第四次实验-质粒转化
质粒的转化实验报告
一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
质粒转化
质粒DNA的转化操作步骤质粒dna的转化【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。
转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，M-)。
将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。
将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。
本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。
其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。
含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。
【试剂与器材】1.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。
2.LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3.0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。
4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。
5.人Bcl-2重组质粒它是EcoR Ⅰ单酶切的pBluescriptⅡKS(-)载体与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA重组而成的，大小为4 861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体。
实验四 质粒的转化
实验四质粒的转化一、实验目的1、将已连接好的质粒导入感受态细胞，进行克隆增殖，用于后续实验操作。
2、掌握热激法转化感受态细胞。
二、实验原理质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。
可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
热激法：大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
三、实验步骤1、取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化。
2、将质粒1ul加入感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上30分钟。
3、热激：将离心管放入42℃水浴锅中热激1min。
4、冰镇：迅速置于冰上。
5、复苏：每管加入500ul LB（在超净台上操作），放于37℃摇床，45min，使细菌复苏。
6、离心6000r，2min，弃上清，浓缩菌液。
7、涂平板（含卡那），在超净台上无菌操作。
8、倒置于37℃恒温箱培养过夜。
9、观察结果。
四、实验结果可以在平板上看到长出许多菌落，说明转化成功。
因为质粒中含有抗卡那的抗性，所以在含有卡那的平板上可以长出它的菌落，而其他不含卡那抗性的菌（不需要的杂质）则不会生长，所以我们可以挑取单克隆培养，进行质粒抽提。
质粒的转化
质粒的转化引言：质粒的转化是一种常用的分子生物学技术，可以将外源DNA序列导入到细胞中，实现基因的表达和功能研究。
本文将围绕质粒的转化展开讨论，介绍质粒的构建、转化方法及应用领域，以及在实验中可能遇到的问题和解决方案。
一、质粒的构建质粒构建是质粒转化实验的前提和基础。
常用的质粒构建方法包括限制性内切酶切割、连接反应、脱磷酸酶处理和酶联克隆等。
首先，通过限制性内切酶切割将目的DNA序列和质粒DNA切割成互补的末端，然后使用连接酶将两者连接起来。
接下来，通过脱磷酸酶处理去除连接反应中未连接的DNA分子，最后使用酶联克隆方法将连接好的质粒转化到宿主细胞中。
二、质粒转化的方法常用的质粒转化方法有热激转化法、电穿孔法和化学转化法。
热激转化法是将质粒与细胞一起暴露在高温下，利用热激刺激细胞膜的通透性增加，使质粒能够进入细胞。
电穿孔法是利用电场脉冲作用于细胞，使细胞膜发生破裂，并形成微小的孔道，质粒通过孔道进入细胞。
化学转化法则是利用化学试剂破坏细胞膜的完整性，使质粒能够进入细胞。
三、质粒转化的应用领域质粒转化技术在基因工程和生物医学研究中具有广泛的应用。
在基因工程中，质粒转化被广泛应用于基因克隆、基因表达和基因敲除等方面。
通过质粒转化，科研人员可以将外源基因导入到细胞中，实现目的基因的表达和功能研究。
在生物医学研究中，质粒转化技术被用于基因治疗、疫苗研发和疾病模型构建等方面。
通过质粒转化，科研人员可以将治疗性基因导入到患者的细胞中，实现基因治疗的目的。
四、质粒转化中可能遇到的问题及解决方案在质粒转化实验中，常常会遇到质粒回收率低、细胞毒性和质粒稳定性差等问题。
针对这些问题，可以采取一些措施来解决。
例如，对于质粒回收率低的情况，可以优化质粒构建和转化条件，提高质粒的产量和质量。
对于细胞毒性的问题，可以调整转化试剂的浓度和作用时间，降低对细胞的伤害。
