人类基因定位与克隆PPT课件
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绘制遗传连锁图的方法有很多，随着DNA多态性的开发， 使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态 性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随 机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)； 80年代后出现的有SSR(短串联重复序列，又称微卫 星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷 酸的多态性)分析。
-
17
1. 将基因定位于染色体 2. 特定区段 2. 候选基因筛选鉴定
-
18
定位克隆的主要目的之一是将目标 基因定位于特定染色体上。
主要方法： 家系调查法 体细胞杂交法 核酸杂交技术 等等
-
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19
疾病基因分析
问
题
是否为遗传性状
如果为复杂性状，有无主基 因，为显性还是隐性
方
法
家系分析
分离分析
主基因如何定位
-
11
寻找新基因的方法
• 功能克隆 • 定位克隆 • 定位候选克隆 • 差异表达 • 生物信息学方法
通过ORF的预测 通过EST的拼接 • 基因芯片技术
-
12
功能克隆
• 克隆（致病）基因的 一种策略。
疾病
性状 （疾病）
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
• 收集所要克隆的基因 的蛋白质产物及其功 能的信息，用以分离 基因，并对基因进行 定位。
染色体定 位
-
从氨基酸序列 出发设计
DNA引物，从 文库调取基因
基因
得到基 因序列
13
分析异常基因的产物（蛋白质），纯化蛋白质， 弄清它是如何引起临床症状的有两条不同的路线：
1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成 寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库或基因组文库中 筛选对应的编码基因；
基因，并进一步研究其
功能。
-
遗传标记， 染色体定位
mRNA cDNA
功能
蛋白质产物 生物学功能
16
定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因在 染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基因 ， 进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。
基本思路是通过连锁分析原理进行基 因定位。
若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在向 子代传递时会发生自由分离 ，呈“连锁平衡”；反 之 ，则不发生自由分离 ，而呈现“共分离”现象 ，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某 一DNA标记相连锁的基因。
2. 将异常蛋白质制成相应的抗体，从cDNA表达文库中筛选
相应克隆。得到克隆后，就可以通过DNA序列分析确定导
致疾病的分子缺陷。
3.
绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白
化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）
和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取
• 人类基因组：22条常染色体和X，Y染色 体的DNA组成。
-
5
种类 大肠杆菌 啤酒酵母 线虫 果蝇 蝗虫 小鼠 豌豆 玉米 小麦 人
基因组大小
Mb
4.64
12.1
100
140
5000
3300
4800
5000
17000
- 3000
6
C值悖论
• 生物体单倍体DNA总量称为 C值。
• 高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动， 所以，理论上应该是它们的C值也应该更高。 但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相 关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它 的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的 DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。
-
7
DNA序列的分类
• 基因序列和非基因序列 基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束 的一段DNA序列，称为开放阅读框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。
• 编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。
连锁分析
致病基因是否与DNA标记连 锁
参数分析
在患者同胞或亲属间是否存 在某些等位基因分布异常
等位基因共享法
基因的精细定位
多位点分析
-
20
以家系为基础的连锁分析
人类基因定位与克隆
-
1
定位的方法有体细胞杂交，家系连锁分 析，原位杂交，剂量效应法，染色体畸 变，限制性酶的精确分析等，其中前三 者用得较多。
-
2
通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图 称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的 重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即 每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。
的这一策略。
-
14
血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症 正常HbA四条多肽链（2条链，两条链）
-
15
定位疾克病隆 疾病
• 利用遗传连锁或细胞学 定位技术将致病基因定
位于染色体的特定区带。
• 定位：通过连锁分析找
出与目的基因紧密连锁
的遗传标记在染色体上
的位置。
基因
• 克隆：从定位的染色体 序列
区段内分离克隆所要的 基因
-
3
物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠 序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基 对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。
以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布 于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定 位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设 计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较 并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂 交，使每隔100kb就有一个标志；
-
8
• 单一序列和重复序列 单一序列： 基因组中只有一份的DNA序列。
重复序列：基因组中重复出现的序列。例如， STR，SNP，微卫星DNA等。
-
9
寻找基因
• 什么是基因？ • 基因在哪里？
-
10
寻找基因的思路：
基因定位
将基因定位于染色体上
基因克隆 有大到小，由粗到细，精细定位
基因分离
克隆目的基因片段
二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数
百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的
YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的
DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为
高精度物理作图.
