加压筛选试剂
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法中各试剂的作用
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法中各试剂的作用
在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，各试剂的作用如下：
1. 聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶是用来限制蛋白质在电泳过程中的迁移范围，根据蛋白质的大小进行分离。
它具有高分辨率和高灵敏度的特点。
2. SDS（十二烷基硫酸钠）：SDS是一种表面活性剂，可以使蛋白质在电场作用下具有负电荷，使其沿着电场方向迁移。
SDS还可以破坏蛋白质的二级、三级结构，使其呈现线性结构，有利于电泳分离。
3. 溶解缓冲液：溶解缓冲液通常由甘氨酸、甘胺酸等组成，它的作用是稀释试样中的蛋白质，使其能够被顺利地迁移和分离。
4. 进样缓冲液：进样缓冲液用于稀释待测蛋白质溶液，以使其能够均匀地进入凝胶孔隙。
常见的进样缓冲液成分包括甘氨酸、甘胺酸等，与溶解缓冲液相似。
5. 分离缓冲液：分离缓冲液的主要成分是三种离子，包括CID （二甲基硫酸钠）、电解质和pH调节剂。
分离缓冲液的作用
是控制pH和离子强度，使电泳过程中的蛋白质迁移速度保持
稳定，并保证良好的分离效果。
6. 标记蛋白质：标记蛋白质是通过在电泳前将其与荧光剂等物质结合，用于检测和定量目标蛋白质。
标记蛋白质的选择通常根据检测方法和需要的灵敏度来决定。
用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202002012用于CRISPR 文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建张纪文，王露露，李芳，刘杏，赵东明*，步志高*（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069）摘要：为了进行CRISPR 文库筛选，本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a 细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。
实验将LentiCas9-Blast 、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞（HEK293T ）获取高滴度的重组慢病毒，收集重组慢病毒并感染N2a 细胞，经杀稻瘟菌素（Blasticidin ）筛选，通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。
Western blot 结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白；利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力；利用CellTiter-Glo 试剂检测结果显示，Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。
本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系，为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。
关键词：基因编辑；慢病毒；高通量筛选；鼠神经瘤母细胞中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1292-04Construction of N2a-Cas9cell line for genome-wide CRISPR screeningZHANG Ji-wen,WANG Lu-lu,LI Fang,LIU Xing,ZHAO Dong-ming *,BU Zhi-gao *(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract :In this study,mouse neuroblastoma (N2a)cells were used to construct N2a-Cas9cell line which stably expresses Cas9protein by using lentivirus transfection technology.This constrcted cells line laid the foundation for CRISPR library screening.First,three plasmids including LentiCas9-Blast,pSPA X2,and pMD 2.G were co-transfected into human renal epithelial cells (HEK293T)to obtain recombinant lentivirus with high titers.N2a cells were infected with the recombinant lentivirus,and then screened by Blasticidin.Finally,several monoclonal cell lines expressing Cas9protein were isolated by limiting dilution.The expression of Cas9expression in