对于质粒稳定性差的情况，可以选择具有高拷贝数的质粒或者使用质粒稳定性较好的宿主细胞。
质粒的转化实验报告
质粒的转化实验报告
《质粒的转化实验报告》
摘要：
本实验旨在通过转化实验，将外源质粒引入大肠杆菌细胞内，以实现外源基因
的表达。
实验结果显示，经过热激冷冻法转化的菌落在含有抗生素的琼脂平板
上形成了抗性菌落，证明了外源质粒的成功转化。
通过本实验，验证了质粒转
化的可行性，并为后续基因工程研究提供了重要参考。
引言：
质粒转化是基因工程领域中常用的技术手段，通过将外源质粒引入宿主细胞内，实现外源基因的表达。
本实验中，我们选择了大肠杆菌作为宿主细胞，利用热
激冷冻法进行转化实验，以验证质粒转化的可行性。
材料与方法：
我们使用了含有抗生素的琼脂平板作为筛选平板，将含有外源质粒的大肠杆菌
菌液均匀涂布在琼脂平板上，并进行热激冷冻处理。
随后，将转化后的菌落进
行培养和筛选，最终得到抗性菌落。
结果与讨论：
经过转化实验后，我们成功地在含有抗生素的琼脂平板上培养出了抗性菌落，
证明了外源质粒的成功转化。
这为后续的基因工程研究提供了重要的实验验证，并为基因表达、蛋白质生产等领域的研究奠定了基础。
结论：
通过本实验，我们验证了质粒转化的可行性，并为基因工程研究提供了重要参考。
质粒转化技术的成功应用，将为生物医学研究和生物制药工业的发展提供
有力支持。
希望本实验能够为相关研究提供有益的借鉴和启发，推动基因工程领域的进一步发展。
质粒转化方法
质粒转化方法质粒转化是分子生物学中常用的实验技术，用于将外源DNA导入细胞内，实现基因工程的目的。
质粒转化方法主要包括化学法、电穿孔法、热激冲法和凝胶法等多种技术。
本文将介绍这些方法的原理和操作步骤，希望能帮助读者更好地理解和应用质粒转化技术。
化学法是最常用的质粒转化方法之一。
其原理是利用化学试剂改变细胞膜的通透性，使得质粒能够进入细胞内。
常用的化学试剂包括钙离子和聚乙二醇等。
操作步骤主要包括将质粒和化学试剂混合后滴加到细胞中，然后通过热激冲或冷冻复苏等方法促使质粒进入细胞。
电穿孔法是利用电场对细胞膜进行瞬间通透化，使得质粒能够进入细胞内。
操作步骤包括将质粒与细胞混合后置于电穿孔仪器中，通过设定合适的电场参数使质粒进入细胞。
这种方法操作简单，转化效率较高，常用于真核细胞的转化。
热激冲法是将质粒与细胞混合后，通过热激冲使细胞膜发生短暂的通透性改变，促使质粒进入细胞内。
这种方法操作简便，适用于多种细胞类型，但转化效率较低。
凝胶法是将质粒与细胞混合后，利用聚丙烯酰胺凝胶的孔隙结构，通过电泳或离心等方法将质粒转化到细胞内。
这种方法操作简单，适用于大规模的转化实验。
除了上述方法外，还有一些新兴的质粒转化技术，如纳米颗粒介导的转化、超声波介导的转化等，这些方法在特定情况下能够提高转化效率，但操作复杂度较高。
在进行质粒转化实验时，需要根据实验的具体要求选择合适的转化方法。
在操作过程中，需要注意消毒、无菌操作，以及对细胞的处理和培养条件等因素的控制，以确保实验的准确性和可重复性。
总之，质粒转化是基因工程领域中不可或缺的技术手段，掌握不同的转化方法并根据实验要求进行选择，能够更好地进行基因克隆、表达调控等研究工作。
希望本文所介绍的质粒转化方法能够对读者有所帮助，促进基因工程技术的发展与应用。
质粒dna的转化实验报告
质粒dna的转化实验报告质粒DNA的转化实验报告引言：质粒DNA转化是分子生物学中常用的实验技术之一，通过将外源DNA导入到细胞内，实现基因的转移和表达。
本实验旨在探究质粒DNA转化的原理、方法以及影响转化效率的因素。
一、实验原理质粒DNA转化是利用细菌细胞膜的渗透性，将外源DNA导入到细胞内。
质粒DNA通常带有抗生素抗性基因，通过筛选培养基中的抗生素对转化细胞进行筛选，从而获得转化成功的细胞。
二、实验材料与方法1. 实验材料：- 大肠杆菌DH5α细胞- 质粒DNA- LB培养基- 抗生素（如氨苄青霉素）2. 实验方法：a) 质粒DNA制备：将目标基因克隆到质粒载体中，通过大肠杆菌的培养和质粒提取技术，获得纯化的质粒DNA。
b) 细胞预处理：取适量的大肠杆菌DH5α细胞，进行预处理，使其处于最佳转化状态。
c) 转化实验：将质粒DNA与细胞混合，并通过热冲击法或电穿孔法使DNA转移到细胞内。
d) 恢复培养：将转化后的细胞在预热的LB培养基中恢复培养，使其恢复生长。
e) 筛选转化细胞：将恢复培养的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出抗生素抗性的细胞。
三、实验结果与讨论1. 转化效率的影响因素：转化效率受到多种因素的影响，如DNA浓度、细胞状态、转化方法等。
在本实验中，我们通过改变转化体系中DNA和细胞的比例、转化时间等条件，探究了这些因素对转化效率的影响。
结果显示，较高的DNA浓度和适宜的细胞状态有利于提高转化效率。
此外，热冲击法和电穿孔法在不同实验条件下的转化效率也存在差异，需要根据具体实验要求选择合适的转化方法。
2. 质粒DNA的筛选：通过在含有抗生素的LB平板上筛选转化细胞，可以筛选出含有目标基因的细胞。
在本实验中，我们使用了氨苄青霉素作为抗生素，通过对转化后细胞的培养和筛选，成功获得了抗生素抗性的细胞克隆。
3. 转化效率与实验条件的关系：我们分别以不同的DNA浓度、细胞状态和转化时间进行了转化实验，并计算了转化效率。
实验4、质粒DNA的转化
5．整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化 率将会降低。
