第五节 病毒病的实验室诊断方法.
病毒病的常规实验室诊断
胞现象也可被特异性抗血清所抑制，故在病毒鉴定，特别是对
某些不产生细胞病变的病毒，常用红细胞吸附和吸附抑制试验 进行快速鉴定。
2.4 补体结合试验（CFT）
原理：CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补体的特 性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特 异性结合的一类实验。 参与本实验的五种成分分为两个系统 ①待检系统：已知抗原（或抗体）和待检 抗体（或抗原细胞代谢的测定
病毒间的干扰现象
抗原的测定
电子显微镜观察
1.5 病毒感染力的测定—半数细胞培养物感染量 （TCID50)
Reed-Muench
内插法
Karber法
细胞病变孔：50%以上细胞发生病变才可算为细胞病变孔。
病毒种类 狂犬病病毒 接种途径 卵黄囊 ++ 绒毛尿囊膜 ++ 尿囊腔 养膜腔 脑内 +++ 病变 特征 鸡胚死亡 备注
流感病毒
新城疫病毒 痘病毒 蓝舍病病毒 传支 法氏囊 鹅细小
++++
++++ +++ +++ +++ ++ +++++ ++ ++++ ++++
2.9 单扩溶血试验
是在琼脂单扩散基础上发展起来的，又称为被动溶血技术，主要用于流感 病毒血凝素和神经氨酸酶抗体的测定。 吸附在红细胞表面上的抗原与同种抗体结合，再加上补体的作用，就会使 红细胞溶血，由于糠油抗体血清的稀释度与溶血圈直径或面积的大小成直 线关系，所以可对血清抗体进行定量测定。
病毒的检测方法
病毒的检测方法病毒是一种微生物，它可以侵入宿主细胞并利用宿主细胞的生物合成系统复制自己。
病毒的检测是非常重要的，它可以帮助人们及时发现病毒的存在，采取相应的措施来控制和治疗病毒感染。
目前，病毒的检测方法有很多种，包括免疫学方法、分子生物学方法、细胞学方法等。
下面将详细介绍几种常见的病毒检测方法。
首先，免疫学方法是一种常用的病毒检测方法。
这种方法利用人体免疫系统产生的抗体来检测病毒的存在。
常见的免疫学方法包括ELISA法、免疫荧光法和免疫印迹法。
这些方法可以通过检测血清、唾液、尿液等样本来确定病毒感染的情况。
免疫学方法具有操作简单、结果快速的特点，因此被广泛应用于临床诊断和流行病学调查中。
其次，分子生物学方法也是一种常用的病毒检测方法。
这种方法利用PCR、实时荧光定量PCR、核酸杂交等技术来检测病毒的核酸。
分子生物学方法具有高灵敏度和高特异性的特点，可以检测到病毒的极低浓度，因此被广泛应用于病毒性疾病的诊断和研究中。
另外，细胞学方法也是一种常用的病毒检测方法。
这种方法利用细胞培养和显微镜技术来检测病毒的存在。
通过观察细胞的形态和结构变化，可以判断细胞是否受到病毒感染。
细胞学方法具有直接观察病毒感染的优势，可以帮助人们更直观地了解病毒的生物学特性。
总的来说，病毒的检测方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体情况选择合适的检测方法来进行病毒检测。
同时，随着科学技术的不断发展，病毒的检测方法也在不断更新和完善，相信在不久的将来，会有更多更准确、更快速的病毒检测方法出现，为人们的健康保驾护航。
病原体实验室检测方法
病原体实验室检测方法病原体实验室检测方法是指通过特定的实验室技术来检测病原体（包括细菌、病毒、寄生虫等）是否存在以及确定其类型和数量。
这些检测方法在诊断和监测传染病、疫情调查和预防控制等方面起着至关重要的作用。
以下将介绍一些常用的病原体实验室检测方法。
一、细菌检测方法：1.细菌涂片检测法：将样品刮取或脱落涂布到玻璃片上，然后通过染色和显微镜观察细菌的形态、结构和分布情况，从而快速鉴定细菌种类。
2.培养法：将样品在适当的培养基上进行培养，利用细菌的生长特性、形态和抗生素敏感性等进行细菌的鉴定和分类。
3.PCR（聚合酶链反应）法：通过扩增微生物DNA或RNA片段，利用特定引物和酶的作用，可以检测微生物的存在和种类，并且可以从非活体样本中检测到微生物。
4.药敏试验：通过将不同抗生素与细菌进行作用，观察其对生长的影响，从而确定该细菌的药物敏感性。
二、病毒检测方法：1.核酸提取和PCR法：通过提取病毒RNA或DNA，然后用特定的引物扩增并检测病毒核酸，从而确定病毒的存在和种类。
2.组织培养法：将样品接种到合适的细胞培养物上，观察细胞的形态和病变，并通过电镜、PCR等方法检测细胞内的病毒。
3.免疫学检测：通过检测病毒抗原或抗体的存在和滴度来确定病毒感染的情况，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验（IFA）等。
4.电子显微镜法：通过电子显微镜观察样品中的病毒颗粒，从而确定其形态和类型。
三、寄生虫检测方法：1.寄生虫涂片检测法：将样品制作成薄片，在显微镜下观察寄生虫的形态、结构和分布情况，从而确定寄生虫的种类。
