丙酮沉淀与盐析
盐析沉淀蛋白质时
收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色
蛋白质的分离与纯化方法
分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）
最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作 用下从溶液中沉降下来。
沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。
v s = ————
ω2x
v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶
1. 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称 为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色 红色
N 胍基
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反 应)
茚三酮反应
碱性CuSO4及磷钨 酸-钼酸 茚三酮
蓝色 蓝色
酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyrห้องสมุดไป่ตู้
蛋白沉淀方法
蛋白沉淀方法蛋白沉淀是蛋白质分离与纯化的一种常用方法，通过加入化学物质使目标蛋白质与其它蛋白质或者杂质分离，并沉淀于溶液底部或者浮于溶液表面。
本文将从蛋白沉淀的原理、化学物质的选择、实验操作、蛋白沉淀后处理等方面进行介绍。
一、蛋白沉淀的原理蛋白质的沉淀是基于化学物质与蛋白质之间的物理或者化学相互作用，包括：1. 盐析沉淀在高浓度盐溶液中，蛋白质远离其同样带电的水分子，而形成大分子团聚，从而沉淀。
在酸性环境下，大多数蛋白质通过质子化而失去电荷，降低了疏水性，从而沉淀。
在碱性环境下，蛋白质通常解离出一个氨基酸残基的羧基，从而带有负电荷，易于被阳离子与之形成沉淀。
4. 有机溶剂沉淀如乙醇、丙酮、甲醇等，可与蛋白质形成复合物，使其聚合而沉淀。
以上几种原理可单独或结合使用，根据情况进行选择。
二、化学物质的选择常用的盐类有氯化铵、硫酸铵、硫酸钠等。
浓度通常在10-60%之间，具体浓度根据具体实验条件进行选择。
2. 酸类常用的酸包括二元酸、有机酸等。
浓度为0.1-1M之间，酸性度通常为pH 4-6。
3. 碱类常用的有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇等。
浓度通常为50-90%之间，根据实验要求进行选择。
三、实验操作1. 样品制备待分离的蛋白质必须经过预处理，通常包括离心、裂解、过滤等步骤。
裂解方式可以使用生理盐水、水、甲醇等，使蛋白质从细胞中释放出来。
过滤可以使用滤纸、滤膜、分子筛等方式，去除杂质。
2. 化学物质的加入将选择好的化学物质加入样品中，此时需注意化学物质前后也要进行科学操作，如一些电解质类物质可能带有杂质，需要先进行过滤；有机溶剂可能会引起蛋白质的变性，需加入适量的缓冲液进行保护。
将混合物小心地混合均匀后，离心使混合物分层，此时目标蛋白沉在沉淀层，上清液中还有一些蛋白，需要将其过滤或沉淀以去除杂质。
4. 纯化将沉淀分解，得到的产物通过离心、层析等步骤进行纯化，最终得到目标蛋白。
沉淀后需要进行洗涤，以去除杂质，保证目标蛋白的纯度和酶效。
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法有以下几种：
1.盐析法
在蛋白质溶液中加入大量的硫酸饺、硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质的水化膜和中和电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。
2.等电点沉淀
等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法
3.有机溶剂沉淀
有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法称有机溶剂分段沉淀法。
常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
4.重金属盐沉淀法
其原理是重金属盐可与蛋白质形成不溶于水的蛋白盐沉淀，从达到沉淀蛋白质的目的。
5.生物碱试剂/酸沉淀
蛋白质又可与生物碱试剂以及某些酸结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。
沉淀技术(1)
盐析操作(加盐方式）
硫酸铵的加入有以下几种方法：
1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情
况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大
的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两 种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋 白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和 电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。
一、概述
沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设 备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过 程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质 和酶时最常用的方法。
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高
缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选
