实验十三动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定

目前开发了许多商品化的核酸分离柱，试剂盒,可简单、快速地分离得到
纯度很高的DNA或RNA，其分离原理有的是利用核酸的分子量差异，
有的是利用所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的
目的。
可编辑版
6wk.baidu.com
DNA和RNA分离的基本原理
根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度 的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后 用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出 来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出， 达到分离DNA和RNA的目的。
可编辑版
5
核酸分离的一般步骤
1.溶解细胞 溶解细胞的方法因样品不同而不同。有的是用十二烷基硫酸 钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）加NaOH，有的是用蛋白酶， 有的用超声波破碎等方法。
2．有机溶剂抽提 利用苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核 酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实际上生物样品中含量最多的 就是蛋白质。
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
可编辑版
1
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。
可编辑版
11
RNA：将RNA沉淀用2ml蒸馏水溶解， 然后转移至2只试管中，每只1ml。其中 一只试管中加入3ml地衣酚试剂，然后在
沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管 中加入2ml二苯胺试剂，60 ℃条件下反应1h， 观察颜色反应。
可编辑版
12
3. 核酸的定量和纯度测定
紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。）
定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核 糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）
定磷法（核酸的磷酸部分）
可编辑版
13
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
HOCH2 O OH HH
H
H
OH OH
D-核糖
Ribose
HOCH2 O OH HH
H
H
OH H
D-2-脱氧核糖
Deoxyribose
可编辑版
4
1. 猪肝DNA和RNA的分离
核酸分离的原则
核酸存在于多种细胞，因此分离方法复 杂而多样。又因各种DNA、RNA的含量差异， 各种分析方法对核酸的纯度及量的要求有差 异，因此在实验前应对所采用的方法有所了 解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在 溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽 提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯 化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。
可编辑版
10
DNA：1ml SC溶液溶解DNA，然后转移到 50ml离心管中，用9ml 0.01M NaOH溶液溶解， 4000rpm离心10分钟，上清转移到试管中备 用。各取上述1mlDNA溶液于两个试管中，其 中一个里面加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水 中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加 入2ml二苯胺试剂，60 ℃条件下反应1h，观 察颜色反应。
可编辑版
14
实验方法
A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀 释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结 果）
A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA 为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果 样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。
3.纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA， 得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。
4.沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和 盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用80%乙醇洗涤沉淀，除 去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。
核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
可编辑版
2
DNA和RNA的结构
可编辑版
3
氯仿：纯酚的比重为1.07，有机相和水相有 时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以 避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水。 可以用氯仿将水相中的酚去除。
异戊醇：减少泡沫的产生。 可编辑版
8
实验步骤
可编辑版
9
2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
加热条件下：
D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚
绿色
D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺 蓝紫色
在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解
度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1mol/L
的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而
RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核
蛋白分开。
可编辑版
7
酚：氯仿：异戊醇抽提
酚：有效的使蛋白质变性，不能完全的抑制 RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA 分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至 pH>7.8，以防止DNA分配到有机相。结晶酚 要在182度下重蒸去除醌类等氧化产物，这些 物质能够引起磷酸二酯键的断裂或促进核酸 交联。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有 时很难分开。