2.氏染色法：染色使寄生虫产生独特的颜色特征，借助显微镜观察寄生虫的颜色和形态特征，从而鉴定寄生虫种类。
3.蛋囊检测法：通过提取样品中的蛋囊，观察其形态和特征，从而确定寄生虫的存在。
4.免疫学检测：通过检测寄生虫抗原或抗体的存在和滴度来确定寄生虫感染的情况，包括ELISA、IFA等方法。
四、其他病原体检测方法：1.快速诊断试剂：通过特定的化学试剂和技术，可以快速检测病原体的存在和种类，如快速血液测试、尿液测试和呼气测试等。
传染病学 第二章 病毒性传染病 第五节 水痘和带状疱疹
六、临床表现
（三）特殊型水痘 1.出血型水痘：病情极严重。此型全身症状重，皮肤、黏膜有淤点、淤斑
和内脏出血 2.坏疽型水痘：皮肤大片坏死，可因脓毒症而死亡
水痘躯干部皮疹，病程1～2天
➢ 皮疹的病理改变：水疱疱液开始时透明，当上皮细胞脱落加之炎性细胞 浸润，使疱内液体变浊并减少，最后下层的上皮细胞再生，形成结痂， 结痂脱落后一般不留痕迹
六、临床表现
（一）潜伏期：10～21天，以14～16天为多见 （二）典型水痘：临床分为两期 1.前驱期：婴幼儿常无症状或症状轻微，可有低热、烦躁易激惹或拒乳 2.出疹期：皮疹首先见于躯干部，以后延及面部及四肢，为向心性分布，
传染病学
第二章
病毒性传染病
第五节
水痘
一、 概述
水痘是由水痘-带状疱疹病毒初次感染引起的急性传染病。传染率很高。主 要发生在婴幼儿，以发热及成批出现周身性红色斑丘疹、疱疹、痂疹为特征 。冬春两季多发，其传染力强，接触或飞沫均可传染。易感儿发病率可达 95%以上，学龄前儿童多见。临床以皮肤粘膜分批出现斑丘疹、水疱和结 痂，而且各期皮疹同时存在为特点。该病为自限性疾病，病后可获得终身免 疫，也可在多年后感染复发而出现带状疱疹。
水痘躯干部皮疹，病程4～5天
七、实验室检查
1.血常规：白细胞总数减少，淋巴细胞比例相对增多 2.血清学检查：常用酶联免疫吸附法或补体结合试验检测特异细胞中的病毒DNA
八、并发症
1.皮疹继发细菌感染 2.肺炎 3.脑炎
九、诊断
➢ 典型水痘根据临床皮疹特点诊断多无困难 ➢ 典型患者须依赖于实验室检查确定
病毒感染的实验室诊断
空斑形成单位（PFU）：由一个感染性病毒
体复制形成空斑
4.干扰作用：
病毒感染的快速诊断
1. 光学显微镜 检测病毒感染的细胞中有无包涵体、细胞融合形成。 2. 电子显微镜 法等检 测病毒抗原。 4. PCR技术 基因芯片
病毒感染的实验室诊断
Laboratory Diagnosis of Viral Infection 北京大学医学部
病原生物学系
徐国民
病毒感染的实验室诊断
Laboratory Diagnosis of Viral Infection 标本的采集 （原则同细菌）
病毒的分离培养
病毒感染的快速诊断
病毒感染的血清学诊断
病毒感染的血清学诊断
原理： 病毒或其抗原（已知）+ 抗体（未知） 注意： 恢复期血清抗体效价比急性期升高4倍或4倍以上才有 诊断意义。 方法：血凝试验，血凝抑制试验，间接血凝抑制试验， 酶联免疫吸附试验，中和试验 抗体效价
Thank you
病毒核酸检测技术
病毒的分离培养与鉴定
病毒的分离培养
1.动物接种：最原始的病毒培养方法。 2.鸡胚接种：常用的接种部位有羊膜腔、尿囊腔、绒 毛尿囊膜、卵黄囊等。 3.组织培养：将离体活器官，活组织块或分散的活细 胞加以培养后用于病毒的接种。其中细胞培养是病毒 培养最常用的方法。TCID50, PFU
鸡胚模式图
病毒在细胞培养中增殖 的检测指标
1. 细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）：
病毒在感染的细胞内复制增殖， 引起细胞变性、
坏死脱落或形成多形核巨细胞、包涵体的等形态改变。
2.红细胞吸附：
病毒鉴定的方法---科四第5组
6、基因检测技术
基因检测技术对病毒的检测已经达到分子水 平，其灵敏度和特异性是任何生化方法的检测所 不能比拟的，同时可以省略大量的病毒提纯和血 清的制备工作。
原理:（1）分子探针杂交检测技术，利用一定序 列的核苷酸合成探针，通过分子杂交技术，检测 出供试样品中与之相补的碱基序列。 （ 2 ） PCR 技术是通过体外扩增可以使供试 样品中的目的基因片段很快扩增，使之达到了对 即使是病毒含量极低的样品，也能灵敏准确地得 到定性的结果。 返回
4、血清学检测法
5、酶标免疫吸附法 6、基因检测技术 7、蛋白指纹图谱
1、电子显微镜检测法
电子显微镜技术是最直接，最准确的检 测病毒的手段，它可以直接看到病毒的形 态结构、存在与否，所以在进入了分子水 平的今天它仍然有着不可替代的作用。 原理：电子显微镜以电磁波为光源 , 将感 病植物组织制成检测样本 , 利用短波电子 流 , 在电子显微镜下观察 , 可根据病毒的 形态、大小、内含体以及染病组织超微结 构等诊断病毒的种类。
3、免疫电镜检测法