择性不强
二、蛋白质的表面性质
在水溶液中，多肽链中 的疏水性氨基酸残基具 有向内部折叠的趋势， 但仍有部分疏水性氨基 酸残基暴露在外表面， 形成疏水区。 亲水性氨基酸残基基本 分布在蛋白质立体结构 的外表面。
60
80
100
硫酸铵盐析过程 最适饱和度是30%，55%
分段盐析法分离酵母醇脱氢酶
过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白后，然后进行分段盐析
分段盐析法分离酵母醇脱氢酶
丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.94倍．
分段盐析中饱和度在50％～55％区段中析出的组分与粗 酶相比其比活上升9.62倍，
Ch4 沉淀法(Pricipitation)2
3、 高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象 ， 、 高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象， 还不能很好地从理论上来解释。 还不能很好地从理论上来解释。 Cohn经验方程式： 经验方程式： 经验方程式
Lgs=β-Ks ×I（µ、m） （ 、 ） β=lgS0 I=
1 2
∑ ciZi
2
4、β的物理意义 、 的物理意义 的物理意义: Ks盐析常数的物理意义 盐析常数的物理意义: 盐析常数的物理意义
第二节
盐析法
一、中性盐盐析法
盐析法（ （一）盐析法（Salting-out）的概念和基本原理： ）的概念和基本原理： 1、概念： 、概念： 2、基本原理 （P41） 、 ）
从以上分析可知， 从以上分析可知，在蛋白质溶液中加入中性 盐后会压缩扩散双电层， 电位， 盐后会压缩扩散双电层，降低ζ电位，即中性 盐既会使蛋白质脱水， 盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去， 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布 朗运动的互相碰撞下， 朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚 集物而沉淀析出。 集物而沉淀析出。
二、等电点沉淀法 (一)等电点沉淀的概念: 等电点沉淀的概念:
（二）操作条件： 操作条件： 离子强度低， 离子强度低 ， pH≈pI（ 略小于 在中性盐 （ 略小于pI在中性盐 存在下） 用无机酸（ 存在下 ） ， 用无机酸 （ HCl、H2SO4 、 H3PO4 等 ） 、 调节pH 调节
由于在等电点附近， 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 因此等电点沉淀法通常与盐析、 因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀 法联合使用 操作时的注意事项： 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点 ）由于无机离子的影响， 通常会发生“漂移” 通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 高 低 （2）溶质的稳定性 ） （3）盐析效应 ）
13种蛋白质的浓缩方法及应用过程
13种蛋白质的浓缩方法及应用过程1、丙酮沉淀法：三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。
2、免疫沉淀法：得有特异性抗体3、硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出(盐析)，选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济，大多数的蛋白都可以用资格方法4、聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性!他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀!5、离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩。
6、透析袋浓缩法：利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。
将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替)，结扎，把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。
也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。
吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。
主要用于更换蛋白质的缓冲液，得有透析袋。
不需要特殊的仪器。
一般用得是PEG20000进行实验，简单，快速，对蛋白没什么影响7、冷冻干燥浓缩法：这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。
它是在冰冻状态下直接升华去除水分。
具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等)。
密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。
数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。
干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。
也可采用冻干机进行冷冻干燥。
8、吹干浓缩法：将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。
此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15 ℃。