七、思 考 题
1、制备感受态细胞的关键是什么？ 2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很
3．试剂的质量 化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是
最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、 DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。
4．防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离
6. 涂布细则如下表：
组别
培养皿编号
1 1-1-对照-无
1-1-对照-Amp+Kan
1-1-转化-Amp+Kan
2 1-2-对照-无
1-2-对照-Amp+Kan
1-2-转化-Amp+Kan
3 1-3-对照-无
1-3-对照-Amp+Kan
1-3-转化-Amp+Kan
4 1-4-对照-无
1-4-对照-Amp+Kan
平板抗性 无
Amp+Kan Amp+Kan
无 Amp+Kan Amp+Kan
无 Amp+Kan Amp+Kan
无 Amp+Kan Amp+Kan
受体菌/μl 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
涂布棒的使用
质粒转化步骤
质粒转化步骤质粒转化是分子生物学中常用的实验技术，它可以将外源DNA导入到细胞内，使得细胞表现出新的性状或功能。
本文将详细介绍质粒转化的步骤。
一、准备工作1.选择质粒：根据实验需要选择合适的质粒，例如pUC19、pBR322等。
2.选择菌种：一般常用大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主菌，也可根据需要选择其他菌种。
3.培养基：选择适当的培养基，如Luria-Bertani（LB）培养基。
4.抗生素：添加适当浓度的抗生素以筛选含有目标质粒的菌落。
5.电击仪：用于电击转化法。
二、制备化学试剂和培养基1.制备CaCl2（50 mM）溶液：称取1.47 g CaCl2·2H2O加入100 ml去离子水中，并在室温下搅拌至完全溶解。
2.制备冷冻保护剂：称取20%（w/v）蔗糖溶液和10%（w/v）DMSO溶液各10 ml混合均匀即可。
3.制备SOC培养基：称取2%（w/v）蔗糖、0.5%（w/v）酵母提取物、0.5%（w/v）NaCl、0.2%（w/v）MgSO4·7H2O和10 mM Tris-HCl调pH至7.0，加入适量的去离子水至100 ml。
三、质粒转化步骤1.制备化学竞争剂：将目标质粒溶解在去离子水中，浓度一般为1-10 ng/μl。
将DNA溶液加入CaCl2溶液中，混合均匀后在冰上静置30分钟。
2.处理细胞：将菌种预培养至指定的生长期，一般为对数生长期。
用LB培养基洗涤细胞3次，使得细胞表面的抗原物质减少。
3.转化操作：（1）热激法：将含有目标质粒的CaCl2/DNA溶液滴加到处理后的细胞上，在42℃恒温水浴中短暂热激15-60秒，然后立即放到冰上静置5分钟左右。
（2）电击法：将处理后的菌落均匀铺在富含营养的琼脂平板上，用LB培养基预培养。
将细胞转移到电击仪的电极板上，加入含有目标质粒的CaCl2/DNA溶液，设置适当的电压和时间进行电击。
4.恢复细胞：将转化后的菌落挑选到含有抗生素的LB平板上进行筛选。
质粒的转化
实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-, M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2 、RbCl 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞( Compenent cells )。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子( Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
实验材料和试剂实验材料：已制备好的E. coli DH5α感受态细胞。
实验试剂：含Amp的LB固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入A mp储存液，使终浓度为50μg/mL，摇匀后铺板；Amp母液。
实验仪器-70℃冰箱实验步骤从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μL），轻轻摇匀，冰上放置3 0min。
42℃水浴中热击90s 或37℃水浴5min，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。
向管中加入1mL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。
将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。
对照对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
实验四细菌质粒的接合转移
在选择性培养基上，统计接合子的数 量。通过比较供体菌和受体菌的接合 子数量，可以计算出接合转移的效率 。
