第六章 酶分子的化学修饰

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IFN-α2a and 40 kDa (PEG)–IFN-α2a的药代动力学
蛋白类药物修饰后的半衰期及稳定性
酶 半衰期 相对稳定 性 1 70 140 240 350
天然SOD 右旋糖酐-SOD Ficoll(低分子量)–SOD Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
1 )修饰度和均一性的分析测定 氨基修饰率：TNBS(三硝基苯磺酸）法 和荧光胺法 均一性：SDS-PAGE
2)修饰蛋白理化性质的测定
生物活性 稳定性 抗原性
第五节 化学修饰对酶性质的影响
1.稳定性增强 修饰剂分子存在的多个反应基团，常与 酶形成多点连接。 2.免疫原性和免疫反应性的减弱或消除
大分子修饰剂遮盖了了酶分子的抗原决 定簇。
酰基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。
氧化剂：H2O2
可被氧化的侧链基团:巯基，甲硫基，等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 Lys Asp、Glu Arg Cys 侧链基团 氨基 羧基 胍基 巯基 二硫键 修饰剂 三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙 酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 水溶性碳化二亚胺 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基乙醇、DTT
③反应的程度能用简单的技术测定 ；
④ 标记的残基稳定、易通过降解分离进行 鉴定。
三、反应条件的确定 1.pH
决定了具有潜在反应能力的功能基所处 的可反应和不可反应的离子状态。 2. 修饰反应的温度和时间
① 决定了反应的的修饰度 ② 影响反应的专一性 3.酶与修饰剂的比例 控制修饰度。
四、修饰效果评价
蛋白质药物在使用中出现的问题
C
理想浓 度 实际浓度
1.迅速被体内酶降解
2.肾小球过滤清除 3.抗原－抗体反应
4.溶解度差导致沉淀
T
各类蛋白类药物的体内半衰期及注射次数 protein
α-IFN β-IFN HGH EPO G-CSF GM-CSF
Half life vivBiblioteka Baidu(h) 5.6 0.6 0.3 6 5 2
②引入新的辅因子或对辅助因子进行修饰。 例：黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，从 而将蛋白酶转变成氧化原酶。 修饰辅助因子，可创造出多种多样的新 酶。
2.金属酶中的金属取代 酶分子中的金属取代可以改变酶的专一 性、稳定性及其抑制作用。 例：酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌 被钴取代后，酶的底物专一性和最适 pH 都有改变。
胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亚砜，该酶 对含芳香族或大体积脂肪族的专一性底 物的Km提高2-3倍。
（三） 蛋白质主链的修饰 依靠酶法，水解部分酶片断。 天冬氨酸酶有限水解切去 10 个氨基酸后， 酶活提高5.5倍
（四） 与辅因子相关的修饰 1．依赖辅助因子的酶 ① 辅因子共价结合在酶上； NADH 共价结合到醇脱氢酶，活力为原 来的 40%, 但解决了辅因子循环利用的问 题。
3.体内半衰期延长
经修饰后，分子量增大，免疫原性及抗 原性降低或消除，增强了抗蛋白水解酶、 抗抑制剂和失活因子的能力。
4.最适pH及米氏常数等酶学性质发生一定 变化
米氏常数一般增大。
重点： 化学修饰的意义； 大分子化学修饰的方法，了解其基本过 程； 大分子化学修饰对酶学性质的影响。
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1.PEG（Polyethylene Glycol）简介： ① 具有两亲性; ② 无毒，免疫原性低;
H(-O-CH-CH)n-OH
③ 分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地 大; 修饰剂一般为500～20000 ④ 可以将它的许多优良性质 : 如亲水性，柔性、 抗凝血性、抗巨噬细吞噬性等，赋予修饰后的生 物分子。
使用双功能或多功能试剂将酶蛋白分子