N2a-Cas9cell line was determined by western blot,and the high cleavage activity of Cas9was also examined by using lentivirus-based reporter vector system.By using CellTiter-Glo ®reagent,the cell proliferation activity was well detectable and not decreased in N2a-Cas9cell lines,where Cas9gene was expressed in a high level.Therefore,N2a-Cas9cell line was successfully constructed using a lentiviral transfection system,which can provide a basis for genome-wide CRISPR screening to identify crucial host factors regulating Rabies virus neuro-tropism.Key words :gene editing;lentivirus;genome-wide CRISPR screening;murine neuroblastoma收稿日期：2020-02-11基金项目：兽医生物技术国家重点实验室自主课题（SKLVBP201801）作者简介：张纪文（1993-），男，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事兽医微生物及其分子生物学研究.*通信作者：E-mail ：****************；*********************Corresponding author张纪文，等.用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建第12期CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于细菌或古生细菌中的一种抵御外源DNA 侵入的适应性免疫反应系统[1]。
MSX加压筛选与MTX加压筛选
蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力；氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。
1. CHO细胞表达体系常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。
CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。
改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。
为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。
向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。
2. 载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。
目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。
顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。
2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。
细胞转染、药物筛选(试行)[2]
![细胞转染、药物筛选(试行)[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/55526d7a31b765ce05081443.png)
细胞转染、药物筛选（试行）第一天细胞复苏1、从液氮罐取出一管细胞)，迅速置于37℃水浴锅中溶化。
2、和9ml FBS-DMEM（双抗）一起转移到14-ml的离心管中。
3、离心1000rpm 5min，负压吸去上清。
4、用FBS-DMEM（双抗）重悬细胞，铺到6孔板上（2ml液体）。
12hr后若死细胞很多需换液1、负压吸去培养基。
2、加入2ml新鲜的FBS-DMEM（双抗）。
第三天细胞传代1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。
2、室温放置约30秒，吸走胰酶。
加入3毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。
3、1：3传代，取2/3平分到2个6孔板的孔内。
1孔转染，1孔支原体检测（不含抗性的培养基中连续传3代，最后一次传代后需不换液3天后取细胞做支原体检测）。
4、37度，5%CO2培养。
第五天细胞传代1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。
2、室温放置约30秒，吸走胰酶。
加入2毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。
3、细胞计数，传代。
使细胞数达到6*105个/毫升，取2毫升/孔加到2个孔内。
（与支原体检测孔分开操作）4、37度，5%CO2培养。
第六天转染1、观察细胞，若状态良好，且细胞密度达到70-80%可以进行细胞转染。
2、转染前2个小时细胞换上1毫升新鲜的FBS-DMEM（含血清，不含抗生素）。