免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技 术相结合的产物，在电镜制样过程中，于铜网上 先铺展一层细胞色素A，稍后再添加一滴抗体， 多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液， 由于细胞色素A的作用，减少了样品即抗体、抗 原的表面能力，能形成均匀的涂层。
原理：在电镜制样过程中，病毒颗粒不能集中的 沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察 时的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和 性与吸附性的这一特点，使病毒能较集中地沉集 在有效视野内，从而便于电镜下的观察，提高了 检测几率。
返回
7、蛋白指纹图谱法
原理：不同病毒蛋白通过一维sDs一PAGE分离能形成各自 独特的蛋白质带型 ( 或指纹图谱 ) 。病毒在感染细胞内繁 殖时，用高浓度 NaCI 特异抑制感染细胞自身的蛋白合成， 分离病毒蛋白后进行一维 sDs 一 PAGE 即可形成蛋自带型 ( 或指纹图谱 ) ，将待测病毒蛋白指纹图谱与电脑内病毒 蛋白指纹图参考软件相比较即可鉴定未知病毒。 步骤:(1)培养病毒经抑制宿主细胞合成后进行同位素标记。 （2）sDs一PAGE分离病毒蛋白。 （3）通过胶扫描对病毒蛋白指纹图谱定位。 （4）抽提蛋白质且以数字的形式将蛋白指纹图存入电膊 硬盘，最后将未知病毒蛋自指纹图与电脑参考指纹图进 行最佳配对比较鉴。
病毒感染实验室诊断与防治原则课件
5
1.病毒感染实验室诊断
• 病毒在培养细胞内增殖的检查与鉴定 ①细胞病变效应(CPE)：一些病毒增殖后引起细胞折
光性下降、圆缩或肿胀、聚集或融合、脱落和死亡。
学习交流PPT
6
1.病毒感染实验室诊断
②红细胞吸附：流感病毒和 某些副粘病毒感染细胞膜上可出 现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、 鸡及人红细胞。抗血清或抗体可 抑制红细胞吸附现象发生，称为 红细胞吸附抑制试验，可作为此 类病毒增殖及初步鉴定指标。 腮腺炎病毒感染细胞吸附红细胞
学习交流PPT
16
2.病毒感染防治原则
▲干扰素和干扰素诱生剂：①干扰素：主要用于乙型 和丙型肝炎病毒、人呼吸道合胞病毒等感染的治疗；②干 扰素诱生剂：如Poly I:C等。
▲中草药：板兰根、穿心莲、大青叶、金银花、黄芩 等中草药对病毒性疾病有预防或治疗作用。
学习交流PPT
17
本章要点
• 病毒感染标本采集与送检注意事项。 • 病毒分离培养方法、增殖指标及细胞病变效应。 • 简述病毒感染快速诊断方法。 • 预防病毒感染人工主动自动免疫制剂
▲荧光显微镜检查：荧光标记抗体染色镜检，常用。
▲透射电镜检查：很少用。
狂
A
B
犬
病
毒
内
基
小
体
A：正常细胞；B：病毒感染细胞
学习交流PPT
4
1.病毒感染实验室诊断
• 病毒分离培养：细胞培养、鸡胚接种、动物接种法。 ▲细胞培养法：原代、二倍体、传代细胞培养，不同病
毒选择不同细胞进行分离培养。
学习交流PPT
段，具有高通量、高敏感性和特异性等优点。
学习交流PPT
13
1.病毒感染实验室诊断
病毒感染的实验室诊断
病毒感染的实验室诊断病毒感染的试验室检查包括病毒分别与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。
临床医师依据流行病学资料，疾病的症状与体征综合推断可能为何种病毒感染，留取相宜的标本送检。
一、检材的采集与送检病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、咯痰、粪便、脑脊液、疱疹内容物、活检组织或尸检组织等。
供分别病毒、检出核酸及抗原的标本的，要求：(一)尽早实行在发病初期(急性期)实行，较易检出病毒，越迟阳性率越低。
(二)部位相宜由感染部位实行，如呼吸道感染实行鼻咽洗漱液或咯痰；肠道感染实行粪便；脑内感染实行脑脊液；皮肤感染实行病灶组织；有病毒血症时实行血液。
(三)冷藏速送病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得检材应尽快送检。
若距离试验室较远，应将检材放入装有冰块或干冰的空器内送检。
病变组织则应保存于50%的甘油缓冲盐水中。
污染检材，如鼻咽分泌液、粪便等应加入青霉素、链霉素或庆大毒素等，以免杂菌污染细胞或鸡胚，而影响病毒分别。
检测特异性抗体需要实行急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后马上实行，其次份在发病后2～3周实行。
血清标本放4℃-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。
无菌性脑炎患者也可取脑脊液检测特异性lgM。
