人类基因定位与克隆PPT课件
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
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基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因定位常用的方法ppt课件
4）原位杂交的步骤
制备中期染色体 DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上） 洗膜 放射性标记：放射自显影 检测 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 记录杂交信号 结合染色体形态进行基因定位
DMD女性患者的核型
X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果
两个研究小组分别采用两种不同的方法克隆了DMD基因： 一组是通过X常染色体易位，克隆了该基因的一部分。 另一研究组使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA，利用消减技术，获得了在正常X染色体存在而在这个男孩DNA中缺乏的DNA克隆片段。
遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。 染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。
5）荧光原位杂交 （florescence in situ hybridization，FISH）
用特殊荧光素（dig或Biotin）标记探针DNA（Nick translation 标记法），变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。 FISH 优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。 缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。
HAT选择系统：
人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料
基因定位与克隆
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
体细胞杂交
TK: chromosome 17
杂种细胞克隆嵌板
Hybrid clone A B C Human chromosome 1 + + + 2 + + 3 + + 4 + 5 + + 6 + 7 + 8 -
体细胞杂交
微细胞融合( 微细胞融合(microcell fusion)
人工建立的仅含有一条人类染色体 的杂种细胞， 微细胞， 的杂种细胞 ， 即 微细胞 ， 再与啮齿类细 胞进行融合。 胞进行融合。
体细胞杂交
区域定位(regional 区域定位(regional assignment)
依据染色体结构畸变的特点， 依据染色体结构畸变的特点 ， 建立 只含有特殊的部分人类染色体的杂种细 胞，再与啮齿类细胞进行融合。 再与啮齿类细胞进行融合。
定位克隆
Met A A Met Val Ser Leu Gln Pro
T G G T C T C A C T G C A A C C G
T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T Stop A A C C G
候选克隆
候选克隆(candidate cloning)是一种 候选克隆 是 用定位和非定位的信息相结合来克隆致病 基因，即根据一些基因的位置、表达、功 基因，即根据一些基因的位置、表达、 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。
候选克隆
定位候选克隆
基因定位与克隆
第5章 基因定位与克隆
基因定位 基因克隆
寻找基因的思路：
基因定位 基因克隆 基因分离
克隆目的基因片段 将基因定位于染色体上
e mapping )
基因定位：是指用一定的方法将基因确定到染
色体的实际位置。
Wilson, 1911年首次将红绿色盲基因定位到X
二、体细胞杂交法
体细胞杂交法 也称细胞融合(cell infusion)，是将来源 不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产 生的细胞称杂种细胞(hybrid cell)，含双亲 不同的染色体。
原理
细胞进行融合时，培养液中只有部分细 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。
SSR标记RM169和RM39在Ⅱ-32B/162d F2代半矮秆和矮秆群体中的分离
F2群体 RM169 半矮秆 矮秆 RM39 半矮秆 矮秆 总株数 Ⅱ-32B带型 杂合带型 株数 株数 18 57 20 39 5 15 5 9 9 31 11 22 162d带型 株数 4 11 4 8 理论比 X2 P
混合池的利用：
在实际利用中，两个混合池通常与两个亲本一 起做分子标记的分析。当两个亲本的带型有差异， 而两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的 基因不连锁；当两个亲本的带型有差异，而两个混 合池的带型也有相应的差异时，表明该标记与目的 基因可能存在连锁关系。 通过混合池的利用筛选出可能与目的基因存在 连锁关系的标记后，还要利用整个作图群体做连锁 分析，才能确定它们之间的连锁关系。
plno 1 3 4 5 6 8 9 10 11 13 14 15 16 17 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 34 35 37 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
基因定位 基因克隆
寻找基因的思路：
基因定位 基因克隆 基因分离
克隆目的基因片段 将基因定位于染色体上
e mapping )
基因定位：是指用一定的方法将基因确定到染
色体的实际位置。
Wilson, 1911年首次将红绿色盲基因定位到X
二、体细胞杂交法
体细胞杂交法 也称细胞融合(cell infusion)，是将来源 不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产 生的细胞称杂种细胞(hybrid cell)，含双亲 不同的染色体。
原理
细胞进行融合时，培养液中只有部分细 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。
SSR标记RM169和RM39在Ⅱ-32B/162d F2代半矮秆和矮秆群体中的分离
F2群体 RM169 半矮秆 矮秆 RM39 半矮秆 矮秆 总株数 Ⅱ-32B带型 杂合带型 株数 株数 18 57 20 39 5 15 5 9 9 31 11 22 162d带型 株数 4 11 4 8 理论比 X2 P
混合池的利用：
在实际利用中，两个混合池通常与两个亲本一 起做分子标记的分析。当两个亲本的带型有差异， 而两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的 基因不连锁；当两个亲本的带型有差异，而两个混 合池的带型也有相应的差异时，表明该标记与目的 基因可能存在连锁关系。 通过混合池的利用筛选出可能与目的基因存在 连锁关系的标记后，还要利用整个作图群体做连锁 分析，才能确定它们之间的连锁关系。
plno 1 3 4 5 6 8 9 10 11 13 14 15 16 17 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 34 35 37 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
基因克隆PPT课件
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
基因克隆简介ppt课件
3
➢ 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
➢ 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自
我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重 组DNA分子。
➢ 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称 寄主细胞）并与之一起增殖。
➢ 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的 目的基因。
IPTG
Isopropyl-beta-Dthiogalactoside
编辑版pppt
异丙基 硫代 -β-D-半乳糖 苷
34
③ Xgal
（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷
编辑版pppt
35
b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解 成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛 蓝。
➢ 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，
使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人
类所需要的物质。
编辑版pppt
4
编辑版pppt