质粒转移频率计算
质粒转移频率是指每个供体菌细胞所 能产生的接合子的数量。通过比较供 体菌和接合子的数量，可以计算出质 粒转移的频率。
影响因素分析
供体菌和受体菌的浓度
培养基成分
接合时间
实验结果的可靠性分析
在实验过程中，可能存在一些误差和不确定性因素，如操作误差、仪器误差等。因此， 需要对实验结果进行可靠性分析，以评估实验结果的准确性和可信度。
05
实验注意事项与技巧
实验安全规范
01
02
03
实验室防护
实验人员需穿戴实验服、 手套、口罩等防护用品， 确保实验室环境干净、整 洁。
废弃物处理
在本实验中，通常选择含有某种特定质粒的细菌作为供体菌，而选择不含该质粒的细菌作 为受体菌。通过接合转移，观察受体菌是否获得供体菌的质粒并表达相应的性状。
02
实验材料
菌株与质粒
供体菌
质粒
含有待转移质粒的大肠杆菌菌株，如 DH5α或JM109等。
待转移的质粒，应包含所需的基因和 选择性标记，如抗生素抗性基因。
接合混合物的制备
将供体菌、受体菌及连接产物混合， 加入适量的接合剂，形成接合混合物 。
接合反应
将接合混合物涂布于选择性培养基上 ，倒置培养过夜，使供体菌与受体菌 发生接合反应。
接合子的筛选与鉴定
挑取选择性培养基上的接合子进行扩 大培养，并提取质粒进行酶切分析和 测序鉴定。
04
实验结果与分析
接合转移效率的计算
在无菌条件下进行接合转移操作，避免污染。同时， 控制接合时间和温度等条件，以提高接合效率。
质粒转化的方案
质粒转化的方案引言质粒转化是基因工程领域中重要的实验操作之一，其通过将外源DNA片段导入到宿主细胞中，实现基因的转移和表达。
本文将介绍常用的质粒转化的方案和操作步骤。
实验材料和试剂1.质粒：包含所需目标基因的质粒DNA。
2.宿主细胞：常用的宿主细胞包括大肠杆菌（Escherichia coli）和酵母菌等。
3.培养基：常用的培养基包括LB培养基、YPD培养基等。
4.抗生素：如氨苄青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）等，用于筛选转化成功的细胞。
质粒转化的方案和操作步骤1.培养宿主细胞：首先，将宿主细胞在适当的培养基中进行预培养。
预培养条件根据具体宿主细胞的要求确定，通常在摇床上以适当的温度和转速下培养数小时至过夜，直至细胞密度达到一定程度。
2.质粒提取：根据质粒的来源和特性，选择适当的质粒提取方法，如酚/氯仿法、牛奶法等，提取纯度较高的质粒DNA。
3.质粒线性化：某些情况下，需要将质粒进行线性化处理，以利于后续的转化操作。
线性化方法包括酶切、PCR引物设计等。
4.转化操作步骤：–准备转化溶液：将适当体积的质粒DNA、宿主细胞和转化缓冲液等混合，制备转化溶液。
–加入质粒：将质粒DNA加入转化溶液中，使其与宿主细胞充分接触。
–瞬间热冲击法（Heat shock method）：将转化溶液置于冰上静置一段时间，然后迅速在42°C水浴中热冲击数秒钟，最后再将其置于冰上冷却。
–恢复培养：将转化溶液转移至含有适当抗生素的培养基中，恢复培养。
培养条件根据宿主细胞的具体要求确定。
5.筛选转化细胞：在含有适当抗生素的培养基上培养转化细胞，筛选出抗生素耐受的细胞落。
6.鉴定转化是否成功：–酶切鉴定：将转化菌株提取的质粒进行酶切，利用酶切产生的DNA片段大小进行鉴定。
–PCR检测：利用特异引物进行PCR扩增，检测所需目标基因的存在与否。
–DNA测序：进行基因测序，验证质粒是否正确构建。
质粒dna的转化实验报告
质粒dna的转化实验报告实验名称：质粒DNA的转化实验报告实验目的：掌握质粒DNA转化方法，了解DNA转化的原理和应用以及转化效率的影响因素。
实验原理：DNA转化是指将外源DNA在到宿主细胞内的过程。
质粒DNA转化是一种重要的DNA转化方法，一般通过电穿孔、热潮、冷冻和化学法等实现。
在实验过程中，需注意DNA的质量与数量、介质的温度与相应化学物质的加入量等多个参数对转化效率的影响，以求获得理想的实验结果。
实验材料：- Luria broth (LB)培养基- 目的菌株- 质粒 DNA- 钙氯化物缓冲液- 冰浴器- 恒温培养箱- 垫片（culture plate）- 恒温振荡器- 恒温水浴实验步骤：1.准备培养基和菌种2.将质粒DNA制备出来3.将宿主细胞进行恒温准备4.充分摇晃细胞5.将DNA溶液与化学物质混合6.将化学物质滴入细胞7.将转化细胞浸入冷水实验结果：在本次实验中，我们进行了多组基因转化实验，通过对不同参数的变化进行观察，发现质量好的DNA转化效果更好。
合理使用化学物质，正确选择菌株，可以有效地提高转化效率。
同时，熟练的操作技巧和正确的冷热温度控制也是影响转化效果的关键因素。
实验结论：本次实验，我们掌握了质粒DNA转化的方法，认识到了影响实验结果的多种因素。
在今后的实验研究中，需要注意各参数之间的相互作用，选择合适的方法并控制好各项参数，才能获得优秀的实验结果。
实验建议：为了获得高品质可重复的分子生物学实验结果，本实验重点在质控上做好了一些工作，此外，还应该注意诸如保存DNA（使用端切酶切割和凝胶电泳检测）、使用高保真聚合酶进行PCR扩增等其他方面也需要注意。
为了保证实验结果的可靠性和稳定性，建议进行更多的重复实验，以了解实验效果，并能更准确地测量和分析实验结果。
实验四 质粒pUC19转化大肠杆菌E. coli DH5a
