注射用银杏叶提取物的工艺研究

注射用银杏叶提取物的工艺研究

更新时间：2005-7-20

银杏叶中含多种生理活性成分，如黄酮类化合物、萜内酯等，预防和治疗心、脑血管疾病和老年性痴呆具有良好的效果。银杏叶黄酮多为黄酮糖苷。已从银杏叶中分离出二萜内酯有5种，即银杏内酯 A,B,C, J和M,倍半萜内酯1种，即白果内酯（gink- golide）。

国内已开发上市的含银杏叶提取物的品种有固体制剂和注射液，目前市场上作者未见有供注射用的银杏叶提取物原料药，本试验针对其工艺进行了中式规模的研究，该工艺简便，适合于工业生产。

试药与仪器

银杳叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，购于山东郑城，经检定，本品符合中华人民共和国药典2000年版一部银杏叶项下有关规定。槲皮素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 均由中国药品生物制品检定所提供。

岛津LC-l0ATVP双泵，岛津SPD-10AVP 紫外-可见检测器。CLASS-VP色谱工作站。试剂：乙腈为色谱纯，乙醇为医用酒精，其他试剂为分析纯，水为重蒸水。ZFQ-971型旋转薄膜蒸发器。

方法与结果

1 工艺过程

1.1 粗品制备

已经粉碎至0.3～0.5cm碎块的银杏叶以70％乙醇60℃温浸提取，提取2次，每次2h，合并提取液，回收乙醇至相对密度（1.03～1.09，50℃测），加 4倍叶重量的水，1～4℃冷藏放置8h，过滤。滤液上DM130大孔吸附树脂柱，分别以3～4倍柱体积水、 3倍柱体积15％乙醇、70%乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，在温度为50～60℃，真空度-0.08～- 0.09MPa条件下，减压浓缩，真空干燥，得粗品。

1.2 精制过程

粗品粉碎，加5倍95％乙醇回流提取2次，每次15min，合并2次提取液，减压回收乙醇，浓缩，真空干燥后，加入8倍粗品重量的水，加热至沸，保持沸腾5min，放置室温，冷藏8h，过滤，滤液加入粗品 1/4的聚酰胺树脂（60～80目）搅拌5min，过滤，滤液在温度为50～60℃，真空度-0.08～-0.09MPa 条件下，减压浓缩，真空干燥，粉碎成80目，即得注射用银杏叶提取物。

2 工艺路线考察

2.1 测定成分的选择和限度

银杏总黄酮和萜类内酯为银杏叶中主要活性成分，以HPLC测定其含量，可以有效反映工艺合理性，控制产品质量，限度为银杏总黄酮含量＞24%；萜类内酯＞6%。

2.2 测定方法的确定

参照国家药品标准WS-10001-(HD-0087)- 2002银杏达莫注射液和中华人民共和国药典2002年增补本银杏叶提取物含量测定方法，采用HPLC法测定银杏总黄酮、萜类内酯的含量。

2.2.1 银杏总黄酮色谱柱：AgilentZorbax SB - C18柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）；流速1.0mL·min-1；检测波长为 360nm。

对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品约 6mg,置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液的制备精密称取本品适量，加甲醇-25％盐酸(4:1)的混合溶液25mL,置水浴中加热回流2h，迅速冷却至室温，转移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取滤液，即得。

测定法精密量取对照品及供试品溶液各 20uL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中最大的3

个高峰，按保留时间依次为榭皮素（Q）、山奈酚 (K）、异鼠李素（I），以外标法计算Q,K和I的含量，按照下式计算总黄酮的含量。

总黄酮含量＝Q×2.50＋K×2.59＋I×2.44，式中Q, K, I分别代表各自的含量。

2.2.2 萜类内萜色谱柱AgilentZorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm;5μm），流动相：正丙醇-四氢呋喃-水（1:15:84）；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500，白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。

对照品溶液的制备分别精密称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1mL各含1,0.5,0.5和0.5mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备精密称取本品适量，加水 l0mL，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸2滴，用醋酸乙酯振摇提取4次（15，10，10，l0mL），合并提取液，用5％酯酸钠溶液20mL洗涤，分取酯酸钠液，再用醋酸乙酯lomL洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20mL，合并水洗液，用酯酸乙酯lOmL洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣用丙酮溶解并转移5mL量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，即得。

2.3 主要工艺条件考察

有关银杏叶提取物工艺研究相关报道特别多，在此报道未见的关键几步研究。

2.3.1 水沉淀工艺考察醇提取液里含有大量杂质，主要为叶绿素、树胶等，加水可去除相应杂质。对银杏叶醇提液浓缩后，加4倍叶重量的水，沉淀，放置8h，放置温度选择室温、1～4℃冷藏、5～10℃进行考察。结果见表1。

表1 水沉淀工艺考察结果表

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放置温度总黄酮含量/% 溶液状态——————————————————————

室温 4.38 黄棕混浊

5～10℃ 4.62 红棕色略混浊

1～4℃ 5.13 红棕色透明——————————————————————

以上结果显示，4℃效果最好，杂质沉淀比较完全，故选择1～4℃冷藏8h。

2.3.2 柱分离纯化工艺考察结合银杏叶中黄酮类成分性质和文献，选用DM130大孔吸附树脂（山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂）。

2.3.2.1 树脂吸附量测定称取银杏叶50g,加6 倍70％乙醇60℃温浸提取，提取2次，每次2h，在真空度为-0.09MPa温度为54℃条件下减压浓缩至相对密度（1.06，50℃），加200mL水搅拌，冷藏放置8h，过滤，滤液定容至250mL，备用。

取DM130大孔吸附树脂5g，处理完毕后装柱，然后用醇、水处理后，取上述滤液，上DM130大孔树脂柱吸附，为防止树脂过载，造成药液泄露，洗脱液用不同容器收集，每隔15min，换一个收集洗脱液的容器，同时采用盐酸-镁粉反应检测流出液，检测出现樱红色，立即停止上样，以上一个上样液体量计算，折合为银杏叶重。试验结果如下表2。

表2 树脂吸附量测定——————————————————————————

树脂用量上样液体用量折合银叶重检测时间检测结果

/g /mL /倍 /min ——————————————————————————

5 12.5 0.5 15 无颜色变化

5 25 1 30 无颜色变化

5 37.5 1.5 45 无颜色变化

5 50 2 60 无颜色变化

5 62.5 2.5 75 无颜色变化

5 75 3 90 樱红色——————————————————————————

结果表明：树脂吸附量为银杏叶重的2.5倍，故常规吸附量应该控制在0.5～2.5倍银杏叶重内。