紫杉醇资源开发研究

紫杉醇资源开发研究α高锦明1)　王性炎2)　张鞍灵1)(1)西北林学院基础课部,712100陕西杨陵;2)西北林学院园林系;第一作者:男,33岁,讲师)摘　要　紫杉醇是迄今公认的最有前途的首选天然抗癌药物。

鉴于紫杉醇抗癌机制独特,疗效显著,现有红豆杉资源远不能满足需要,本文综述了紫杉醇的植物资源和通过红豆杉人工栽培、细胞培养、真菌培养以及半合成、全合成的途径开发紫杉醇的状况。

关键词　抗癌新药;紫杉醇;红豆杉;资源;开发分类号　S 791.49紫杉醇(文献名Paclitaxel ,商品名taxo l ,1)是70年代初由W an i 等〔1〕从红豆杉科(T axac 2eae )短叶红豆杉(T ax us brev if olia )的树皮中提取的。

70年代末发现紫杉醇具有独特的抗癌机理,从而在世界范围内掀起了紫杉醇研究开发的热潮。

迄今为止,从红豆杉属(T ax us )植物中,已鉴定的100多种具有紫杉烷(T axane )二萜骨架结构的二次代谢产物中,紫杉醇的抗癌作用最强。

随后又发现半合成类似物taxo tere 2是紫杉醇的竞争对手,其抗癌活性比紫杉醇略高,而且易溶于水,现已进入第三期临床阶段。

自1992年底美国食品药品管理局(FDA )批准天然紫杉醇用于治疗卵巢癌和乳腺癌以来,一方面随其临床应用范围日渐扩大和基础研究的深入,需求量日益增加,另一方面红豆杉属于裸子植物,生长缓慢,分布星散,极少成林,且紫杉醇在该属植物的树皮中含量又很低(0.01%～0.06%)。

因此造成紫杉醇供应的奇缺。

为保障紫杉醇的供应以及保护资源免遭灭绝,科学家们潜心致力于寻找紫杉醇新资源的研究,并已取得很大进展〔2〕。

本文就紫杉醇的资源开发予以评述。

1　紫杉醇在植物体中的分布紫杉醇和其它紫杉烷类化合物主要存在于红豆杉科植物和红豆杉近缘科属植物中。

1.1　红豆杉科植物红豆杉科植物为常绿乔木或灌木,共5属约23种,除澳洲红豆杉属(A ustrotax us )1种澳洲红豆杉(A .sp ica ta )产于南半球外,其余均产于北半球。

我国有其中4属12种1变种及1栽培变种〔3〕。

红豆杉属植物约11种,广泛分布于欧洲大陆和北美的寒带、温带及亚热带地区。

我国4种1变种,产于西南、华南、华中、华东、西北、东北以及台湾,分布中心在西南地区〔4〕。

已分析发现〔5,6〕,红豆杉科5个属中的4个属:红豆杉属(T ax us L )、澳洲红豆杉属及白豆杉属(P seud otax us )及榧属(T orrey a )均含有紫杉烷类化合物,从化学分类学的观点,余下的穗花杉属(A m en totax us )亦可能含有结构类似的化合物。

西北林学院学报　1997,12(3):94～101Journal of N o rthw est Fo restry Co llege α迄今,已从短叶红豆杉、东北红豆杉(T .cusp id a ta )、欧洲红豆杉(T .bacca ta )、喜马拉雅红豆杉(T .w a llich iana )、云南红豆杉(T .y unnanensis )、加拿大红豆杉(T .canad ensis ).红豆杉(T .ch inensis )、南方红豆杉(T .ch inensis var m a irei )树皮中分离出紫杉醇及其相关化合物,如半合成的前体10—去乙酰巴卡亭 (10-deacetylbaccatin ,3)、巴卡亭 (baccatin ,4)及赛法罗马宁(cep halom ann ine )等〔1,3～12〕。