表80-1 病毒检材采集与检验结果的关系实行标本的时期检查病毒及其成分测定抗体埋伏期及前驱期刚发病或急性期恢复期及康复期较难查见最多查见很难查见未增多未增多或增多不明显明显增多(常超过4倍)表80-2 供病毒分别的检材临床表现常见病毒关心诊断有用的检材呼吸道感染腺病毒巨细胞病毒流感病毒副流感病毒呼肠孤病毒合胞病毒咽试、肛拭咽试或含漱液、尿液咽拭或含漱液咽拭含漱液咽拭、粪便或肛拭咽拭或含漱液、鼻咽洗液出疹疾病柯萨奇病毒巨细胞病毒埃可病毒EB病毒单纯疱疹病毒麻疹病毒风疹病毒水痘带状疱疹病毒粪便或肛拭、咽拭咽拭或含漱液、尿液粪便或肛拭、咽拭咽拭或含漱液病灶棉拭或吸取液、咽拭咽拭或含漱液、尿液咽洗液、鼻咽拭病灶棉拭或吸取液、咽拭脑炎虫媒病毒单纯疱疹病毒麻疹病毒血液、脑脊液脑活检、脑脊液、疱疹棉拭或吸取液脑脊液、咽拭或含漱液、尿液粪便或肛拭、咽拭、脑脊液无菌性脑膜炎柯萨奇病毒埃可病毒腮腺炎病毒脑脊髓液、粪便或肛拭、咽拭脑脊液、粪便或肛拭、咽拭脑脊髓液、口颊粘膜棉拭失天或新生儿感染巨细胞病毒风疹病毒单纯疱疹病毒尿液、咽拭或含漱液咽拭或含漱液、尿液病灶棉拭或吸取液、回拭眼部感染腺病毒结膜棉拭、咽拭、肛拭结膜棉拭、病灶棉拭或吸取液、咽拭其它感染巨细胞包涵体疾病单核细胞增多综合征心包炎、心肌炎巨细胞病毒巨细胞病毒EB病毒柯萨奇B病毒埃可病毒尿液、咽拭尿液、咽拭咽拭或洗液心包液、粪便、咽拭心包液、粪便、咽拭二、病毒的分别与鉴定(一)病毒的分别病毒分别的一般程序见表80-3。
病毒感染性疾病的实验室诊断
2. 鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、 痘类病毒的较为理想的材料。 （1） 常用接种部位和用途
38-39℃
卵黄囊接种 羊水腔接种
新鲜受精卵
5-13天
尿囊腔接种
绒毛尿囊膜接种
卵壳 气室 羊膜 尿囊
绒毛尿 囊膜
羊水囊
卵黄囊
卵白
① 卵黄囊接种：用于流行性脑炎病毒分 离 ② 羊水腔接种：用于流感病毒、副流感 病毒的初次分离 ③ 尿囊腔接种：用于流感病毒、腺病毒、 腮腺炎病毒分离 ④ 绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒、疱疹 病毒分离
（1） 中和试验：是将病毒与特异性抗 体进行免疫反应，使病毒失去感染性， 在细胞培养和活的机体内不出现病变 的试验。常用细胞培养进行中和试验。
方 法：
①固定病毒（100TCID50），稀释血清，测Ab 效价。两次效价相差4倍以上有诊断意义。 TCID50：50%组织细胞感染的病毒剂量 (50%Tissue cell infective dose TCID50)
（4） 理化性质的测定 ① 病毒的大小和形态：可用电镜观察病毒 的大小和形态。 ② 核酸类型鉴别及序列测定：利用5-溴2-脱氧尿苷（BUDR）抑制DNA复制的 特性，在细胞培养液中加入该物质，可 抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞 病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用， 以次判断病毒核酸类型。也可对病毒特 异序列或全序列的碱基排列测定或DNA 杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。
④ 干扰现象： 一种病毒感染细胞后，可以干扰以后 进入的病毒的增殖。利用此现象鉴定不 引起形态学变化的病毒。如某些型别的 鼻病毒能干扰以后进入的副流感Ⅰ型病 毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附 作用。
⑤ 红细胞吸附及吸附抑制试验： 红细胞吸附现象的产生是由于病毒在 细胞膜成熟时，将其血凝素插入细胞膜， 使受染细胞吸附红细胞，是病毒增殖的 指标。该现象可被相应的病毒特异性抗 体所抑制，称为红细胞吸附抑制试验， 可用来鉴定病毒。
病毒的诊断和检测方法
病毒的诊断和检测方法一、病毒越来越多随着科技的不断进步，我们的医学工具也在不断改善。
但是，一些新疾病越来越普遍，特别是病毒性疾病。
新兴病毒通过空气、飞沫、凝胶、体液等多种传播方式传播，对我们的健康构成了严重的威胁。
二、病毒诊断的方法在医学的疫情分析中，病毒检测是最基本的诊断方法之一。
通常，病毒的检测可以分为以下几种方法：1. 肉眼观察检测：这是最原始的方法之一。
通过检查感染部位、体液和病变器官等，分析病原体的感染位置、数量和分布情况。
但是，由于肉眼观察的局限性，这种方法只适用于一些表面的病变。
2. 细胞培养检测：这种方法是将样本放入细胞培养基中，培养封闭原型细胞和病毒，并使用特定的抗体来检测病毒的数量和类型。
这种方法可以检测世界上几乎所有病毒，但其检测过程可能需要几天或更长时间。
3. 核酸检测：这是一种最先进的方法之一，通过PCR（聚合酶链式反应）等技术检测病毒的RNA或DNA等相关标记，从而确定病毒的数量和类型等。
此外，还可以将这种方法与质谱或微阵列相结合，以获得更准确的结果。
4. 血浆检测：基于血浆和血清中的抗体和抗原来检测病毒。
虽然速度较慢，但对于许多病毒有很高的检测率。