实验四质粒pUC19转化大肠杆菌E. coli DH5a 内容提要采用质粒pUC19对实验三制备得到的大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞进行转化，并利用抗生素来筛选转化子。
本实验要求：1、掌握质粒转化实验操作技术。
2、能够计算感受态细胞的转化效率。
原理本实验以E. coli DH5a菌株为受体细胞，采用CaCl2法制备感受态细胞，并将pUC19 质粒转化至感受态细胞。
进入受体细胞的质粒通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R¯，M¯)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r)，可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC19，则在含氨苄青霉素的培养基上不能生长。
能在氨苄青霉素培养基上生长的受体细胞（转化子）说明已导入了pUC19。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切、测序等进一步鉴定。
一、主要仪器、材料和试剂1. 仪器移液器，水浴锅，台式离心机，摇床。
2. 实验材料大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞，1ml枪头，10ml离心管。
3. 试剂（1）100mg/ml 氨苄青霉素（ampicillin）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
（2）LB液体培养基：蛋白胨（Tryptone）10g酵母提取物（Yeast extract）5 gNaCl 10g溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水定容至1升，高温高压灭菌20分钟。
（3）LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高温高压灭菌。
二、操作步骤1) 在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态就可以直接使用了)，如果检测感受态细菌的效率，加入100pg～10ng质粒，但质粒的体积不宜超过感受态细菌量的10%。
重组质粒的转化实验报告
重组质粒的转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在构建重组质粒，以提高转录和表达的效率。
二、实验原理
重组质粒技术是一种细胞分子遗传学技术，它可以将一种特定的DNA片段插入另一种特定的质粒中，以改变质粒的表达模式。
它的基本原理是利用酶切，将特定的DNA片段插入质粒中，然后将其复制到另一个质粒中，从而改变质粒的表达模式。
三、实验步骤
1. 提取质粒：首先，使用适当的抗性菌株（如E.coli）提取质
粒DNA，使用特定的质粒提取试剂提取质粒DNA；
2. 克隆DNA片段：使用PCR技术，将要插入质粒中的DNA
片段克隆到另一个质粒中；
3. 制备重组质粒：将克隆的DNA片段插入质粒中，使用特定
的酶切试剂，完成重组质粒的制备；
4. 测序：使用测序仪，测试重组质粒的序列，以确保重组质粒的正确性。
四、实验结果
1. 质粒提取：成功提取质粒，提取的质粒DNA纯度达到99%以上；
2. 克隆DNA片段：成功克隆目标DNA片段，PCR扩增结果与理想结果一致；
3. 重组质粒制备：重组质粒制备成功，酶切结果与理想结果一致；
4. 测序：重组质粒的序列与理想序列一致，证明重组质粒制备成功。
五、结论
本次实验成功地构建了重组质粒，从。
实验四、转化实验 (1)
三、实验原理
转化是细菌重要的遗传重组方式， 转化是细菌重要的遗传重组方式，也是 基因工程的重要技术手段。 基因工程的重要技术手段。
大肠杆菌的感受态一般是通过用CaCl2在0℃条件 大肠杆菌的感受态一般是通过用 ℃ 下处理细胞而形成。细胞处于0℃ 下处理细胞而形成。细胞处于 ℃的CaCl2低渗溶 液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变。 液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变。 转化混合物中的质粒DNA形成抗 形成抗DNase的羟基 钙 的羟基-钙 转化混合物中的质粒 形成抗 的羟基 磷酸复合粘附于细胞表面， 磷酸复合粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处 ℃ 促进细胞吸收DNA复合物。在LB培养基上培 复合物。 理，促进细胞吸收 复合物 培养基上培 养数小时后，球形细胞复原并增殖， 养数小时后，球形细胞复原并增殖，在选择培养 基上便可获得所需的转化子。 基上便可获得所需的转化子。
转化得到转化子的数量 每µgDNA转化得到转化子的数量 转化
四、实验步骤 实验步骤