之间、亚基之间或分子内不同肽链部分
间进行共价交联。 （四）固定化修饰
例：
枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体，其酶活提高13倍。
葡聚糖二乙醛交联青霉素 G 酰化酶， 55℃下的
半衰期提高9倍。
丝氨酸氨白酶、胰蛋白酶通过交联修饰，最适
温度从45℃提高到76℃。
小分子修饰：稳定性增加及一定催化特 性的改变。 大分子修饰：稳定性增加；提高在非水 相中的催化能力；免疫原性与抗原性降 低、延长半衰期。 交联修饰：提高其稳定性，增加酶在非 水溶液中的使用价值。
二、酶分子的内部修饰 （一）催化活性基团的修饰 产生新的催化能力 硫代烷基化反应，枯草杆菌蛋白酶活性部位的 Ser转化为半胱氨酸，对肽或酯无水解能力，但 能水解硝基苯酯。 化学突变：将一种氨基酸侧链化学转化为另一
种新的氨基酸侧链的方法。
（二）非催化活性基团的修饰 改变酶的动力学特征、影响酶的专一性。
3.羧基端的修饰 mPEG-酰肼或mPEG-胺
mPEG-酰肼与羧基的偶联
枝形PEG
单链叉形PEG 多链叉形PEG
产品号 mPEG-OH5 mPEG-OH10 mPEG-OH20 mPEG-COOH5 mPEGCOOH10 mPEGCOOH20
末端基团 -OH -OH -OH -COOH -COOH -COOH
MPEG-NHS5
-N-羟基琥珀酰亚胺
5K
MPEG-NHS10
-N-羟基琥珀酰亚胺
10K
MPEG-NHS20
-N-羟基琥珀酰亚胺
20K
第四节 酶化学修饰的基本要求
一、被修饰酶的性质 1．酶的稳定性
修饰反应条件的确定。
2. 酶活性中心的状况
3．酶侧链基团的性质及反应性。
用于选择修饰剂。
二、修饰剂的选择 ① 较高的选择性； ② 温和的反应条件；
N-乙基马来酰亚胺(NEM)：反应专一性很强的 疏基修饰剂，反应产物在300 nm处有最大吸收。
二、氨基的化学修饰 烷基化试剂： 碘代乙酸 三硝基苯磺酸（ TNBS ）：与赖氨酸残基反应， 420nm，367nm能产生特定的光吸收。 磷酸毗哆醛 (PLP) 是一种非常专一的赖氨酸修 饰试剂，反应可通过325nm处光吸收定量。
2,4- 二硝基氟苯（ DNFB ）法 ( 又称 sanger 试剂)；
丹磺酞氯(DNS)法； 苯异硫氰酸酯(PITC)法。 用于多肽链 N- 末端残基的测定的化学修 饰方法。
三、羧基的化学修饰 水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基 已成为最普通的标准方法， 在一定条件下，丝氨酸、半胱氨酸和酪 氨酸也可以反应。
第二节 酶蛋白侧链的小分子修饰
一、巯基的化学修饰
烷基化试剂：有卤代乙酸、芳香卤、芳香族磺 酸。常用的有碘代乙酸和碘乙酰胺、巯基乙醇。
有机汞试剂：对氯汞苯甲酸(pCMB) 专一性最 强，修饰产物在250nm处有最大吸收。
5 ， 5’- 二硫代 - 双（ 2- 硝基苯甲酸）（ DTNB ） (Ellman 试剂) ，反应生成的阴离子在412nm处 有最大吸收。定量酶分子中巯基数目最常用的 试剂。
NHCH2COOH 后，稳定性在60℃可提高 1000 倍。
马肝醇脱氢酶的赖氨酸的乙基化、糖基化和甲
基化都能增加其活力，同时酶稳定性也提高许
多，底物专一性也有所改变。
（二）大分子修饰
可溶性大分子：如聚乙二醇(PEG)、聚乙
烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、
聚氨基酸、右旋糖苷、环糊精、肝素等。
第五章 酶分子的化学修饰
化学修饰
共价修饰 酶的修饰
非共价修饰 遗传修饰
从广义上说，凡通过化学基团的引入或除
去，都可称为酶的化学修饰。
酶的化学修饰：在体外将酶分子通过人
工方法与一些化学基团进行共价连接，
从而改变酶的结构和性质。
意义： 1.基础酶学的研究； 活性部位的研究 一级结构的测定 测定酶分子中某种氨基酸的数量。 结构与功能的关系
八、胍基的化学修饰 常用丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛。 4-羟基-3-硝基苯乙二醛（405nm） 对硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性 质，并且产物具有旋光性，特别适合于 精氨酸的定量。
化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的
亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
