食品毒理学实验讲义

实验一实验动物的基本操作技术(2013年5月15日)1.实验目的和要求毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来研究毒作用，获得毒物的毒性、剂量—反应关系、毒作用机制等方面的资料，因此动物实验是毒理学研究中重要的手段之一。

通过本次学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物的选择、动物抓取等技术。

2.实验原理做毒理学实验，首先要了解实验动物选择的要求、实验样品的采集方法等。

3．实验仪器设备：小鼠若干，手套，苦味酸酒精饱和液，0.5％中性红或品红溶液，棉签，解剖剪刀10把，感应量为0.1g的天平一台。

4．实验内容步骤：(一)健康动物的选择无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。

健康动物检查时要求达到：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。

选择时重点检查以下几项：l．眼睛明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。

2．耳耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。

3．鼻无喷嚏，无浆性粘液分泌物。

4．皮肤无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。

5．颈部要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。

6．消化道无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。

7．神经系统无震颤、麻痹。

若动物(大鼠、小鼠)出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动，应放弃该动物。

8．四肢及尾四肢、趾及尾无红肿及溃疡。

(二)实验动物的性别鉴定小鼠主要依据肛门与生殖孔间的距离区分，间距大者为雄鼠，小者为雌性。

成年雄鼠卧位可见睾丸，雌性在腹部可见乳头。

(三)抓取方法正确地抓取固定动物，是为了在不损害动物健康、不影响观察指标、并防止被动物咬伤的前提下，确保实验顺利进行，小鼠的抓取方法先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。

（四）编号、标记方法1、称重鼠称的感应量在0.1g以下。

o2、标记方法染色法：采用染料(苦味酸酒精饱和液)涂擦动物皮毛标记的方法进行编号。

用毛笔或棉签蘸取染料涂于动物的不同部位，以苦味酸黄色斑点染料标记来表示不同号码。

一般习惯涂在左前腿为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右前腿为7，右腰部为8，右后腿为9。

如果动物编号超过10，需要10~100号码时，可采用在上述动物的不同部位，再涂染另一种涂料斑点，即表示相应的十位数，即左前腿为10，左腰部为20，以此类推。

5．注意事项：在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失。

同时要遵守实验操作规程。

实验二实验动物的分组、染毒(2013年5月22日)1.实验目的和要求通过本次学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物分组的方法，掌握常用的动物染毒途径和方法。

2.实验原理随机分组法。

实验动物的一般染毒途径主要是皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射、腹腔注射、经口染毒,皮肤染毒和呼吸道染毒。

3．实验仪器设备：实验动物：成年、健康小鼠。

器材：注射器(0.5，1ml)、消毒棉球、手套、50ml烧杯。

试剂：0.9％生理盐水(100ml，灭菌)。

4．实验内容步骤：（1）实验动物的随机分组方法（随机数字表法）为了得到客观的剂量－反应关系，应将一群动物按统计学原则随机分配到各个试验组中。

将实验单位随机分成三组设有动物X只，随机等分成Y组。

将动物编号后，按上述方法，从随机数字表抄录X个数字，将各数一律以Y除之，并以余数1、2、3……Y代表各组。

动物号码１２３４５随机数目除Y后的余数要使各组的动物数相等，须把原归某组的动物改配到其它组去。

可以随机数字表继续按斜角线抄录一个数字，得60，以有多出的一组现有只数除之，余数为几，就可以把第几个移入其它组。

（2）实验动物的染毒①皮下注射注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有针头的注射器刺入皮下。

注射部位一般在大腿外侧、内侧、背部、耳根部、腹部。

②皮内注射皮内注射时需要将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤使之绷紧，在两指之间，将连有针头的注射器紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药物，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。

5．注意事项：在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失。

同时要遵守实验操作规程。

实验三实验动物生物材料的采集和制备(2013年5月29日)1．实验目的要求掌握动物生物样品采集方法及实验动物的处死方法。

2．实验原理：动物生物样品的采集对实验结果十分重要，各脏器的比重和血液指标反映了动物染毒后的生理变化。

3．实验仪器设备：实验动物：成年、健康小鼠。

试剂：酒精棉球。

器材：酒精棉球、解剖剪刀、血色素吸管、干棉球、注射器、镊子。

4．实验内容步骤：（一）采血方法1．鼠尾采血方法：适用于血量少的实验。

方法：将动物固定后，把鼠尾浸入 45～50℃温水中使尾静脉充血，擦干皮肤后，再用酒精棉球擦拭消毒。

剪去尾尖(约 0.2～0.3cm)，拭去第一滴血，用血色素吸管(根据需要事先在吸管内加入与不加抗凝剂)吸取一定量尾血，然后用干棉球压迫止血。

也可以不剪尾，以1ml注射器连上7—8号针头直接刺破尾静脉进行定量采血。

2．眼眶静脉丛采血法：操作者以左手拇指、食指紧紧握住小鼠颈部压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血(注意用力要恰当，以防止动物窒息死亡)，右手持玻璃毛细管从一侧眼内眦部以45度角刺人，捻转前进。