菌种活化：一环菌接种LB液体培养基，37℃， 菌种活化：一环菌接种LB液体培养基，37℃，150 r/min LB液体培养基 振荡培养过夜； 振荡培养过夜； 翻接：接种量5%，37℃ 200rpm培养约 培养约70min； 2. 翻接：接种量 ， ℃ 培养约 ； 控制OD600=0.2~0.25；将培养液放入冰浴冷却 min 控制 ；将培养液放入冰浴冷却10min 感受态细胞的制备 培养液于于EP管中 1. 取1.5ml培养液于于 管中，10000 r/min，离心 秒， 培养液于于 管中， ，离心30秒 弃上清液；（倒置1 ；（倒置 弃上清液；（倒置1min) 2. 冰冷100mmol/L CaCl2溶液，用混匀器混匀或用 溶液， 加0.75ml冰冷 冰冷 手指弹离心管混匀； 手指弹离心管混匀； 3. 将EP管置于冰浴45min； 管置于冰浴 ； 管置于冰浴 4. 6500 r/min，5min离心收集细胞（弃上清），并小心悬 离心收集细胞（ ），并小心悬 ， 离心收集细胞 弃上清）， 浮于0.1ml冷CaCl2溶液中（在冰浴中预冷），用移液器 浮于 冷 溶液中（在冰浴中预冷），用移液器 ）， 小心混匀； 小心混匀
质粒转化实验报告
质粒DNA的转化实验报告一、实验原理：转化即将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程。
当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最容易发生。
用CaCl2处理受体菌, 使之成为感受态细胞, 即具备接受外源DNA的能力。
Ca2+的作用主要是破坏细胞膜上的脂质阵列, 并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入, 42 ℃热休克能促使细胞吸收外源DNA。
将处理后的细菌放入含有Amp的培养基中培养，转化菌能够在含有Amp的培养基中存活并形成菌落，未转化菌不能在含有Amp的培养基中生长。
二、操作步骤：1、取1个无菌1.5 ml EP管(标记)，加入30μl感受态细胞立即置于冰上；2、加入5μl Bcl-2重组质粒，轻轻混匀，冰浴15 min；3、42 ℃水浴中热击90 s，热击后立即冰浴2 min；4、向管中加入200 μl不含Amp的LB液体培养基，混匀后37 ℃ 100转/min振摇15min (摇床)5、取100 μl菌液滴加至含Amp的LB固体培养基(平板)，涂布均匀，放置晾干(标记)后，37 ℃倒置培养12~16 h (培养箱)三、注意事项：1、注意保持无菌操作；2、感受态DH5α细菌很脆弱，加入Bcl-2重组质粒5μl后，要轻轻旋转混合，禁止剧烈振摇；3、42℃热激90秒时，时间和温度要准确，中途不能摇动离心管。
四、实验结果:1、结果图片如下：左侧为阴性对照组（Amp+水），右侧为实验组（Amp+质粒）。
2、结果分析：由上图可知，实验板转化后的受体菌由于导入了目的基因获得了Amp抗性，在含有Amp的培养基中长了大量菌落，对照组细菌细胞由于没有导入目的基因，从而没有Amp抗性，故没有长出菌落。
实验组与对照组可知，只有转入质粒的受体菌能够在含有Amp的培养基中生长。
五、实验讨论：1、如果对照板出现菌落，可能原因：（1）对照板中忘记加入Amp或者浓度不够；（2）空气中有含有Amp抗性的细菌污染了对照板；（3）操作过程中，不小心将转化后的细菌带入了转化板。
质粒转化_精品文档
质粒转化质粒转化是分子生物学实验中常用的一种技术手段，用于将外源DNA片段转入宿主细胞中。
质粒转化的意义重大，它为基因工程研究提供了必不可少的工具，也为生命科学领域的研究提供了重要的实验手段。
本文将从质粒转化的基本原理、操作步骤、影响因素以及应用领域等方面进行阐述。
首先，我们来介绍一下质粒转化的基本原理。
质粒转化主要是通过物理或化学方法改变细胞的膜通透性，使其能够接受外源DNA片段。
最常见的方法是利用热冲击、电穿孔或钙离子共转化等方式，将质粒DNA转入细胞中。
在细胞内，外源DNA被接受后，可通过细胞的自我修复机制与宿主染色体进行重组，从而实现对外源基因的表达。
接下来，我们将详细介绍质粒转化的操作步骤。
首先，需要准备质粒DNA和宿主细胞。
质粒DNA通常通过大肠杆菌的培养和提取获得，而宿主细胞则选择易于转化的感受态细胞。
然后，将质粒DNA 和宿主细胞混合，并经过特定的操作步骤进行转化。
具体步骤包括：转化混合物的制备、细胞处理、转化和复苏等。
最后，通过对转化后的细胞进行筛选，得到含有目标基因的转化克隆。
在质粒转化的过程中，有许多因素会影响转化效率。
首先是质粒DNA的纯度和浓度。
高纯度的质粒DNA更易于转化并被细胞所接受。
其次是细胞状态和生长条件。
细胞在感受态时转化效率较高，而细胞的生长状态也会影响转化效率。
此外，转化的温度、时间以及转化混合物的成分也会对转化效率产生影响。
因此，在进行质粒转化实验时，需要进行一系列的优化操作，以提高转化效率。
质粒转化在生命科学领域有广泛的应用。
首先，它在基因工程研究中被广泛运用。
通过将外源基因转入宿主细胞，可以实现对目标基因的表达和功能研究。
其次，质粒转化也为基因治疗提供了技术支持。
通过将修复基因或治疗基因转入患者的细胞中，可以实现对遗传性疾病的基因治疗。
此外，质粒转化还被应用于转基因植物研究、疫苗开发、酶工程以及生物生产等领域。
尽管质粒转化在基因工程研究中起到了重要作用，但仍存在一些挑战和限制。
第四次实验-质粒转化27页PPT
转化子的筛选
1. 直接选择法：
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交
Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
促进组氨酸合成
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
– 酶-受体假说：细胞壁是完整的，但在壁上 产生了一些酶的位点，可以把外来DNA转 入胞内。