三、病毒检测技术的特点就目前的一些技术而言，各种病毒检测技术各有特点。
例如，肉眼观察简单方便、细胞培养可用于多种病毒的检测，而核酸检测和血浆检测则更为准确。
虽然各种技术的快速性和安全性也各不相同，但研发人员正探索着新的方法。
随着大量数据的产生，人工智能也已经应用于病毒检测领域。
对于病毒的识别、分型以及感染路径分析，人工智能已经被广泛使用，并已取得了一定的成果。
一些诊断设备也已更新，使人们能够更准确地检测病毒。
四、结论总体来看，现代医疗科技正在努力寻找更好的检测病毒的方法。
虽然新型病毒的产生是不可避免的，但我们期待这些新技术的应用能够更快速、更可靠的预防和治疗这些疾病，对于人类健康事业做出更大的贡献。
病毒及病毒类疾病的实验室诊断—病毒类疾病的实验室诊断(动物微生物技术课件)
8/27/2023
41
动物微生物应用技术
二、狂犬病毒
生物学特性：单股RNA病毒，有囊膜，外形似子弹，核衣壳螺旋对称； 抵抗力：加温40℃ 1h或者60℃ 30min可灭活； 致病性：接触性传播，咬伤。急性直接接触性传染病,人和各种畜禽对 本病都有易感性；犬、猫带毒是重要的传染来源；死亡率100%。 人感染狂犬病病毒的主要途径：（1）被患病犬或猫咬伤；（2）被带毒 的犬和猫咬伤或抓伤；（3）亲密接触犬和猫。
8/27/2023
26
八、 鸡新城疫病毒（NDV）
（三）致病性
NDV不同毒株对宿主的致病力相差很大，鸡是高度敏感的， 鸭和鹅可能被感染，但不表现临床症状。
NDV对鸡的致病性主要由病毒株决定，但感染剂量、感染途 径、鸡的日龄和环境条件也有影响。一般越小发病越急，雏 鸡感染野外强毒可能突然死亡，较大的鸡可能病程较长，并 有典型的临床症状。自然感染的鸡呼吸道症状较重，而肌肉 、脑内和静脉注射感染的鸡神经症状较重。
透射电子显微镜 扫描电子显微镜
三、病毒的分离培养与初步鉴定
H1N1流感病毒电子显微镜图片
狂犬病病毒电子显微镜图片
三、病毒的分离培养与初步鉴定
组织细胞培养
原代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞
鸡胚培养
羊膜腔接种 尿囊腔接种 卵黄囊接种 绒毛尿囊膜接种
动物接种
三、病毒的分离培养与初步鉴定
1.组织细胞培养
二、狂犬病毒
微生物学诊断： 1.包涵体检查，取大脑、小脑、海马角部分。 2.动物实验； 3.血清学诊断； 预防及治疗：免疫接种及捕杀； 人被咬伤后： 1.伤口处理消毒：20%肥皂水冲洗，碘酒涂擦； 2.被动免疫； 3.疫苗接种。
病毒的诊断
病毒的分离和鉴定:㈠标本的采集和运送:为了保证采集充足量活病毒标本，必须注重：采集部位、时光及运送过程。
1.标本采集部位: 标本材料包括血液、组织器官如脑、肝、肌肉等；鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物；咽喉拭子；粪便；无菌的体液或鸡胚液。
按照临床症状、流行病学举行分析，初步判断可能是哪一种病，再决定采集何种标本。
大多数情况采集动物脏器或淋巴组织；腹泻动物，采集粪便，检测细小病毒或轮状病毒；疑似口蹄疫，采集水疱皮或水疱液等。
用拭子采集到的标本（如鼻、肛），应赶紧浸泡于生理盐水、PBS或细胞培养液中。
有的病毒不稳定，如单纯疱疹病毒、流感病毒等，应尽早接种敏激动物或组织。
2.标本采集时光: 在发病的早期，普通越早越好。
晚期：①可能发生继发感染，增强判断艰难；②体内易产生抗体，病毒成熟释放减少, 分离病毒比较艰难③尸体标本最好在死后6小时内采集，否则病毒容易死亡。
3.标本的运送: 大多数病毒对热不稳定，以赶紧接种为好。
如需运送或保存，必须在冷环境。
48小时内，普通在50%中性甘油中 4℃保存；较长时光，最好放在-20℃以下、干冰或液氮保存。
4.分离材料尽量避免反复冻融。
㈡标本的处理1.研磨与稀释2.除菌处理:①抗生素处理，4℃过夜。
青链霉素②离心10，000 r/min第 1 页/共 4 页③对乙醚有抵御力的病毒如肠病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等可以加等量乙醚，4℃过夜。
㈢标本的接种途径: （标本接种于哪一种动物、鸡胚或细胞，以及选择哪一种接种途径，主要决定于病毒的嗜性）普通嗜神经性病毒主要举行动物脑内接种嗜呼吸道病毒接种动物的鼻腔或鸡胚尿囊腔嗜皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿囊膜嗜内脏病毒可接种动物的腹腔、静脉、肌肉υ鸡胚羊膜腔和尿囊腔：普通是测定其血凝素的产生，如流感病毒、新城疫病毒υ绒毛尿囊膜接种主要看见其痘斑υ卵黄囊接种主要看见鸡胚的死亡υ不同病毒复制需要的宿主细胞不同υ原代细胞最敏感。
病毒及病毒类疾病的实验室诊断—病毒的特性和致病性(动物微生物技术课件)
任务三：病毒的特性和致病性
任务三：病毒的其他特性和致病性
一、干扰现象和干扰素