3、2个小时后取0.1毫升DMEM（不含药物，不含血清）加入1.5毫升EP管中。
4、从-20度中取出DNA（1ug/ul），待全部溶解后将DNA混匀，取4 ug DNA加入到0.1毫升DMEM中，混匀。
5、将已溶解的PEI（PEI一定要最后加入）吹打混匀，取12ul加入0.1毫升DMEM中，将PEI、DNA、DMEM三者轻轻吹打混匀。
室温放置15分钟。
6、将三者混合物分多点加入到2个小时前换液的细胞，成十字形摇晃培养基。
加压筛选步骤
加压筛选步骤
加压筛选一般可以按照以下步骤进行：
1. 将抗药性基因通过基因转染的方式引入细胞，并确保抗药性基因受到与需要筛选的目标基因相同的启动子调控。
2. 在将相应的药物加入到培养基后，不表达目标基因和抗药性基因的细胞将全部被药物杀死，达到筛选的目的。
3. 接下来，可以通过适当的细胞扩增和克隆过程，将筛选后的细胞群体进一步纯化和扩增。
4. 在此过程中，需要定期检查细胞的生长和存活情况，以确保细胞的稳定性和筛选的有效性。
5. 最后，可以通过基因表达分析、细胞功能实验等手段，对筛选后的细胞进行进一步的研究和分析，以确定目标基因的功能和作用。
需要注意的是，加压筛选是一种相对复杂的技术，需要专业的实验技能和设备支持。
同时，在进行基因转染和细胞筛选等操作时，还需要严格遵守实验室安全规范，确保实验过程的安全性。
G418筛选
从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
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蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力；氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。
1. CHO细胞表达体系常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。
CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。
改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。
为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。
向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。
2. 载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。
目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。
顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。
2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。
hplc级别试剂
hplc级别试剂HPLC是高效液相色谱的缩写，是一种高效分离和分析化学物质的方法。
HPLC试剂是指在HPLC分析中使用的试剂，包括溶剂、缓冲液、pH调节剂、离子对、柱填料等。
HPLC试剂的质量直接影响着分析结果的准确性和可靠性，因此选择优质的HPLC试剂至关重要。
一、HPLC试剂的分类1.溶剂：HPLC分析中最常用的溶剂是乙腈、甲醇、水和乙醇。
这些溶剂的纯度和质量对分析结果有着重要的影响。
为了保证分析结果的准确性，HPLC试剂中的溶剂必须具有高纯度和稳定性。
2.缓冲液：HPLC试剂中的缓冲液用于调节样品的pH值，以便保证分析结果的准确性。
常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、三甲胺缓冲液等。
3.pH调节剂：pH调节剂可以用于调节溶液的pH值，以便保证分析结果的准确性。
常用的pH调节剂有盐酸、氢氧化钠等。
4.离子对：离子对可以用于分析离子化合物，常用的离子对有草酸钠-草酸、硝酸钠-硝酸等。
5.柱填料：柱填料是HPLC分析中最重要的组成部分之一，它直接影响着分析结果的准确性。
常用的柱填料有C18、C8、C4、CN 等。
二、HPLC试剂的质量要求1.纯度：HPLC试剂的纯度是影响分析结果准确性的重要因素之一。
为了保证分析结果的准确性，HPLC试剂的纯度必须达到高纯度要求。
2.稳定性：HPLC试剂的稳定性是保证分析结果准确性的重要因素之一。
HPLC试剂必须具有良好的稳定性，以便在长期储存和使用过程中不会发生变化。
3.可靠性：HPLC试剂的可靠性是保证分析结果准确性的重要因素之一。
HPLC试剂必须具有良好的可靠性，以便在分析过程中不会发生误差。
三、HPLC试剂的选择1.根据分析目的选择试剂：分析目的不同，所需的HPLC试剂也不同。
因此，在选择HPLC试剂时，必须根据分析目的选择试剂。
2.选择高纯度试剂：为了保证分析结果的准确性，必须选择高纯度的HPLC试剂。
3.选择稳定性好的试剂：为了保证分析结果的准确性，必须选择稳定性好的HPLC试剂。
生化中常用缓冲试剂及应用
生化中常用缓冲试剂及应用生化实验中常用的缓冲试剂包括盐酸/氯化钠缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液、碳酸氢盐/碳酸钠缓冲液等。
首先，盐酸/氯化钠缓冲液是一种弱酸/弱碱缓冲液，常用于酶活性测定、蛋白质提取和分离等实验中。
其pH调节范围一般在2.0-7.5之间，具有很好的稳定性和可靠性。
然后，磷酸缓冲液可分为无机磷酸盐缓冲液和有机磷酸盐缓冲液。
无机磷酸盐缓冲液可以提供更广泛的pH范围，适用于分子生物学、酶学研究以及细胞培养等实验。