-
4
基因组
• 基因组：生物细胞中单套染色体的所含 DNA序列的全部组成。
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17
1. 将基因定位于染色体 2. 特定区段 2. 候选基因筛选鉴定
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定位克隆的主要目的之一是将目标 基因定位于特定染色体上。
主要方法： 家系调查法 体细胞杂交法 核酸杂交技术 等等
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疾病基因分析
问
题
是否为遗传性状
如果为复杂性状，有无主基 因，为显性还是隐性
方
法
家系分析
分离分析
主基因如何定位
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11
寻找新基因的方法
• 功能克隆 • 定位克隆 • 定位候选克隆 • 差异表达 • 生物信息学方法
通过ORF的预测 通过EST的拼接 • 基因芯片技术
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功能克隆
• 克隆（致病）基因的 一种策略。
疾病
性状 （疾病）
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
• 收集所要克隆的基因 的蛋白质产物及其功 能的信息，用以分离 基因，并对基因进行 定位。
染色体定 位
-
从氨基酸序列 出发设计
DNA引物，从 文库调取基因
基因
得到基 因序列
13
分析异常基因的产物（蛋白质），纯化蛋白质， 弄清它是如何引起临床症状的有两条不同的路线：
1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成 寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库或基因组文库中 筛选对应的编码基因；
基因，并进一步研究其
功能。
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遗传标记， 染色体定位
mRNA cDNA
功能
蛋白质产物 生物学功能
16
定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因在 染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基因 ， 进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。
基本思路是通过连锁分析原理进行基 因定位。
若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在向 子代传递时会发生自由分离 ，呈“连锁平衡”；反 之 ，则不发生自由分离 ，而呈现“共分离”现象 ，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某 一DNA标记相连锁的基因。
2. 将异常蛋白质制成相应的抗体，从cDNA表达文库中筛选
相应克隆。得到克隆后，就可以通过DNA序列分析确定导
致疾病的分子缺陷。
3.
绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白
化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）
和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取
• 人类基因组：22条常染色体和X，Y染色 体的DNA组成。
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种类 大肠杆菌 啤酒酵母 线虫 果蝇 蝗虫 小鼠 豌豆 玉米 小麦 人
基因组大小
Mb
4.64
12.1
100
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5000
3300
4800
5000
17000
- 3000
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C值悖论
• 生物体单倍体DNA总量称为 C值。
• 高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动， 所以，理论上应该是它们的C值也应该更高。 但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相 关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它 的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的 DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。
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DNA序列的分类
• 基因序列和非基因序列 基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束 的一段DNA序列，称为开放阅读框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。
• 编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。
连锁分析
致病基因是否与DNA标记连 锁
参数分析
在患者同胞或亲属间是否存 在某些等位基因分布异常
等位基因共享法
基因的精细定位
多位点分析
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以家系为基础的连锁分析
人类基因定位与克隆
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1
定位的方法有体细胞杂交，家系连锁分 析，原位杂交，剂量效应法，染色体畸 变，限制性酶的精确分析等，其中前三 者用得较多。
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通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图 称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的 重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即 每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。
的这一策略。
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血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症 正常HbA四条多肽链（2条链，两条链）
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定位疾克病隆 疾病
• 利用遗传连锁或细胞学 定位技术将致病基因定
位于染色体的特定区带。
• 定位：通过连锁分析找
出与目的基因紧密连锁
的遗传标记在染色体上
的位置。
基因
• 克隆：从定位的染色体 序列
区段内分离克隆所要的 基因
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物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠 序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基 对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。
以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布 于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定 位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设 计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较 并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂 交，使每隔100kb就有一个标志；
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• 单一序列和重复序列 单一序列： 基因组中只有一份的DNA序列。
重复序列：基因组中重复出现的序列。例如， STR，SNP，微卫星DNA等。
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寻找基因
• 什么是基因？ • 基因在哪里？
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10
寻找基因的思路：
基因定位
将基因定位于染色体上
基因克隆 有大到小，由粗到细，精细定位
基因分离
克隆目的基因片段
二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数
百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的
YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的
DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为
高精度物理作图.
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基因组
• 基因组：生物细胞中单套染色体的所含 DNA序列的全部组成。