感受态细菌的制备
3. 外来DNA进入细菌内部的过程
具体过程：a.吸附：dsDNA吸附在细菌表面； b.转入：一条ssDNA进入细胞并被蛋白质保 护起来，另一条降解；c.自稳： ssDNAdsDNA；d.复制表达
*在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将 dsDNA吸附到胞壁上；在革兰式阳性菌中， 因没有分离到感受态因子，DNA以双链进入。
4. 受体菌的改造与选择：
载体的选择标准:
能自主复制； 具有两个以上的遗传标记基因，
便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），
常具有多个单一酶切位点，称为 多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源 DNA。
4. 受体菌的改造与选择：
限制与修饰系统：R-,M-或R-,M+的突变体，（R： restriction; M: modification）
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受体菌的改造与选择： 4. 受体菌的改造与选择：
载体的选择标准: 载体的选择标准
能自主复制； 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记基因， 具有两个以上的遗传标记基因， 便于重组体的筛选和鉴定； 便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源 插入点）， 有克隆位点（外源DNA插入点）， 插入点 常具有多个单一酶切位点， 常具有多个单一酶切位点，称为 多克隆位点； 多克隆位点； 分子量小， 分子量小，以容纳较大的外源 DNA。 。
2.感受态形成假说： 2.感受态形成假说： 感受态形成假说
– 局部原生质体假说：局部的细胞壁被破坏。 局部原生质体假说：局部的细胞壁被破坏。
– 酶-受体假说：细胞壁是完整的，但在壁上 受体假说：细胞壁是完整的，
产生了一些酶的位点，可以把外来DNA转入 产生了一些酶的位点，可以把外来DNA转入 DNA 胞内。 胞内。
试剂用途： 试剂用途：
1.10xSSC：DNA结合与硝酸纤维素滤膜的作用取决于转 ： 结合与硝酸纤维素滤膜的作用取决于转 移缓冲液的离子强度。 片段越小， 移缓冲液的离子强度。DNA片段越小，使其有效的保 片段越小 留在硝酸纤维素滤膜上所需要的离子强度越高。 留在硝酸纤维素滤膜上所需要的离子强度越高。当 DNA<500bp时需要 时需要20xSSC。 时需要 。 2．预杂交液：封闭探针在滤膜表面上的非特异性结合， ．预杂交液：封闭探针在滤膜表面上的非特异性结合， 包括Denhardt试剂、肝素及脱脂奶粉，往往与经变性 试剂、 包括 试剂 肝素及脱脂奶粉， 并经断裂成片段的鮭精DNA或酵母 或酵母DNA以及 以及SDS一类 并经断裂成片段的鮭精 或酵母 以及 一类 去污剂一起使用。可使背景杂交得到完全抑制。 去污剂一起使用。可使背景杂交得到完全抑制。
常用CaCl2制备感受态细菌 常用
细菌在低渗的CaCl2溶液中逐渐膨胀成球形， 溶液中逐渐膨胀成球形， 细菌在低渗的 DNA与Ca2+形成羟基 钙-磷酸复合物，被吸 与 形成羟基-钙 磷酸复合物 磷酸复合物， 附在细菌表面，细菌经短暂热休克 短暂热休克刺激被 附在细菌表面，细菌经短暂热休克刺激被 细菌摄取。 细菌摄取。
基因工程技术 (Genetic engineering)
第四次实验 感受态细菌的制备及转化实验
基本原理
1. 然界的转化： 然界的转化：
将重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。 将重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。 DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染 细菌细胞能摄取外来DNA的生理状态称为感受态。 细菌细胞能摄取外来DNA的生理状态称为感受态。 DNA的生理状态称为感受态
受体菌的改造与选择： 4. 受体菌的改造与选择：
限制与修饰系统： 的突变体，（ ，（R 限制与修饰系统：R-,M-或R-,M+的突变体，（R： modification） restriction; M: modification） 重组系统：选用rec+的转化（提高转化效率），再 重组系统：选用rec+的转化（提高转化效率），再 rec+的转化 ）， 转到rec 受体菌中保存（防止整合到染色体DNA recDNA基 转到rec-受体菌中保存（防止整合到染色体DNA基 因组中去）。 因组中去）。 有明显的选择性差异：例如，载体Amp 有明显的选择性差异：例如，载体Ampr, 目的基因 应选择Amp 的受体菌。 Strr，应选择Amps /Strs的受体菌。 空菌 选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌： 选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：肺 炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。 炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。