有机磷酸盐缓冲液常用于生物化学分离、柱层析、电泳等实验中。
Tris缓冲液是一种常用的弱酸/弱碱缓冲液。
由于其pKa值较接近生物体内的pH 值，所以在生化实验中被广泛应用。
Tris缓冲液的最适pH范围为7.0-9.0，适用于蛋白质电泳、DNA/RNA纯化等实验。
乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液常用于螯合金属离子，维持实验体系中金属离子的稳定性。
在细胞培养、核酸提取、膜蛋白分离等实验中，EDTA可有效地去除对实验干扰的金属离子。
碳酸氢盐/碳酸钠缓冲液在生化实验中用于模拟生物体内酸碱环境。
这种缓冲液根据需要可调节pH值，并且稳定性较高。
碳酸氢盐/碳酸钠缓冲液在酶活性测定、细胞生长等实验中被广泛应用。
这些缓冲试剂在生化实验中起到了非常重要的作用。
它们能够稳定实验环境的pH值，提供合适的酸碱条件，维持酶的活性，同时可以优化化学反应。
不同的缓冲试剂适用于不同的实验需求。
在实际操作中，要根据所需pH范围、实验样品的性质和实验条件的要求选择合适的缓冲试剂。
除了上述常见的缓冲液外，还有一些特定用途的缓冲试剂。
例如，Tris-EDTA（TE）缓冲液常用于储存DNA和RNA样品，以保持其稳定性。
Tween缓冲液常用于蛋白质或细胞膜的提取和溶解，起到增加样品溶解度和提高蛋白质提取效果的作用。
总之，缓冲试剂在生化实验中是不可或缺的。
它们通过调节溶液的酸碱度，稳定实验条件，保证实验结果的准确性和可重复性。
LA1筛选试剂及LA2验证试剂
LA1筛选试剂及LA2验证试剂医疗器械注册证书编号：产品标准编号：YZB/德灵 014-2004 狼疮抗凝物检测试剂盒改良鲁塞尔氏蝰蛇毒稀释试验（DRVVT）用于狼疮抗凝物质检测。
用途 LA1筛查试剂和LA2确诊试剂是一种改良的DRVVT试验试剂，用于一期凝固法检测狼疮抗凝物质（LA）。
L A1筛查试剂改良DRVV试剂用于筛查狼疮抗凝物质。
L A2确诊试剂富含磷脂的DRVV试剂能特异地检出狼疮抗凝物质。
概要和说明狼疮抗凝物质是一类自身抗体，具有抗带负电荷的磷脂，或抗磷脂和β-2-糖蛋白1.凝血因子如凝血酶原形成的复合物。
LA见于多种临床疾病，尤其是自身免疫性疾病，目前认为也是伴不明原因血栓病人的重要危险因子，也常见于习惯性流产的妇女5。
LA检测的经典方法采用磷脂反应性凝集试验，如活化部分凝血活酶时间（APTT），白陶土凝血时间（KCT），当存在抗凝剂影响时采用DRVVT2。
D RVV试验自Thiagarajan等6于1986年报道后才开始流行。
Gradipore改良并标准化了该方法7。
按照Petri等观点，系统性红斑狼疮病人血栓形成时，DRVVT检出狼疮抗凝物质比酶联免疫吸附试验（ELISA）检出抗心磷脂抗体的关系更密切5。
近来，Galli和Bevers9进一步证明了该观点，实验表明，对DRVVT试验影响最大的LA亚型是β2-糖蛋白1型，而凝血酶原依赖的LA亚型对KCT试验的影响较大。
试验原理1.在LA1筛查试剂中，鲁塞尔氏蝰蛇毒能直接激活X因子，导致血浆凝固。
LA抗体使LA1筛查试剂的凝固时间延长。
2. 在LA2确诊试剂和LA1筛查试剂一样，但含有高浓度的磷脂。
外源性磷脂与LA抗体结合，很大程度上纠正凝固时间。
3. DRVV试验“跳过”了外源性凝血因子Ⅶ，和内源性凝血的接触因子.抗血友病因子。
因此，DRVVT筛查试验比APTT试验检出狼疮抗凝物的特异性更高，因为该试验不受接触因子异常.Ⅷ因子缺乏或Ⅷ因子抗体的影响6。
一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用[发明专利]
![一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2962e57f2f3f5727a5e9856a561252d380eb20d9.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611209263.9(22)申请日 2016.12.23(71)申请人 浙江海隆生物科技有限公司地址 312000 浙江省绍兴市滨海新城马欢路398号科创中心2号楼5楼(72)发明人 钱泓 吴有强 卞广林 张强 徐玉兰 车影 吴素芳 查银河 (74)专利代理机构 北京乾诚五洲知识产权代理有限责任公司 11042代理人 付晓青 李广文(51)Int.Cl.C12N 5/10(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/65(2006.01)(54)发明名称一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用(57)摘要本发明公开了一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用，该方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因；2)将目的基因插入1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中；3)将2)中构建的重组质粒转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；5)从阳性细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。
使用本发明的方法在CHO单克隆细胞株筛选时能够显著提高筛选效率，节约筛选时间；且在批量构建真核表达载体时能够显著提高工作效率和降低成本。