9、超滤膜浓缩法：此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。
有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。
沉淀生成和溶解的原理
沉淀生成和溶解的原理
利用与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀
影响因素
1、有机溶剂的挑选在实际生产中，常用的有机溶剂存有乙醇、丙酮、异丙醇、乙醚等。
丙酮的介电常数大，结晶能力弱；而乙醇无污染，广为应用于药品生产中。
2、温度的控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的控制指标。
根据沉淀对象不同，采用的温度不同，为防止生物大分子在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行，同时还要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象。
3、ph值等电点时，蛋白质的溶解度最高。
在有机溶剂结晶时，应当挑选ph值在等电点附近，但是ph值的掌控还必须考量目的药物的稳定性条件，通常生产中常用缓冲液去掌控溶液的ph值。
4、离子强度在有机溶剂和水的混合液中离子强度是一个特别重要的因素。
因为盐在一定的浓度范围内能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，使有机溶剂沉淀收率降低，因此当采用盐析沉淀法得到蛋白质或酶后，如需进一步用有机溶剂沉淀法纯化，一定要先透析除盐。
蛋白质的沉淀反应实验报告
蛋白质的沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握几种常用的使蛋白质沉淀的方法。
2、理解蛋白质沉淀的原理和应用。
二、实验原理蛋白质是一种大分子化合物，在溶液中以胶体状态存在。
当溶液条件发生改变时，蛋白质的胶体稳定性被破坏，从而发生沉淀。
常见的使蛋白质沉淀的方法有以下几种：1、盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性盐（如硫酸铵、氯化钠等），破坏蛋白质的水化膜和电荷，使其溶解度降低而沉淀。
2、有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂（如乙醇、丙酮等），降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质沉淀。
3、重金属盐沉淀法：重金属离子（如汞离子、铅离子等）与蛋白质分子中的巯基等基团结合，使蛋白质变性沉淀。
4、生物碱试剂沉淀法：生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸等）能与蛋白质分子中的碱性基团结合，生成不溶性盐而沉淀。
三、实验材料和仪器1、材料鸡蛋白溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清用蒸馏水稀释 10 倍。
10%硫酸铵溶液、饱和硫酸铵溶液、3%硝酸银溶液、01mol/L 硫酸铜溶液、5%三氯乙酸溶液、95%乙醇、1%醋酸铅溶液、10%氢氧化钠溶液、1%醋酸溶液、苦味酸饱和溶液、鞣酸饱和溶液。
2、仪器试管、试管架、滴管、玻璃棒、离心机。
四、实验步骤1、盐析法取两支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向其中一支试管中逐滴加入 10%硫酸铵溶液，边加边振荡，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况。
向另一支试管中加入 2mL 饱和硫酸铵溶液，振荡均匀。
静置一段时间后，观察沉淀现象。
2、有机溶剂沉淀法取两支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向其中一支试管中逐滴加入 95%乙醇，边加边振荡，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况。
向另一支试管中加入 2mL 丙酮，振荡均匀。
静置一段时间后，观察沉淀现象。
3、重金属盐沉淀法取三支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向第一支试管中滴加 3%硝酸银溶液 2~3 滴，振荡均匀，观察沉淀的生成情况。
蛋白质的沉淀方法
蛋白质的沉淀方法嘿，你问蛋白质的沉淀方法啊？那咱就来聊聊。
蛋白质的沉淀方法有好几种呢。
一种是盐析法，这就像给蛋白质加点“调料”让它沉淀下来。
你往蛋白质溶液里加点盐，比如氯化钠啥的，蛋白质就可能会因为盐的作用，溶解度降低，然后就从溶液里跑出来沉淀啦。
就好像你在水里放了太多糖，糖就会析出来一样。
不过盐的浓度要控制好哦，太浓或太淡可能效果都不好。
还有一种是有机溶剂沉淀法。
像乙醇、丙酮这些有机溶剂，它们能让蛋白质失去水膜，变得不稳定，从而沉淀下来。
这就好比蛋白质本来在一个舒适的“小水床”上，有机溶剂一来，就把“水床”抽走了，蛋白质就待不住啦。
但是用这种方法的时候要注意有机溶剂的量和温度，不然可能会影响蛋白质的活性哦。
另外，还有重金属盐沉淀法。
一些重金属离子，比如铅离子、汞离子等，能和蛋白质结合形成不溶性的复合物沉淀下来。
不过这种方法可不能随便用在食品或者生物制品里哦，因为重金属有毒嘛。
就像你不能给小朋友吃有毒的糖果一样。
酸碱沉淀法也可以。
调节溶液的酸碱度，让蛋白质在酸性或碱性条件下沉淀。
当溶液的pH值不合适的时候，蛋白质就会“闹脾气”，不愿意待在溶液里了，就会沉淀出来。
但也要注意别把pH值调得太过分，不然会把蛋白质“伤”得太厉害。
我给你讲个事儿吧。
我有个朋友在实验室做蛋白质提取的实验，他一开始想用盐析法沉淀蛋白质，但是盐加得太多了，结果蛋白质虽然沉淀了，但是活性也受到了很大影响。
后来他重新调整了盐的浓度，就顺利地得到了想要的蛋白质沉淀。
所以啊，用这些方法沉淀蛋白质的时候，要注意各种条件，小心操作，才能得到好的结果哦。
丙酮和水的分离概述
丙酮和水的分离概述1. 引言丙酮和水是常见的化学物质，在实验室中广泛应用于溶剂、反应物和反应产物的提取、分离和纯化过程中。