此外,还从云南红豆杉、欧洲红豆杉、东北红豆杉、T .×m ed ia cv H ick sii 杂种及南方红豆杉枝叶中获得〔13～17〕。

最近研究发现欧洲红豆杉、云南红豆杉、球果红豆杉(T .g lobosa )、苏门答腊红豆杉(T .sum a triensis )和T .m ed ia 针叶中紫杉醇含量高于或相当于干燥短叶红豆杉树皮中的(约0.01%)含量〔2〕。

因此,从长期生产的需要出发和确保足够的资源,自红豆杉枝叶中提取紫杉醇及半合成前体是近几年解决紫杉醇资源短缺的可行途径。

因采集针叶和嫩枝不会破坏植物,还可快速不断再生。

今后2～3年,以baccatin 为前体的半合成物将逐步代替短叶红豆杉树皮作为紫杉醇的主要资源。

近来报道,红豆杉科的榧树(T orrey a g rand is Fo rt .)茎叶及白豆杉(P .ch ien ii Cheng )叶和茎皮中都存在紫杉醇及其类似化合物〔5,6〕,后者紫杉醇含量高于前者,白豆杉可能成为新的资源代用品。

此外,还发现有些红豆杉幼树、幼苗小枝中紫杉醇含量与大树的几乎相当,即人工红豆杉林不需培育成大树后利用,生长几年后则可采集枝叶利用,缩短利用周期,且不影响生长。

值得提及的是,紫杉醇和紫杉烷类化合物在植物体内的含量普遍很低,主要受如植物种类、部位或组织、树龄、生理与生长环境、采收季节及贮存加工方法等因素的影响〔18～23〕。

1.2　红豆杉近缘科属植物罗士德等〔7〕首次报道了红豆杉科植物近缘的三尖杉科三尖杉属植物高山三尖杉(Cep ha lotax us f ortunei Hook var a lp ina L i )、海南粗雁(C .ha inanensis L i )、西双版纳粗雁(C .m ann ii )及罗汉松科罗汉松属植物大理罗汉松(P od oca rp us f orrestii )茎皮、茎叶中存在巴卡亭 ,有的种含量还很高,仅有西双版纳粗榧含紫杉醇及大理罗汉松含赛法罗马宁,这为扩大紫杉烷型化合物资源提供了依据。

2　红豆杉的人工栽培近年来,国内外对红豆杉的人工繁殖培育进行了大量研究,采用种子繁殖及扦插等无性繁殖方法,大面积繁育红豆杉幼苗,并建立了人工种植园,这为保护发展和充分利用红豆杉资源提供了一条有效途径〔24～26〕。

红豆杉种源少,种子繁殖困难,时间长,要经二冬一夏的沙藏处理方能萌发。

相比而言,扦插育苗更适合于红豆杉繁殖〔27〕。

红豆杉扦插繁殖多受扦插前药剂处理、扦插基质、插穗取材、扦插季节等因素的影响。

一般认为,插前用吲哚丁酸(I BA )、吲哚乙酸(I AA )、Α—萘乙酸(NAA )、AB T 等药剂处理插穗效果良好。

东北红豆杉扦插试验结果表明,用浓度100×10-6的I BA 处理的3h ,30d 后开始出根,45d 基本出齐,比对照提前1个月,根生长量是同期对照组的10倍〔28〕。

东北红豆杉插穗不宜过长,5～15c m 插穗宜于生根成活,尤以5～7c m 小枝用作扦插材料,有很高的成活率,而且取自母树底部的插穗生根率和成活率远高于取自顶部的〔24〕。

高正〔29〕对东北红豆杉扦插育苗经10多年观察发现,扦插基质以乌沙土或沙质壤土为宜,在5月中旬到6月下旬进行,扦插条采用2,50010-610,90%593期 高锦明等　紫杉醇资源开发研究 69 西北林学院学报 12卷上。

