第五节 病毒病的实验室诊断方法.

第二章病毒

第五节病毒病的实验室诊断方法

畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。

一、病料的采集、保存和运送

病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。

二、包涵体检查

有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3）

表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒

病毒名称感染范围包涵体类型及部位

痘病毒类

狂犬病病毒

伪狂犬病病毒

副流感病毒III型

马鼻肺炎病毒

鸡新城疫病毒

传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等

狼、马、牛、猪、人、猫、羊、

禽等

犬、猫、猪、牛、羊等

牛、马、人

马属动物

鸡

鸡

嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中

嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节

层的细胞中

嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中

嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡

上皮细胞及肺的间隔细胞中

嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间

隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等

嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中

嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中

三、病毒的分离培养

将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理三种。如用口蹄疫的水疱皮病料进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH7.6磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1000IU，链霉素1000μg，置2～4℃冰箱内4～6h，然后用8000～10000r/min速度离心沉淀30min，

吸取上清液备用。

被接种的动物、禽胚或细胞出现死亡或病变时（但有的病毒须盲目传代后才能检出），可应用血清学试验及相关的技术进一步鉴定病毒。

四、动物接种试验

病毒病的诊断也可应用动物接种试验来进行。取病料或分离到的病毒处理后接种实验动物，通过观察记录动物的发病时间、临床症状及病变甚至死亡的情况，也可借助一些实验室的方法来判断病毒的存在。此方法尤其在病毒毒力测定上应用广泛。

五、病毒的血清学试验

血清学试验在病毒性传染病的诊断中占有重要地位。常用的方法有：中和试验、补体结合试验、红细胞凝集和凝集抑制试验、免疫扩散试验、免疫标记技术等。血清学试验的详细内容及操作见第十一章和动物微生物检验技术实训十三～十七。

六、分子生物学方法鉴定病毒

分子生物学诊断又称基因诊断。主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定。其特点是反应的灵敏度高，特异性强，检出率高。是目前最先进的诊断技术。主要方法有核酸探针、PCR技术和DNA芯片技术。

（一）PCR诊断技术PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。是80年代中期发展起来的一项极有应用价值的技术。PCR技术就是根据已知病原微生物特异性核酸序列（目前可以在因特网Gen ebank 中检索到大部分病原微生物的特异性核酸序列），设计合成与其5′端同源，3′端互补的二条引物。在体外反应管中加入待检的病原微生物核酸（称为模板DNA）、引物、dNTP和具有热稳定性的DNA Taq聚合酶，在适当条件下（Mg++离子，pH等），置于PCR仪，经过变性、复性、延伸，三种反应温度为一个循环，进行20～30次循环。如果待检的病原微生物核酸与引物上的碱基匹配，合成的核酸产物就会以2n（n为循环次数）呈递数递增。产物经琼脂糖凝胶电泳，可见到预期大小的DNA条带出现，就可做出确诊。

此技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、重复性好和对原材料要求较低等特点。它尤其适于那些培养时间较长的病原菌的检查，如结核分支杆菌、支原体等。PCR的高度敏感性使该技术在病原体诊断过程中极易出现假阳性，避免污染是提高PCR诊断准确性的关键环节。

常用检测病原体的PCR技术有逆转录PCR（RT-PCR）、免疫-PCR等。

RT-PCR是先将mRNA在逆转录酶的作用下，反转录为cDNA（互补DNA），然后以cDNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物的鉴定，检测mRNA相应的病原体。

免疫-PCR是将一段已知序列的质粒DNA片段连接到特异性的抗体（多为单克隆抗体）上，从而检测未知抗原的一种方法。它是集抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性于一体。该技术的关键是连接已知抗体与DNA

之间的连接分子，此分子具有两个结合位点，一个位点与抗体结合，另一个位点与质粒DNA结合。当抗体与特异性抗原结合，形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，再用PCR扩增仪扩增连接的DNA分子，如存在DNA产物即表明DNA 分子上连接的抗体已经与抗原发生结合，因为抗体是已知的，从而检出被检抗原。

（二）核酸杂交技术核酸杂交技术是利用核酸碱基互补的理论，将标记过的特异性核酸探针同经过处理、固定在滤膜上的DNA进行杂交，以鉴定样品中未知的DNA。由于每一种病原体都有其独特的核苷酸序列，所以应用一种已知的特异性核酸探针，就能准确地鉴定样品中存在的是何种病原体，进而做出疾病诊断。核酸杂交技术敏感、快速、特异性强，特别是结合应用PCR技术之后，对靶核酸检测量已减少到皮克（pg）水平。例如检测牛白血病病毒，只要取1～2个感染细胞或10-5μg的宿主DNA，经PCR扩增后，进行斑点杂交试验，即可得出阳性结果。PCR技术为检测那些生长条件苛刻、培养困难的病原体，为潜伏感染或整合感染动物的检疫提供了极为有用的手段。

（三）核酸分析技术核酸分析技术包括核酸电泳、核酸酶切电泳、寡核苷酸指纹图谱和核苷酸序列分析等技术，它们都已开始用于病原体的鉴定。例如，一些RNA病毒如轮状病毒、流感病毒，由于其核酸具多片段性，故通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其基因组型，便可做出快速诊断。又如，DNA病毒如疱疹病毒等，在限制性内切酶切割后电泳，根据呈现的酶切图谱可鉴定出所检病毒的类型。