丙酮和水的分离对于实验室工作和工业生产都具有重要意义。
本文将概述丙酮和水的分离方法和原理。
2. 分离方法2.1 蒸馏法蒸馏法是丙酮和水分离最常用的方法之一。
由于丙酮和水的沸点差异较大，利用蒸馏原理可以有效地分离它们。
在实验室中，通常使用简单蒸馏或者真空蒸馏来进行丙酮和水的分离。
简单蒸馏适用于分离沸点差异较大的液体混合物，而真空蒸馏则适用于分离沸点接近的液体混合物。
2.2 盐析法盐析法是一种利用添加盐类使溶液中产生沉淀从而分离溶质的方法。
对于丙酮和水的分离，可以向溶液中加入适量的不溶于丙酮中的盐类，使得丙酮和水在饱和盐溶液中分别形成两个相，从而利用相的分离来实现丙酮和水的分离。
2.3 萃取法萃取法是利用不同溶剂对混合溶液中溶质的溶解能力差异来进行分离的方法。
对于丙酮和水的分离，可以选择一个适合溶解丙酮但对水溶解性较弱的有机溶剂，如乙醚或氯仿，与混合溶液进行充分混合后分层，然后将有机相和水相分离。
2.4 过滤法过滤法是一种常用的物理分离方法，适用于分离固体颗粒和液体的混合物。
如果丙酮和水混合物中有悬浮颗粒，可以通过过滤来分离固体颗粒和溶液。
在实验室中通常使用滤纸、玻璃纤维滤膜等进行过滤操作。
3. 分离原理3.1 蒸馏法的原理蒸馏法实现丙酮和水的分离是基于它们的沸点差异。
在加热的条件下，丙酮会先汽化，生成蒸汽进入冷凝器，然后冷凝成液体，最后收集到受冷却的容器中。
而水则会留在原容器中。
通过这种方式，丙酮和水被有效地分离开来。
3.2 盐析法的原理盐析法实现丙酮和水的分离是基于盐类在溶液中的溶解度差异。
通过添加不溶于丙酮中的盐类，可以使丙酮和水分别形成两个相，从而实现分离。
这是因为盐类的存在改变了丙酮和水的溶解度，使得它们在盐溶液中的相互溶解性发生变化。
3.3 萃取法的原理萃取法实现丙酮和水的分离是基于有机溶剂对丙酮和水的溶解能力差异。
生物化学实验技术(2)常用分离技术
二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子， 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基 有敏感作用，使用前必须用H 处理： 有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓 溶液，通入H 饱和，放置过夜， 溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离 浓缩结晶，100℃烘干后使用 烘干后使用。 子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 ），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH 右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
第三节 其他沉淀法一．Fra bibliotek电点沉淀法 二．生成盐复合物沉淀法 三． 选择性变性沉淀 四．非离子多聚物沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低， 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 值。 等电点法常与盐析法、 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。 合使用，以提高其沉淀能力。
使用硫酸铵时： 使用硫酸铵时：
1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种， ）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有 ℃或室温两种， 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种 ）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（ 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或 ）盐析后一般放置半小时至一小时， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫 酸铵密度较大， 酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
蛋白浓缩方法
请教：蛋白浓缩方法请教各位高手，我想将细胞培养上清中的蛋白浓缩10倍，但要确保最小的蛋白变性与蛋白丢失，应该采用什么方法比较好？请不吝赐教，谢谢！可以用：超虑；盐析；过离子柱等等，看你的试验条件定咯蛋白浓缩方法基本有：丙酮沉淀法；免疫沉淀法；三氯醋酸沉淀法；硫酸铵沉淀法；（低温）有机溶剂沉淀法；聚乙二醇沉淀法；超滤法；透析法；离子交换层析和冷冻干燥法……1，丙酮沉淀法；三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。
2，免疫沉淀法：得有特异性抗体！3，硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析）选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济！4，（低温）有机溶剂沉淀法：强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg2+离子，pH值5，聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀！6，超滤法：主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法更不易引起变性！不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的！7，透析法：主要用于更换蛋白质的缓冲液！的有透析袋！不需要特殊的仪器！8，离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩！9，冷冻干燥法：在冷冻状态下让扬品种的液体升华具体你的实验应该是做一种分泌蛋白吧？浓缩后要干什么，需要活性蛋白么？实验室设备如何，导师经费如何？这些都要考虑！！我用的是硫酸铵沉淀法，物廉价美。