5
二. 用于基因克隆的工具酶
编辑版pppt
6
1. DNA限制性内切酶
1.1、限制酶概念提出的背景
20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体 不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“ 限制现象”。
44
编辑版影印到滤膜上，或将菌 种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜 上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之 固定在滤膜上并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交 作用。
人类基因定位与克隆PPT课件
-
3
物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠 序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基 对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。
以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布 于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定 位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设 计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较 并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂 交，使每隔100kb就有一个标志；
-
41
DNA指 纹
基因组中存在着多种重复序列，拷贝数从几个
到数十万个，可分为串联重复序列和分散重复序
列。根据个体重复序列拷贝的位置和数目的差异， 使 用 限 制 性 内 切 酶 ， 获 得 具 有 个 体 特 异 性 的 DNA 片段。可以作为亲缘关系或个人身份的鉴定。
绘制遗传连锁图的方法有很多，随着DNA多态性的开发， 使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态 性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随 机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)； 80年代后出现的有SSR(短串联重复序列，又称微卫 星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷 酸的多态性)分析。
2. 将以通过DNA序列分析确定导
致疾病的分子缺陷。
3.
绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白
化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）
和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取
基因定位与克隆PPT课件
基因定位与克隆
编辑版ppt
1
广泛定义
基因定位或基因制图(gene mapping)：
人类的基因定位或基因制图(gene mapping)是近年来发
展最快的领域之一。它的目的在于决定不同的基因在染色体
上的位置。一条染色体是一条独立的DNA链，同一条染色体
上的基因在该染色体上呈线性排列。人类的20000-25000个
编辑版ppt
NLM8 G
体细胞杂种法
• 体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。这些 融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人 类染色体趋势，而保留所有的鼠染色体。
• 保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只 有一条甚至某条染色体的一部分。
• 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂 种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybrid panel)，结 合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋 白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色 体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位 以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。
编辑版ppt
6
染色体畸变法
• 畸变常涉及两个位点，如果这两个位点之一正好 是某一功能基因所在的位置，染色体的畸变则肯 破坏该基因的正常功能而引起疾病，根据染色体 畸变的位置和疾病发生的关系，则可将致病基因 定位于染色体的某一特定位置上。
编辑版ppt
7
染色体异常进行基因定位---睾丸决定因子
Testis determining factor
编辑版ppt
2
基因克隆： 基 因 克 隆 通 常 涉 及 到 将 构 成 某 一 基 因 的 基 因 组 DNA
(genomic DNA，gDNA) 或互补DNA(complemantary DNA, cDNA)插入某一载体内，利用载体在宿主细胞(通常用大肠杆 菌)中大量繁殖而获得该基因的足够量的拷贝，以便于进行基 因的结构和功能的分析，广义的基因克隆也包括任何使基因或 DNA片段扩增的操作 。
编辑版ppt
1
广泛定义
基因定位或基因制图(gene mapping)：
人类的基因定位或基因制图(gene mapping)是近年来发
展最快的领域之一。它的目的在于决定不同的基因在染色体
上的位置。一条染色体是一条独立的DNA链，同一条染色体
上的基因在该染色体上呈线性排列。人类的20000-25000个
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NLM8 G
体细胞杂种法
• 体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。这些 融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人 类染色体趋势，而保留所有的鼠染色体。
• 保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只 有一条甚至某条染色体的一部分。
• 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂 种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybrid panel)，结 合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋 白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色 体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位 以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。
编辑版ppt
6
染色体畸变法
• 畸变常涉及两个位点，如果这两个位点之一正好 是某一功能基因所在的位置，染色体的畸变则肯 破坏该基因的正常功能而引起疾病，根据染色体 畸变的位置和疾病发生的关系，则可将致病基因 定位于染色体的某一特定位置上。
编辑版ppt
7
染色体异常进行基因定位---睾丸决定因子
Testis determining factor
编辑版ppt
2
基因克隆： 基 因 克 隆 通 常 涉 及 到 将 构 成 某 一 基 因 的 基 因 组 DNA
(genomic DNA，gDNA) 或互补DNA(complemantary DNA, cDNA)插入某一载体内，利用载体在宿主细胞(通常用大肠杆 菌)中大量繁殖而获得该基因的足够量的拷贝，以便于进行基 因的结构和功能的分析，广义的基因克隆也包括任何使基因或 DNA片段扩增的操作 。
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1. 将基因定位于染色体 2. 特定区段 2. 候选基因筛选鉴定
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定位克隆的主要目的之一是将目标 基因定位于特定染色体上。
主要方法： 家系调查法 体细胞杂交法 核酸杂交技术 等等
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疾病基因分析
问
题
是否为遗传性状
如果为复杂性状，有无主基 因，为显性还是隐性
方
法
家系分析
分离分析
主基因如何定位
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DNA序列的分类
• 基因序列和非基因序列 基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束 的一段DNA序列，称为开放阅读框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。