干扰现象：当两种病毒感染同一细胞或机体时，一种病毒抑制另 一种病毒的进入或复制，称病毒的干扰现象。 先进入细胞的病毒干扰后进入的病毒；死的干扰活的；缺陷病
毒干扰完整病毒。 干扰现象的机制：
① 诱导干扰素的产生，抑制被干扰病毒的生物合成； ② 占据表面受体或改变宿主细胞代谢途径； ③ 竞争干扰，病毒增值时，消耗了宿主细胞的原料等。
8/27/2023
12
任务三：病毒的其他特性和致病性
五、病毒的致病性——感染途径
急性感染：一般病程较短，病毒常随疾病的痊愈而被消灭 或自体内排除。
持续感染：病毒在体内较长时间存在，在一定时期内无明
显症状。（1）慢性感染（2）潜伏感染（3）慢病毒感染
局部感染
全身感染 细胞外、细胞间、细胞核播散
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
14
8/27/2023
10
任务三：病毒的其他特性和致病性
四、病毒的遗传与变异
病毒遗传的特点：遗传方式简单；受宿主细胞影 响；易产生突变。
病毒变异的类型：突变；重组；重配；表型混合。
病毒基因组研究的意义：保护性表位的研究；高变 区的研究；毒力相关基因的研究、耐药性的研究。
8/27/2023
11
任务三：病毒的其他特性和致病性
4
任务三：病毒的其他特性和致病性
一、干扰现象和干扰素
干扰素：当机体活细胞受病毒感染或干扰素诱生剂刺激 后产生的能干扰病毒复制的一种小分子蛋白质。
动物体内干扰素基因 活化 干扰素mRNA
翻
干扰素诱生剂
译
▪ 干扰素诱生机理 干扰素
第五节 病毒病的实验室诊断方法.
第二章病毒第五节病毒病的实验室诊断方法畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。
除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。
病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。
一、病料的采集、保存和运送病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。
二、包涵体检查有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。
将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。
这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。
但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。
（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3）表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒病毒名称感染范围包涵体类型及部位痘病毒类狂犬病病毒伪狂犬病病毒副流感病毒III型马鼻肺炎病毒鸡新城疫病毒传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等狼、马、牛、猪、人、猫、羊、禽等犬、猫、猪、牛、羊等牛、马、人马属动物鸡鸡嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节层的细胞中嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡上皮细胞及肺的间隔细胞中嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中三、病毒的分离培养将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。
病毒感染性疾病的检验诊断及方法
病毒感染性疾病的检验诊断及方法发表时间：2013-02-28T13:37:24.560Z 来源：《中外健康文摘》2012年第47期供稿作者：邱一凡[导读] 病毒性疾病检验诊断应首先根据临床特征和流行病学资料，初步判断可能感染的病毒。
邱一凡（黑龙江省大庆油田总医院163000）【中图分类号】R511 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）47-0133-02病毒性疾病检验诊断应首先根据临床特征和流行病学资料，初步判断可能感染的病毒。
然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，结合患者当前所处的时机，确定检验诊断的方法。
有些病毒感染潜伏期较短，发病时机体免疫系统尚未完全应答，没有抗体产生，因此可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或病毒核酸。
对于潜伏期超过10天的病毒感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断、区别初次和再次感染。