杨利民等〔30〕研究发现东北红豆杉以较大枝条扦插为好,在浓度为200×10-6的AB T2生根粉中浸8h,以锯末为扦插基质,生根率可达82%。

云南红豆杉经10多年的人工栽培试验表明,扦插以10～15c m长的一年生枝条,经药剂处理,2～3月份春插,8月份秋插,插壤用红土、沙、炭渣配成效果较佳〔26〕。

南方红豆杉扦插繁殖宜在秋季进行,采用500×10-6浓度的I BA经12h 的浸泡,其成活率可达到95%〔31〕。

云南已建成我国最大的云南红豆杉育苗基地,已培育出壮苗320万株,扦插育苗生根率在69.17%～94.89%,为不同季节大面积造林定植打下基础。

江西德兴市采用种子和扦插育苗, 1997年出圃苗约8万多株,可营造南方红豆杉林47hm2。

美国种植红豆杉树400万株,开辟了1000万株红豆杉种植园,还栽培杂种红豆杉T ax us m ed ia“H ick sii”数百万株,该杂种为灌木型,枝叶繁茂,生长快,易于栽培,3～5年内就可收获枝叶,是目前已知的优良品种。

因此,在弄清红豆杉生态生物学特性、适生范围、适生条件以及掌握人工繁殖栽培技术的前提下,大面积栽培红豆杉是目前解决紫杉醇资源短缺的最简便、最经济的办法。

3　红豆杉的细胞培养利用离体培养的生物技术生产紫杉醇及其半合成前体物或原植物内不含有的活性类似物是扩大紫杉醇来源的又一重要途径。

它具有弥补红豆杉资源匮缺、保护野生资源及不受自然条件限制、产物较易分离等优点。

目前全世界已对11种或变种红豆杉植物的细胞与组织培养进行了研究〔32～38〕,发现不同种属的红豆杉或不同的器官、组织及生长部位,紫杉醇含量不同的外植体,对应的诱导愈伤组织的培养基组成以及培养条件都对愈伤组织的诱导、继代培养、悬浮培养及紫杉醇等次生代谢物产生不同程度的影响。

诱导红豆杉愈伤组织的外植体为针叶、幼茎、树皮、形成层、种胚及假种皮等,其中以幼茎、形成层或树皮效果较好。

Fett-N eto等〔38〕在研究东北红豆杉的不同组织的诱导能力时发现,幼茎是最佳的外植体。

在诱导红豆杉愈伤组织所用的培养基中,尤以改良B5、SH及6,7—V为佳,诱导率也较高。

培养基中激素的种类和组成、浓度或其组合对愈伤组织的诱导是必需的。

一般认为,培养基中含1.0～2.0m g L2,4—D或含2,4—D的激素组合,有利于愈伤组织的诱导〔32,35〕。

最近,甘烦远等〔37〕认为在M S培养基中附加1.0m g L NAA+1.0m g L2,4—D+ 0.1m g L KT的植物激素,红豆杉嫩枝条的愈伤组织诱导率达到100%,针叶的诱导率亦达到84%;在B5培养基附加2.0m g L2,4—D+0.1m g L KT激素条件下,由嫩枝条产生的愈伤组织生长较好,愈伤组织的生长率达0.23g L・d细胞干重,针叶的生长较差。

大量的研究表明,愈伤组织诱导的最佳培养条件均为:20～25℃、黑暗、培养基灭菌前pH5.5～5.8。

此外,通过优化组织培养条件可明显增加培养细胞中紫杉醇的产量〔34,39〕。

其具体措施为:向培养基中添加紫杉醇的生物合成前体,如苯丙氨酸,亮氨酸等;在培养细胞中引入生物性或非生物性诱导子,如真菌、细菌和酵母的细胞壁萃取物以及化学协同物质(钒酸盐、重金属等)。

植物单细胞克隆技术是筛选产生有用次生代谢物的优良细胞系的技术基础。

李家儒等〔40〕首次报道了红豆杉单细胞克隆的建立过程,通过试验发现,在红豆杉细胞克隆中使用悬浮培养10～15d的细胞培养物分离单细胞,进行平板培养、条件培养及看护培养,植板率差异显著。

其中看护培养最有利于细胞克隆的生长。

高山林等〔36〕建立了T ax us m ed ia和短叶红豆杉的细胞培养技术方法,通过培养基优化筛选试验成功地诱导获得了12个细胞株系,通过不同激素试验使细胞月增长量达13倍,培养基每月干细胞产量达16.11g L,这为细胞培养工厂化生产提供了理论依据。