。
2．提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液10ml注入到50ml烧杯中，向烧杯中加入蒸馏水20ml，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，使血细胞加速破裂。
然后，用放有单层纱布的漏斗将血细胞过滤至500ml烧杯中取其滤液。
3．溶解细胞核内的DNA将2mol/L的氯化钠溶液20ml加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min，使充分混匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。
动物组织中核酸的提取及其组成成分的鉴定
动物组织中 核酸的提取及其组成
成分的鉴定
添教材
实验目的
学习离心技术，掌握离心机的正确使用 了解本实验设计思路
实验思路
动物肝组织
提取 （匀浆）
分离 （离心）
核酸
核酸沉淀物
水解核酸
Байду номын сангаас分别鉴定
糖、磷酸、碱基
【鉴定的原理】
核糖 浓酸
糖醛 + 3，5二羟甲苯（地衣酚）
沉淀物中再加入 10%NaCl溶液4ml搅匀
再置于沸水浴中加热5分钟，用玻棒不断搅拌
取出冷却后再离心
（3000转/分，3分钟）
将上清液倒入小烧杯内
取4ml 95%乙醇，逐滴加入小烧杯
白色沉淀物，静置5分钟，转入离心管
再离心（3000转/分，3分钟）
倾去上清液，即得到核酸纳的白色沉淀 3.核酸水解
含有核酸离心管
3H2O
绿色复合物
磷酸 + 钼酸铵
磷钼酸 还原
钼兰（兰色）
氨基萘酚磺酸
浓酸 脱氧核糖
ω-羟基γ-酮基戊醛 + 二苯胺
3H2O
兰色化合物
【操作】
1.制备匀浆 猪肝 + 沙 + 研磨匀浆 + 生理盐水
2.分离抽提 肝匀浆倒入刻度离心管
立即加入2%三氯醋酸4ml搅匀
静置、离心（3000转/分，3分钟）、倾去上清液
加入5%H2SO4溶液4ml
用玻棒搅匀，在沸水中加热5分钟
核酸水解液
4.RNA和DNA成分鉴定
1）磷酸鉴定：取试管2支，分别标明测定管 与对照管，按讲义操作（观察颜色有何不同）
2）核糖鉴定：取试管2支，分别标明测定 管与对照管，按讲义操作（比较两管颜色）
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在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解
度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1mol/L
的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而
RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核
蛋白分开。
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酚：氯仿：异戊醇抽提
酚：有效的使蛋白质变性，不能完全的抑制 RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA 分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至 pH>7.8，以防止DNA分配到有机相。结晶酚 要在182度下重蒸去除醌类等氧化产物，这些 物质能够引起磷酸二酯键的断裂或促进核酸 交联。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有 时很难分开。
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
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核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。
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实验方法
A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀 释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结 果）
A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA 为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果 样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。
定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核 糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）
定磷法（核酸的磷酸部分）
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二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
氯仿：纯酚的比重为1.07，有机相和水相有 时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以 避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水。 可以用氯仿将水相中的酚去除。
异戊醇：减少泡沫的产生。 可编辑版
8
实验步骤
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2. 核糖和脱氧核糖的显色实验加热条件下：D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚
绿色
D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺 蓝紫色
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DNA：1ml SC溶液溶解DNA，然后转移到 50ml离心管中，用9ml 0.01M NaOH溶液溶解， 4000rpm离心10分钟，上清转移到试管中备 用。各取上述1mlDNA溶液于两个试管中，其 中一个里面加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水 中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加 入2ml二苯胺试剂，60 ℃条件下反应1h，观 察颜色反应。
3.纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA， 得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。
4.沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和 盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用80%乙醇洗涤沉淀，除 去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。
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RNA：将RNA沉淀用2ml蒸馏水溶解， 然后转移至2只试管中，每只1ml。其中 一只试管中加入3ml地衣酚试剂，然后在
沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管 中加入2ml二苯胺试剂，60 ℃条件下反应1h， 观察颜色反应。
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3. 核酸的定量和纯度测定
紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。）
核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
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DNA和RNA的结构
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3
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核酸分离的一般步骤
1.溶解细胞 溶解细胞的方法因样品不同而不同。有的是用十二烷基硫酸 钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）加NaOH，有的是用蛋白酶， 有的用超声波破碎等方法。
2．有机溶剂抽提 利用苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核 酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实际上生物样品中含量最多的 就是蛋白质。
目前开发了许多商品化的核酸分离柱，试剂盒,可简单、快速地分离得到
纯度很高的DNA或RNA，其分离原理有的是利用核酸的分子量差异，
有的是利用所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的
目的。
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6
DNA和RNA分离的基本原理
根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度 的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后 用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出 来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出， 达到分离DNA和RNA的目的。
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
HOCH2 O OH HH
H
H
OH OH
D-核糖
Ribose
HOCH2 O OH HH
H
H
OH H
D-2-脱氧核糖
Deoxyribose
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1. 猪肝DNA和RNA的分离
核酸分离的原则
核酸存在于多种细胞，因此分离方法复 杂而多样。又因各种DNA、RNA的含量差异， 各种分析方法对核酸的纯度及量的要求有差 异，因此在实验前应对所采用的方法有所了 解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在 溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽 提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯 化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。