权利要求书1页 说明书8页 附图2页CN 107964535 A 2018.04.27C N 107964535A1.一种CHO单克隆细胞株的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因，以得到改造的pEE12.4的多克隆位点；2)将目的基因插入步骤1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中，以获得构建的重组质粒；3)将步骤2)中构建的重组质粒通过转染试剂转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；5)从阳性CHO细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。
韦氏试剂_精品文档
韦氏试剂韦氏试剂是一种广泛应用于生物化学和分子生物学实验室的常用试剂。
韦氏试剂主要由一系列生化试剂组成，在许多实验中发挥着重要作用。
它被用来进行蛋白质电泳、核酸杂交、PCR和Western blot等实验。
在蛋白质电泳中，韦氏试剂主要用于制备蛋白质样品的溶液。
其中，最常用的韦氏试剂之一是韦氏缓冲液。
一般的韦氏缓冲液是由两个主要组分组成：三氯醋酸（Trichloroacetic acid）和磷酸（Phosphoric acid）。
这种缓冲液可以帮助蛋白质样品溶解，并在电泳过程中维持适当的pH值。
韦氏缓冲液还可以用于凝胶电泳的染色和去染过程。
此外，韦氏试剂还可以用于核酸杂交实验。
核酸杂交是一种研究DNA和RNA序列相似性的技术。
在这种实验中，韦氏试剂常用于制备杂交液，以及洗涤和显影杂交膜。
韦氏缓冲液中的盐类和酸性条件可以帮助DNA和RNA在杂交液中更好地结合。
PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列。
在PCR实验中，韦氏试剂常用于制备PCR反应体系的缓冲液。
韦氏缓冲液中的盐类和酸性条件可以提供适当的环境，维持反应体系的pH值，并促使DNA链的解旋和DNA聚合酶的活性。
当进行Western blot实验时，韦氏试剂也是必不可少的。
Western blot是一种用于检测特定蛋白质在混合蛋白样品中存在与否的技术。
韦氏试剂中的一些成分可以帮助蛋白质在电泳过程中迁移，并提供适当的条件进行染色和显影。
韦氏缓冲液还可以用于制备Western blot实验中的洗片缓冲液。
此外，韦氏试剂还可以用于凝胶电泳的染色和去染过程。
韦氏染色剂一般由溴酸铅（PbAc）和醋酸铅（PbAc）组成，可以用于染色凝胶中的DNA、RNA和蛋白质。
韦氏去染剂主要由硫酸锌和醋酸锌组成，用于去除凝胶中残留的染料。
总之，韦氏试剂是一种在生物化学和分子生物学实验室中广泛应用的试剂。
它在蛋白质电泳、核酸杂交、PCR和Western blot等实验中发挥着重要作用。
细胞转染、药物筛选（试行）[2]
![细胞转染、药物筛选（试行）[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/63c323243868011ca300a6c30c2259010302f358.png)
细胞转染、药物筛选（试行）第一天细胞复苏1、从液氮罐取出一管细胞)，迅速置于37℃水浴锅中溶化。
2、和9ml FBS-DMEM（双抗）一起转移到14-ml的离心管中。
3、离心1000rpm 5min，负压吸去上清。
4、用FBS-DMEM（双抗）重悬细胞，铺到6孔板上（2ml液体）。
12hr后若死细胞很多需换液1、负压吸去培养基。
2、加入2ml新鲜的FBS-DMEM（双抗）。
第三天细胞传代1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。
2、室温放置约30秒，吸走胰酶。
加入3毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。
3、1：3传代，取2/3平分到2个6孔板的孔内。
1孔转染，1孔支原体检测（不含抗性的培养基中连续传3代，最后一次传代后需不换液3天后取细胞做支原体检测）。
4、37度，5%CO2培养。
第五天细胞传代1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。
2、室温放置约30秒，吸走胰酶。
加入2毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。
3、细胞计数，传代。
使细胞数达到6*105个/毫升，取2毫升/孔加到2个孔内。
（与支原体检测孔分开操作）4、37度，5%CO2培养。
第六天转染1、观察细胞，若状态良好，且细胞密度达到70-80%可以进行细胞转染。
2、转染前2个小时细胞换上1毫升新鲜的FBS-DMEM（含血清，不含抗生素）。
3、2个小时后取0.1毫升DMEM（不含药物，不含血清）加入1.5毫升EP管中。
4、从-20度中取出DNA（1ug/ul），待全部溶解后将DNA混匀，取4 ug DNA加入到0.1毫升DMEM中，混匀。
5、将已溶解的PEI（PEI一定要最后加入）吹打混匀，取12ul加入0.1毫升DMEM中，将PEI、DNA、DMEM三者轻轻吹打混匀。
室温放置15分钟。
6、将三者混合物分多点加入到2个小时前换液的细胞，成十字形摇晃培养基。
cho细胞表达抗体
DHFR基因表达系统 Life Technology公司 Freedom CHO-S Kit
宿主细胞：CHO-s® Cells (cGMPbanked) 质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标 记基因，￥10000）
筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋 呤）
