优化酿酒酵母中响应面法母产油脂条件

优化酿酒酵母中响应面法母产油脂条件
发表时间：2016-04-18T15:33:07.887Z 来源：《工程建设标准化》2015年12月供稿作者：林燕环
[导读] 漳州职业技术学院由于细菌的产量较低，因此目前的研究主要集中在藻类和真菌。

（漳州职业技术学院，福建，363000）
【摘要】本文主要针对酿酒酵母产油脂以及发酵条件优化进行分析研究，采用 Packet-Barman 设计对影响其产油脂相关因素进行评估，筛选出效应较为显著的因素：柠檬酸,CaCl2和初pH值。

运用Box-Betoken设计响应面的分析方法，经过优化后最终优质产率（干重）可以达到14.55%，种子培养基中的优质产率为4.76，与之前相比，是原来的3倍左右。

【关键词】酿酒酵母；油脂条件；响应面法；
引言
我们俗称的微生物油脂，通常是指某些微生物中所含有的酵母菌、藻类以及霉菌在细胞之内储存数量过大之后的脂肪酸甘油酯。

微生物细胞一般来说，只含有2%-3%的油脂，还是有少数的微生物中油脂含量可达七成以上，因此高含油脂量就使得微生物的油脂实际开发变成可能。

由于细菌的产量较低，因此目前的研究主要集中在藻类和真菌。

有关专家从产油脂角度出发深入研究，发现酵母中含油脂量较为丰富的是棕酵母、假丝酵母(Candida)、油脂酵母(Transcendentalism)等，这些酵母含油脂可以高达7成。

现阶段对酿酒酵母产油脂的相关研究极为稀少，因此对酿酒酵母的油脂产量进行深入研究具有重要的现实意义。

文章对酿酒酵母产油脂做了简单的分析，利用响应面法(RSM)对酿酒酵母的产油脂发酵条件进行了优化。

通过运用Packet-Barman设计、最陡爬坡实验以及Box-Betoken设计和RSM法得到酿酒酵母产油脂发酵培养基。

在这个实验的完成过程中，产生的相关数据以及结论是在Mini tab 15.0 统计软件的帮助下完成，并且得出最终的结论。

一、实验所需材料与方式方法
1．菌种
酿酒酵母YS58
2．培养基和培养的客观条件
种子培养基(YPD)
RSM 实验与Packet-Barman 实验培养条件：30°C、180 r/min。

3．油脂产量的简要分析
在实验的过程中，运用反复冻融和超声波破壁以及有机溶剂提取，三者结合实施操作流程。

依据实验设计将培养好之后的发酵菌液离心后水洗，经过重复冻融之后，放于超声波下面进行再次破壁，烘干后用研钵研成粉末状后分装试管，随后将三氯甲烷、甲醇的比例控制在2:1，加入试管当中，混匀后离心取三氯甲烷层，将三氯甲烷挥发之后就可以得到油脂，利用差重法计算油脂的产量。

油脂的计算方式为：油脂重/菌体干重×100%。

为了所得数据能够最大限度的贴近实际，多次重复取平均值，作为油脂得率。

二、结果
1．Packet-Barman 设计筛选影响产油脂因子
通过预实验明确每个因素的水平，运用Packet-Barman设计从9个影响因素中筛选较为明显影响的因素。

每种因素分别获取两个水平段，分别是高水平段与低水平段（表1、表2）。

对于上面得出的结果，我们采用Mini-tab 15.0 软件对其进行分析探讨，最后的研究结果显示，柠檬酸、初始 pH值与CaCl2是其中影响最大，并且效果最显著的因素。

经过综合考虑和对比之后，可以对这3个因素实行进一步的优化。

2．最陡爬坡实验
响应面拟合方程需要在考察的附近区域才会充分的体现出近似真实的情况，因此，在进行实验时，应该先逼近最大产油脂区域，然后
再建立较为有效的拟合方程。