预期结果及结果分析
1 3 4
阴性对照 阳性对照 实验组 阴性对照 阳性对照 实验组
2
1.正常结果：空白对照不长菌，阳性对照和重组组长菌。 正常结果：空白对照不长菌，阳性对照和重组组长菌。 正常结果 2.所有的皿都不长菌：转化系统有问题。 所有的皿都不长菌：转化系统有问题。 所有的皿都不长菌 3.都长菌：试剂或操作过程中被污染。 都长菌：试剂或操作过程中被污染。 都长菌 4.连接不成功。 连接不成功。 连接不成功
感受态细菌的制备
外来DNA DNA进入细菌内部的过程 3. 外来DNA进入细菌内部的过程
具体过程： 吸附 吸附： 吸附在细菌表面； 具体过程：a.吸附：dsDNA吸附在细菌表面； 吸附在细菌表面 b.转入：一条 转入： 转入 一条ssDNA进入细胞并被蛋白质保 进入细胞并被蛋白质保 护起来，另一条降解； 自稳 自稳： 护起来，另一条降解；c.自稳： ssDNA→dsDNA；d.复制表达 → ； 复制表达 *在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将 在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子， 在革兰氏阴性菌中 dsDNA吸附到胞壁上；在革兰式阳性菌中， 吸附到胞壁上； 吸附到胞壁上 在革兰式阳性菌中， 因没有分离到感受态因子，DNA以双链进入。 因没有分离到感受态因子， 以双链进入。 以双链进入
6. 制备感受态菌时期选择： 制备感受态菌时期选择：
细菌生长时相 转化最佳时期应选择在 对数生长期的后期。 对数生长期的后期。 OD550nm=0.2-0.3 =0.2细胞/ml /ml） （5-6×108细胞/ml）
操作步骤
（见讲义） 见讲义） 注意事项： 注意事项： 1.冰浴操作，增加感受态量及延长感受态 冰浴操作， 冰浴操作 时间。 时间。 2.无菌操作，防止杂菌污染。 无菌操作，防止杂菌污染。 无菌操作 3.试剂要求纯度高 试剂要求纯度高 4.重组时的高盐，在转化时要稀释 重组时的高盐， 重组时的高盐 5.涂皿时不要来回涂布 涂皿时不要来回涂布
②
①
③
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
实验步骤包括: 实验步骤包括
提取细胞内的染色体DNA，酶切电泳。 提取细胞内的染色体DNA，酶切电泳。 DNA 凝胶上的DNA碱变性处理:双链变成单链. 凝胶上的DNA碱变性处理:双链变成单链. DNA碱变性处理 Southern转移：毛细管转移( Southern转移：毛细管转移(转移的速率取决于 转移 DNA片断的大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移 片断的大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移； DNA片断的大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移； 真空转移。 真空转移。 制备探针：DNA的切口平移（利用DNA聚合酶具有 制备探针：DNA的切口平移（利用DNA聚合酶具有 的切口平移 DNA 聚合活性和5 外切酶活性进行标记）； 3’→5’聚合活性和5’→3’外切酶活性进行标记）； → 聚合活性和 → 外切酶活性进行标记 随机引物合成 预杂交， 预杂交，杂交及杂交信号检测
λDNA
促进组氨酸合成
重组体
标 志 补 救
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
α互补
α 互 补 的 检 测
原 位 杂 交
Southern印迹 印迹
鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 鸡的 肌球 的 比 较
Southern 印迹杂交
用来鉴定DNA中某一特定的基因片段。 用来鉴定DNA中某一特定的基因片段。 DNA中某一特定的基因片段 基本原理： 基本原理： 根据两条单链DNA（ DNA与RNA） 根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱 DNA 基序列能专一配对的原理进行。 基序列能专一配对的原理进行。
5.感受态菌制备方法： 5.感受态菌制备方法： 感受态菌制备方法
电击法:将细菌置入一定的容器内， 电击法:将细菌置入一定的容器内，通入高 脉冲电压，使细菌处于感受态， 脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效 率高，可达10 /1ugDNA，但细胞容易死亡， 率高，可达1010/1ugDNA，但细胞容易死亡， 约一半以上的细胞死亡。 约一半以上的细胞死亡。 化学法： 化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化 、还原剂、 六氨合高钴等，成功率可达10 六氨合高钴等，成功率可达 5-8/ug DNA。 。
转化子的筛选 1. 直接选择法： 直接选择法：
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
抗 药 性 标 记 选 择
插 入 失 活 法
( ( ( (
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因