抗体真核高效表达策略
作用环节
抗体mRNA的转录、转录 效率与mRNA的稳定性是 其中最重要的因素
因此，抗体的表达量很 大程度上由质粒载体的 各表达调控元件及组织 方式决定
整合位点 基因剂量 转录 翻译 加工组装 分泌 其他
相应策略
弱化选择标致基因；染色体定位筛选 弱化的可扩增选择标志基因 强启动子、增强子、强转录终止信号、适宜的抗体基因结构 翻译型增强子，适宜的抗体基因结构 轻重链表达平衡，宿主细胞修饰 适宜的抗体分泌前导肽，适宜的抗体基因结构 选择适宜的宿主细胞、宿主细胞修饰，尽量去除非生产性克隆
GS系统
瑞士的Lonza公司
1992年，Bebbington等首次使用GS基因细胞系统表达重组抗体
Sigma、药明康德等公司都在自己 构建载体使用（只要知道载体的几 个原件可以自己全部合成）
宿主细胞：CHO-K1
质粒：PEE12.4
筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
PEE12.4
PEE12.4
GS（谷氨酰胺合成酶）筛选原理
CHO细胞表达抗体
基因工程抗体表达体系
CHO细胞 骨髓瘤细胞
CHO（Chinese hamster ocary）
CHO细胞生物技术产业化的首选细胞系 目前70%以上的治疗性抗体蛋白都是由CHO细胞产生的 ◆ 对蛋白质进行糖基化，其糖型与人类本一致 ◆ 不易传播人类病毒，比其他哺乳细胞基因组更容易进行改造和扩增 ◆ 遗传背景清楚、转染效率高、可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体 ◆ 利于抗体纯化：非分泌型细胞，本身很少分泌内源性蛋白；可用无血清培养
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MTX加压方法简介诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，己迅速成为制药工业中一个引人注目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20%以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研发的主要环节包括：基因克隆和工程菌构造；重组细胞培养；目的产物分离纯化等。
针对以上主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
目前已有多种表达系统应用于表达具有医疗价值的蛋白质，如大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒系统、哺乳动物细胞等表达系统。
大多数药用蛋白都是糖蛋白，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，部分药物已投放市场，例如EPO、G-CSF、组织型纤溶酶原激活剂t-PA、CD受体、单克隆抗体、乙型肝炎表面抗原、白介素、干扰素等。
影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，层次也很广泛，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。
转录是真核基因表达调节的基本控制点，研究表明：所有提高转录水平的策略主要通过载体构建、基因转染方法和选择不同标记来调控；CHO细胞表达体系和外源基因影响mRNA的翻译；表达细胞株的加压扩增，目的在于扩增外源基因的拷贝数，从而提高表达量；筛选表达细胞株，可获得稳定的、高表达的单克隆细胞株；大规模细胞培养中，血清、溶氧、二氧化碳、氨、乳酸的浓度以及剪切力影响细胞的生长、外源蛋白的表达和纯化。
深入了解和灵活运用各种影响因素，有助于重组蛋白在CHO细胞中的高效表达。
（一）CHO表达系统1. CHO细胞表达体系常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO-dhfr-。
CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。
改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。
为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。
向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。
2. 载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。
目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。
顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。
2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。
作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。
细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。
SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。
有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。
来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。