所以，要根据Packet-Barman 法筛选出的显著因子效应大小设计它们的步长,随之进行最陡爬坡的实验，以期能够寻找到最大的产油脂区。

如果涉及到其它因素，可以选用实验中“1”和“−1”水平的平均值。

该实验的设计与结果在表3中有所体现：
实验中，主要运用Mini tab15.0软件对所得出的就结果进行分析，可以得出以下公式：Y (油脂产量) =14.34−0.28*A−0.02*B−0.08*C−2.45A2−1.46B2−1.46C2−0.45AB−0.35AC− 1.23BC。

针对上述得出的结果，我们进行了数据的方差分析（表6）。

我们从表6（1）的数据中可以发现，其中影响较为明显的是二次项的A*A，其次就是B*C、B*B、C*C。

另外从6（2）的图表中我们也能够发现回归方程已经为0.011，统计程度也比较明显，失拟项不小于0.05，证明回归方程的拟合度呈现比较好的趋势。

可以用该回归方程代替实验真实点，对于所得的数据结果进行简要的分析之后，再对系数做决定，为R 2 =94.56%，也就是回归方程中所有自变量的变化可以很好的对因变量94.56%的变化做出合理的解释，造成这种结果的主要原因是微生物油脂在提取的过程中，影响因素有很多，没有计入方程的变量和回归方程的变量之间，彼此之间也会发生交互作用；另一方面是因为在实验的过程中，具有一定的随机性，误差就在所难免。

根据回归方程公式来求得一阶偏导得出Y的极大值为：A =− 0.058，B = 0.030，C =−0.033，也就是当柠檬酸和CaCl2以及pH值的数据分别是0.471%、0.025%和 6.74，油脂的产量会达到最大14.34%。

在满足这个条件的前提下，模型预测值最终的实验结果是14.55%，与模型
的预测值基本符合，进一步的说明了进行这个实验的模型选择较为合理。

通过 Mini tab 15.0 软件对上述回归方程绘制响应面曲线如图1。

三、讨论
目前微生物油脂的相关方面研究的已成为热点，得到了各界的广泛关注。

不过，现在国内外的食品研究主要侧重的是高产油脂菌株，类似的高产油脂菌株的通常都在干重的20%以上，比如常见的研究对象有浅白色隐性酵母、粘红酵母等。

针对酿酒酵母来说，这方面的研究和数据相对较少，很少被作为主要研究的对象。

该实验主要是针对酿酒酵母的产油脂方面进行研究，得出酿酒酵母产油脂发酵的条件，即葡萄糖15%，蛋白胨 0.2%，酵母浸粉 0.4%，柠檬酸0.471%， MgSO4·7H2O 0.1%， ZnSO4·7H2O 0.2%，CaCl2 0.025%，FeSO4·7H2O 0.005%，初始的pH 6.74，180r/min，30℃，96h。

在这样的条件下，得到的产油脂量是14.55%，与原始产油脂量4.76%相比，约是3倍左右。

虽然该实验对于培养基方面的酿酒酵母油脂产量做了简要的论述，却还远远没有达到高产油脂微生物的研究标准。

倘若可以对发酵产油脂过程中的优质生物合成以及积累代谢调控中生物酶的特征和编码基因进行研究分析，合理运用基因工程手段使得高产油脂的酿酒酵母菌株成为可能。

与此同时，酿酒酵母油脂产量的高效和高产有利于基因工程菌生产生物柴油，这对于现在我国的生物技术发展具有重要意义，探索性更强，酿酒酵母的研究对其未来的发展具有一定的启发性。

参考文献：
[1]于志，王萌.灵芝硒多糖的研究进展与前景[J].安徽农学通报，2010，16（5）：71-73.
[2]刘振锋，东方，季宇彬等.硒多糖药理活性研究进展.北京联合大学学报（自然科学版），2011，25（4）：36-40.
[3]李慧颖，张月清，马晓燕等.响应面法优化普鲁兰多糖发酵培养基[J].食品科学，2012，3（17）：221-224.
[4]孙会强，周赛男，谭周进，等. 一株烟草内生拮抗放线菌发酵条件优化[J]. 应用与环境生物学报，2011，17（6）：914-917.
[5]张文芝，郭坚华. 微生物发酵工艺优化研究进展[J]. 广东农业科学， 2013，40（6）： 114-117.。