对可在机体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG抗体滴度有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。
对原因不明，可能有新病毒感染时，应采集相应部位的标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原病毒。
对同一症状可由多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体，对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。
病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。
1 标本的采集与送检临床医师根据流行病学资料，疾病的症状与体征综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的标本送检。
实验结果对诊断病毒感染的价值，很大程度上取决于标本的采集和处理的方式是否恰当。
正确采集标本，及时运送和处理，是极为重要的。
1.1 采集标本的时间尽可能在发病的初期，急性期或患者入院的当天进行。
疾病后期由于机体产生免疫力，开始清除病毒，使病毒数量减少或消失，不易检出。
1.2 标本种类的选择根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第二章病毒
第五节病毒病的实验室诊断方法
畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。
除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。
病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。
一、病料的采集、保存和运送
病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。
二、包涵体检查
有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。
将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。
这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。
但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。
（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3）
表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒
病毒名称感染范围包涵体类型及部位
痘病毒类
狂犬病病毒
伪狂犬病病毒
副流感病毒III型
马鼻肺炎病毒
鸡新城疫病毒
传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等
狼、马、牛、猪、人、猫、羊、
禽等
犬、猫、猪、牛、羊等
牛、马、人
马属动物
鸡
鸡
嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中
嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节
层的细胞中
嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中
嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡
上皮细胞及肺的间隔细胞中
嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间
隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等
嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中
嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中
三、病毒的分离培养
将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。
供接种或培养的病料应作除菌处理。
除菌方法有滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理三种。