用4度饱和硫酸铵等体积加入收集的上清中，以30000g的速度离心30分钟，弃上清，加入你所需体积的缓冲液体，在震荡器上使沉淀溶解，再在10000g下离心10分钟取上清分装保存于-80度即可关于蛋白浓缩，我认为最好的方法是真空冷冻干燥法，此法简便，蛋白质几乎无变性。
lhydy wrote:请教各位高手，我想将细胞培养上清中的蛋白浓缩10倍，但要确保最小的蛋白变性与蛋白丢失，应该采用什么方法比较好？请不吝赐教，谢谢！不知你何种用途，最简单的浓缩我们常用蔗糖或PEG包埋。
有机溶剂及有机酸沉淀蛋白质的原理
有机溶剂及有机酸沉淀蛋白质的原理文章出处：朱敏有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。
有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。
分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。
操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。
有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。
一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂, 而且可能导致沉淀不好. 沉淀的条件一经确定, 就必须严格控制, 才能得到重复性结果. 有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。
其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。
某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。
在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。
根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。
因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。
分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。
发展的新方法。
它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。
此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。
利用分子形状和大小不同的分离方法蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。
盐析的原理
盐析的原理
盐析是一种利用离子间吸引力进行沉淀实验的方法。
其原理是通过加入一种能够与溶液中存在的离子反应生成固体沉淀物的反应物，从而使溶液中的离子形成可见的固体沉淀。
该方法常用于检测和分离溶液中的离子。
盐析方法的主要步骤如下：
1. 首先，将待检测的溶液加入到一个容器中。
2. 接下来，选择一种能与溶液中的离子反应生成固体沉淀物的反应物，通常是一种盐酸或硫酸盐。
3. 将反应物加入到溶液中，并充分搅拌或搅动溶液，以促进离子的反应和沉淀物的形成。
4. 当溶液中的离子与反应物反应生成固体沉淀物时，沉淀物会逐渐聚集并沉淀到溶液的底部。
5. 后续可以通过离心或过滤等方法将沉淀物与溶液分离。
可以使用化学方法或仪器进行沉淀物的进一步分析和鉴定。
盐析方法可以用于检测和分离不同离子，例如钠离子、钾离子、铜离子等。
其基本原理是根据离子之间的反应性差异进行选择性沉淀。
由于不同离子的反应性不同，盐析方法可以通过选择合适的反应物，将目标离子从溶液中沉淀出来，并通过沉淀物的形貌、颜色等特征进行识别和检测。
总之，盐析方法通过利用离子之间的反应生成固体沉淀物的特性，实现了对溶液中离子的检测和分离。
这种方法简单、快捷，并且可以用于各种离子的分析和鉴定。
尿激酶提取方法与技术
尿激酶提取方法与技术1. 尿激酶（urokinase，UK）是一种重要的蛋白酶，可以分解血栓和胶原等纤维蛋白聚集物。
该酶在医学领域中使用广泛，被认为是治疗心肌梗死、肺动脉栓塞和脑血栓等疾病的重要药物。
2. 尿激酶可以从多种来源中提取，包括尿液、细胞培养液和动物组织。
尿液提取方法最为常见，也是最为简便的一种方法。
3. 尿激酶的提取需要注意保持样品的完整性和纯度。
在样品处理过程中，需要避免过度振荡、过滤、离心等操作，以减少对尿激酶的损伤和分解。
4. 在尿液提取过程中，可以采用丙酮盐析法、硫酸铵沉淀法、交换层析法等不同的方法。
丙酮盐析法最为常用。
5. 丙酮盐析法的原理是利用尿激酶在高浓度丙酮中的不溶性，使其沉淀出来。
该方法简便易行，但是可能对尿激酶的特异性和纯度造成影响，因此需要谨慎使用。
6. 硫酸铵沉淀法的原理是利用硫酸铵的高饱和度，在其逐渐加入样品中后，尿激酶会逐渐沉淀出来。
该方法具有较高的纯度和特异性，但是要求对硫酸铵的加入速度和温度等有一定的控制。
7. 交换层析法的原理是利用离子交换树脂的亲和性选择性地将尿激酶捕获和分离。
该方法可分为阳离子交换层析法和阴离子交换层析法两种不同的操作方式。
8. 尿激酶的鉴定和纯化可以采用多种方法，如Western Blotting、SDS-PAGE和透析等。
Western Blotting方法是目前最为常用的鉴定方法，可以对样品进行快速和准确的鉴定。
9. 在样品存储过程中，尿激酶容易失活和降解。
在提取和鉴定过程中，需要保持样品的低温和干燥，以及避免光照和冻融循环等操作。
10. 在尿激酶的提取方法和技术的选择中，需要根据具体的实验目的和样品特点进行选择和优化，以获得高质量和高纯度的尿激酶。
对比不同方法和技术的优缺点，可以选择最为合适的方案，使实验取得最佳效果。
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Homology (同源性)