四、咪唑基的化学修饰 焦碳酸二乙酯 (DPC) 和碘代乙酸。 DPC 对组氨酸残基有较好的专一性，产物在 240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。
DPC 还可能修饰巯基，用连四硫酸钠或 连四硫酸钾对巯基进行可逆地保护。
五、吲哚基的化学修饰 N- 溴代琥珀酰亚胺 (NBS) ：产物可通过 280 nm处光吸收的减少跟踪反应。
分子量 5K 10K 20K 5K 10K 20K
包装（g） 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10 5 100 10 5 100 10 5
价格（￥） 3500 700 7000 1400 7000 1400 10000 2000 15000 3000 20000 4000 20000 4000 2000 30000 6000 3000 35000 7000 3500
2- 羟基 -5- 硝基苄溴 (HNBB) 和 4- 硝基苯硫 氯对吲哚基修饰比较专一。但易与巯基 作用，修饰时应对巯基进行保护。
六、二硫键的化学修饰 二硫苏糖醇（DTT） 巯基乙醇
七、酚基的化学修饰 四硝基甲烷（ TNM ）：最常用的具高度 专一性酪氨酸残基的修饰剂。 苏氨酸和丝氨酸残基：一般都可被修饰 酚羟基的修饰试剂所修饰； 二异丙基氟磷酸（ DFP ）对丝氨酸有高 度反应性。
2.提高生物活性； 3.增强稳定性； 4.产生新的催化能力; 5.解除免疫原性；
第一节酶分子的修饰方法
一、酶的表面修饰 酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巯基、 羟基、咪唑基等 （一）小分子修饰： 常用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖、
乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸 -N丁二酯亚胺酯等
例：
α -胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰一
第二代PEG衍生物
1. N-末端氨基修饰 PEG-醛
蛋白质 N 端 α 氨基的 pKa 为 7.6~8.0，而分子内赖氨 酸的 ε-氨基的 pKa 为 10.0~10.2
mPEG-醛与 N端氨基的偶联
2.疏基修饰 ①PEG-马来酰亚胺；②PEG -乙烯基砜； ③PEG -碘乙酰胺；④PEG -吡啶-二硫醚。
为避免在修饰过程中发生交联和团聚， 通常采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)作 为修饰剂。
CH3(-O-CH-CH)n-OH
2.PEG的活化
1 )三氯均嗪法
MPEG1
均三嗪，三聚氯氰
MPEG2
消化酶作用下的过氧化氢酶的活性保留
第一代PEG衍生物：
线性PEG，分子量一般较小（<12kD）； 反应选择性低，产物为为非均一的混合 物； 修饰后蛋白药物的抗原性和半衰期改进 效果不明显； 容易引发蛋白质的交联与团聚； 衍生物与药物反应形成的连接键稳定性 不高。
His
Tyr Trp
咪唑基
酚羟基 吲哚基
焦碳酸二乙酯、碘乙酸
碘、四硝基甲烷 N-溴代琥珀酰亚胺
第三节 酶蛋白侧链的大分子修饰
常用修饰剂：聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、环 糊精、蔗糖聚合物(Ficoll)、肝素、聚乙烯吡咯 烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、
等。
活化：修饰剂的活化，即制备修饰剂衍生物。 偶联：与酶蛋白偶联反应。
可作用基团：
氨基（ Lys， Arg），巯基（ Cys），羧基（ Asp、 Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰
胺等。
烷基化反应
2) 酰基化反应
试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基 团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（ Ser 、 Thr ），酚羟 基（Tyr）
例：
PEG修饰的 L- 天冬酰胺酶免疫原性显著降低、
半衰期延长。
天然过氧化氢酶在 6h 内很快从血液中被去， PEG修饰后，酶活力在血液循环中可保持72h 右旋糖苷修饰α-淀粉酶：60℃,t1/2：3.5min；修 饰后：175 min
MPEG 修饰过氧化氢酶，三氯乙烷中酶活是原
来的200倍。
（三）交联修饰