如无阻力继续刺人，有阻力就抽出玻璃毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止。

右手持容器收集血液后，拔出毛细管，用干棉球压迫止血。

3．断头采血法：操作者左手握住动物，右手持剪刀，快速剪断头颈部，倒立动物将血液滴人容器。

注意防止剪断的毛发掉入接血容器中。

（二）处死方法1．脊椎脱臼法左手按住鼠头，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎拉断脱节而立即死亡。

此法多用于处死小鼠。

2．断头法操作者用右手按住大鼠或小鼠头部，左手握住背部，露出颈部，助手用大剪刀或断头器剪断颈部使之死亡。

也可使用断头器。

3．急性大失血法可用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血法使大、小鼠立即死亡(详见动物的采血方法)。

4．击打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡。

也可用小木锤或器具猛力击打动物头部，使其立即死亡，常用于处死家兔或大鼠（三）实验动物脏器的观察和采取。

5．注意事项：在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；要遵守实验操作规程。

实验四经口急性毒性试验(2013年6月5日)1．实验目的要求了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。

2．实验原理：化学物经口染毒的方法是毒理学中重要的基本技术之一，经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。

通过该实验学习化学物毒性试验的实验设计原则和掌握经口灌胃技术。

3．实验仪器设备：实验动物：成年、健康的雌、雄小鼠若干。

器材：器材：注射器(0.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，10ml)、容量瓶(10，25，50ml)、烧杯(10，25，50ml)、滴管、灌胃针、电子天平、动物体重秤、解剖剪刀、镊子。

试剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。

4．实验内容步骤：1．健康动物的选择和性别鉴定。

2．实验动物称重、编号和随机分组。

3．受试化学物溶液的配制。

4．小鼠灌胃操作技术。

取9只小鼠，称重并随机分成三组，对三组动物分别用灌胃法给以0.2mg/g, 0.1mg/g, 0.05mg/g的氯化钡溶液。

小鼠灌胃法将钝头的16号注射针(适用于小鼠)(注意事先可用焊锡在针尖周围焊一圆头，使其不易损伤动物的消化道)安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤(小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧)，将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。

注意使动物的上消化道固定成一直线。

右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。

若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。

如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。

进针深度一般是小鼠 2.5～4cm。

为了验明是否已正确地地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出，表明已插入胃中；如有大量气泡，则提示误插气管，应抽出重插。

随后将受试物溶液注入。

灌胃容量小鼠通常为0.2—lml。

5．毒性症状的观察。

染毒后注意观察中毒的发生、发展过程的规律以及中毒特点和毒作用的靶器官，观察要点见表1，做好实验记录。

急性毒性试验可不做病理组织学检查，但对死亡动物应做大体病理学观察，存活动物实验结束时可做大体解剖学观察，肉眼观察到病变时应取材做病理组织学检查，以便为下阶段毒性试验剂量选择提供参考依据。

表1：急性毒性试验原始记录表受试物名称：亚硝酸钠染毒途径：经口灌胃染毒实验动物：成年健康小鼠室温：25℃相对湿度：58%表2：急性毒性试验观察记录表组别：5组，10只/组染毒剂量（mg/kg）：按等比级数增减，相邻两剂量比值1：（0.6—0.9），设4—5个剂量组。

动物编号：采用染色法进行编号性别：雌雄各半体重（g）20—25g染毒时间：（例如：6月5日14:20，根据你做实验的时间来写）症状及出现时间：（例如：6月5日15:45，根据你做实验的时间来写）死亡时间: （例如：6月5日17:10，根据你做实验的时间来写）体重记录（g）:（三个数据，浮动不超过0.5g）实验记录者：记录日期：年月日5．注意事项：在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；要遵守实验操作规程。

染毒前应禁食6～10小时，但要注意时间不能过长。

灌胃后至少2～3小时后才能喂食，油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。

相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所不同。

体积太小、太浓可能发生局部刺激或其他损伤；体积太大可能会引起胃部机械性损伤，影响正常生理功能。

常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。

通常灌胃体积以体重的1％～2％计算，最多不超过3％，即每100g体重灌胃1～2ml，最多不超过3ml。