如用口蹄疫的水疱皮病料进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH7.6磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1000IU，链霉素1000μg，置2～4℃冰箱内4～6h，然后用8000～10000r/min速度离心沉淀30min，
吸取上清液备用。
被接种的动物、禽胚或细胞出现死亡或病变时（但有的病毒须盲目传代后才能检出），可应用血清学试验及相关的技术进一步鉴定病毒。
四、动物接种试验
病毒病的诊断也可应用动物接种试验来进行。
取病料或分离到的病毒处理后接种实验动物，通过观察记录动物的发病时间、临床症状及病变甚至死亡的情况，也可借助一些实验室的方法来判断病毒的存在。
此方法尤其在病毒毒力测定上应用广泛。
五、病毒的血清学试验
血清学试验在病毒性传染病的诊断中占有重要地位。
常用的方法有：中和试验、补体结合试验、红细胞凝集和凝集抑制试验、免疫扩散试验、免疫标记技术等。
血清学试验的详细内容及操作见第十一章和动物微生物检验技术实训十三～十七。
六、分子生物学方法鉴定病毒
分子生物学诊断又称基因诊断。
主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定。
其特点是反应的灵敏度高，特异性强，检出率高。
是目前最先进的诊断技术。
主要方法有核酸探针、PCR技术和DNA芯片技术。
（一）PCR诊断技术PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。
是80年代中期发展起来的一项极有应用价值的技术。
PCR技术就是根据已知病原微生物特异性核酸序列（目前可以在因特网Gen ebank 中检索到大部分病原微生物的特异性核酸序列），设计合成与其5′端同源，3′端互补的二条引物。
在体外反应管中加入待检的病原微生物核酸（称为模板DNA）、引物、dNTP和具有热稳定性的DNA Taq聚合酶，在适当条件下（Mg++离子，pH等），置于PCR仪，经过变性、复性、延伸，三种反应温度为一个循环，进行20～30次循环。
如果待检的病原微生物核酸与引物上的碱基匹配，合成的核酸产物就会以2n（n为循环次数）呈递数递增。
产物经琼脂糖凝胶电泳，可见到预期大小的DNA条带出现，就可做出确诊。
此技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、重复性好和对原材料要求较低等特点。
它尤其适于那些培养时间较长的病原菌的检查，如结核分支杆菌、支原体等。
PCR的高度敏感性使该技术在病原体诊断过程中极易出现假阳性，避免污染是提高PCR诊断准确性的关键环节。
常用检测病原体的PCR技术有逆转录PCR（RT-PCR）、免疫-PCR等。
RT-PCR是先将mRNA在逆转录酶的作用下，反转录为cDNA（互补DNA），然后以cDNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物的鉴定，检测mRNA相应的病原体。
免疫-PCR是将一段已知序列的质粒DNA片段连接到特异性的抗体（多为单克隆抗体）上，从而检测未知抗原的一种方法。
它是集抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性于一体。
该技术的关键是连接已知抗体与DNA
之间的连接分子，此分子具有两个结合位点，一个位点与抗体结合，另一个位点与质粒DNA结合。
当抗体与特异性抗原结合，形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，再用PCR扩增仪扩增连接的DNA分子，如存在DNA产物即表明DNA 分子上连接的抗体已经与抗原发生结合，因为抗体是已知的，从而检出被检抗原。
（二）核酸杂交技术核酸杂交技术是利用核酸碱基互补的理论，将标记过的特异性核酸探针同经过处理、固定在滤膜上的DNA进行杂交，以鉴定样品中未知的DNA。
由于每一种病原体都有其独特的核苷酸序列，所以应用一种已知的特异性核酸探针，就能准确地鉴定样品中存在的是何种病原体，进而做出疾病诊断。
核酸杂交技术敏感、快速、特异性强，特别是结合应用PCR技术之后，对靶核酸检测量已减少到皮克（pg）水平。
例如检测牛白血病病毒，只要取1～2个感染细胞或10-5μg的宿主DNA，经PCR扩增后，进行斑点杂交试验，即可得出阳性结果。
PCR技术为检测那些生长条件苛刻、培养困难的病原体，为潜伏感染或整合感染动物的检疫提供了极为有用的手段。
（三）核酸分析技术核酸分析技术包括核酸电泳、核酸酶切电泳、寡核苷酸指纹图谱和核苷酸序列分析等技术，它们都已开始用于病原体的鉴定。
例如，一些RNA病毒如轮状病毒、流感病毒，由于其核酸具多片段性，故通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其基因组型，便可做出快速诊断。
又如，DNA病毒如疱疹病毒等，在限制性内切酶切割后电泳，根据呈现的酶切图谱可鉴定出所检病毒的类型。