• 编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。
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寻找新基因的方法
• 功能克隆 • 定位克隆 • 定位候选克隆 • 差异表达 • 生物信息学方法
通过ORF的预测 通过EST的拼接 • 基因芯片技术
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功能克隆
• 克隆（致病）基因的 一种策略。
疾病
性状 （疾病）
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
• 收集所要克隆的基因 的蛋白质产物及其功 能的信息，用以分离 基因，并对基因进行 定位。
绘制遗传连锁图的方法有很多，随着DNA多态性的开发， 使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态 性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随 机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)； 80年代后出现的有SSR(短串联重复序列，又称微卫 星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷 酸的多态性)分析。
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• 单一序列和重复序列 单一序列： 基因组中只有一份的DNA序列。
重复序列：基因组中重复出现的序列。例如， STR，SNP，微卫星DNA等。
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寻找基因
• 什么是基因？ • 基因在哪里？
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寻找基因的思路：
基因定位
将基因定位于染色体上
基因克隆 有大到小，由粗到细，精细定位
Hale Waihona Puke 基因分离克隆目的基因片段• 人类基因组：22条常染色体和X，Y染色 体的DNA组成。
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种类 大肠杆菌 啤酒酵母 线虫 果蝇 蝗虫 小鼠 豌豆 玉米 小麦 人
基因组大小
Mb
4.64
12.1
100
140
5000
3300
4800
5000
17000
- 3000
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C值悖论
• 生物体单倍体DNA总量称为 C值。
• 高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动， 所以，理论上应该是它们的C值也应该更高。 但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相 关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它 的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的 DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。
2. 将以通过DNA序列分析确定导
致疾病的分子缺陷。
3.
绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白
化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）
和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取
基因，并进一步研究其
功能。
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遗传标记， 染色体定位
mRNA cDNA
功能
蛋白质产物 生物学功能
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定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因在 染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基因 ， 进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。
基本思路是通过连锁分析原理进行基 因定位。
若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在向 子代传递时会发生自由分离 ，呈“连锁平衡”；反 之 ，则不发生自由分离 ，而呈现“共分离”现象 ，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某 一DNA标记相连锁的基因。
连锁分析
致病基因是否与DNA标记连 锁
参数分析
在患者同胞或亲属间是否存 在某些等位基因分布异常
等位基因共享法
基因的精细定位
多位点分析
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以家系为基础的连锁分析
人类基因定位与克隆
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1
定位的方法有体细胞杂交，家系连锁分 析，原位杂交，剂量效应法，染色体畸 变，限制性酶的精确分析等，其中前三 者用得较多。
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2
通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图 称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的 重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即 每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。
的这一策略。
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血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症 正常HbA四条多肽链（2条链，两条链）
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定位疾克病隆 疾病
• 利用遗传连锁或细胞学 定位技术将致病基因定
位于染色体的特定区带。
• 定位：通过连锁分析找
出与目的基因紧密连锁
的遗传标记在染色体上
的位置。
基因
• 克隆：从定位的染色体 序列
区段内分离克隆所要的 基因
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3
物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠 序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基 对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。
以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布 于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定 位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设 计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较 并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂 交，使每隔100kb就有一个标志；
染色体定 位
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从氨基列
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分析异常基因的产物（蛋白质），纯化蛋白质， 弄清它是如何引起临床症状的有两条不同的路线：
1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成 寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA或基因组中 筛选对应的编码基因；
二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数
百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的
YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的
DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为
高精度物理作图.
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基因组
• 基因组：生物细胞中单套染色体的所含 DNA序列的全部组成。