Primary structure and homology
Homologous(同源的)： proteins with similar AA sequences and functions are said to be homologous Homologous proteins from different species imply their evolutionary relatedness
O2-binding activity of Mb and Hb
O2-saturation curve of Mb and Hb
Mb: high affinity for O2
a simple hyperbolic curve
(直角双曲线)
Mb和Hb的氧饱和曲线
Hb: low affinity for O2 when [O2] is low
The primary structure of a protein:
determines its spatial structure is related with evolution of living things has a role in its bioactivity
Importance of primary structure in organism evolution
Hemoglobin (Hb) 血红蛋白
Hb: tetramer(四聚体), 4 subunits, α2β2 One Hb contains four heme groups Quaternary structure 具有四级结构
Hb: eight salt bonds link the 4 subunits to make Hb tightly form hydrophilic(亲水的) globular Байду номын сангаасrotein
Myoglobin (Mb) and Hemoglobin (Hb)
肌红蛋白与血红蛋白
Paradigms of protein structure and function Both are typical globular proteins 球状蛋白 Both are conjugated(偶联) with heme (血红素)
Mb and Hb
The β-subunit of Hb has tertiary structure very similar to that of Mb
Similarity: O2-binding activity Difference: Mb--storage of O2
Hb--transport of O2
Sickle-cell anemia cause 镰刀型贫血
The changes of key amino acids in its sequence result in function alteration of a protein
What is a relationship between the spatial structure of a protein and its function ?
Mb
Hb
Heme 血红素
Heme: Fe++ binds to protoporphyrin 原卟啉
His F8
Fe2+ and O2-binding
Fe2+ binds O2 reversibly (可逆)
Fe3+ does not bind O2 One heme binds one O2
molecule
Heme and Mb
Mb: one peptide with eight relatively straight segments of α-helix (A～H), with tertiary structure
The flat heme group rests in a hydrophobic pocket (疏水口袋) of Mb
大猩猩
长臂猿 猕猴
鼠
The phylogenetic tree (种系发生树)
根据细胞色素C序列的物 种差异建立的进化树:
分支顶端: 现存物种
沿分支线的数字表示物 种和潜在(假设)的祖先之 间的氨基酸变化
Primary structure related to its function 一级结构与功能的关系
Section III
Relevance of protein structure and function
(蛋白质结构与功能的关系)
The primary structure determines the spatial structure
All of the information necessary for folding the peptide chain into its native structure is contained in the AA sequence of the peptide
Relax state (R state): The binding of O2 to one Hb subunit in the T state triggers a change in conformation to the R state Some of the ion pairs that stabilize the T state are broken and some new ones are formed
The functions of a protein depend on its spatial structure
The native conformation of a protein is essential for its function
Biological activity will be lost when the spatial structure is destroyed
S-shaped curve (S形曲线)
How is the S-shaped curve of Hb formed?
Tense state (T state): subunits tightly bound with 8 salt
bonds
affinity of each subunit to O2 is lower