除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。
EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。
目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。
外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。
在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。
对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。
但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差别，因此我们认为在进行外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强启动子，才有可能获得较为理想的表达效果。
与启动子相连的是增强子元件，具种、组织特异性，CHO细胞中一般采用SV40和CMV增强子。
2.2选择标记和基因扩增CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。
一类是neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。
另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。
外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。
dhfr基因扩增系统最常用，当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后，或携带dhfr基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-dhfr-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。
进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与dhfr串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。
更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。
但它也有缺陷，表达细胞仅限dhfr缺陷型细胞，重复筛选抗性细胞费时费力，去除选择压力后，扩增基因不稳定。
细胞遗传学表明，在选择压力下，扩增基因的大小和结构处在不断变化之中。
在细胞分裂的不同时间，不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围处于不断变化之中，从100～1000kb。
即使是同一种细胞，选择过程不同，基因扩增的范围也不同。
谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，但细胞长期连续培养时，生长状况不佳，DHFR系统表达水平虽较GS系统低，但细胞生长稳定。
基因扩增还可通过弱化选择标记基因表达来达到。
弱化选择标记基因的表达，在使用与常规的表达载体相同的选择压力时，dhfr基因拷贝数更高，外源基因的表达水平也得到提高。
如一种双顺反子载体将dhfr基因连在外源基因的3′端，从而位于外源基因3′端下游的dhfr 基因的翻译起始效率大大降低，dhfr基因表达被弱化。
另一种载体将dhfr基因插入人工合成的内含子内部，两边为剪接供体SD和剪接受体SA，外源基因在内含子的下游，mRNA 剪切时，95%的dhfr mRNA被剪切掉。
也有一些表达质粒不含选择基因，则必须共转染一个可表达选择基因的标志质粒，如pSV dhfr,该质粒由Psv2 dhfr去除SV40的增强子构建而成，起到弱化dhfr基因表达的作用。
2.3其它表达载体引入天然或人工合成的内含子序列，有利于外源基因组DNA转录的mRNA剪接内含子，增加稳定性，提高翻译效率，许多真核表达载体带有SV40的内含子。
但因大多数插入的外源基因是cDNA，所以一般也用不着剪接信号。
真核基因的mRNA加工需要多聚腺苷酸加尾信号（pA），实验表明，除去pA后，外源蛋白表达量降低90%。
目前多采用SV40的晚期及早期pA、牛生长素基因的pA和人工合成的pA。
3. 外源基因启动子之后是克隆的基因组DNA或cDNA。
基因组DNA比cDNA表达量要高，应尽量使用基因组DNA。
除此之外，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：(1)在基因起始密码子的前后设置Kozak序列，即GCCGCCA-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的嘌呤。
具有Kozak序列与否，翻译起始强弱会有一个数量级的差异；(2)尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5′未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3′未翻译区对mRNA 稳定性的不良影响；(3)拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌蛋白的输出等；(4)在不改变蛋白氨基酸序列的前提下，修饰个别基因的编码序列，解决密码偏性问题。
实际表达中，可根据表达效果，对基因加以改造，以提高表达量。
4. 表达克隆的筛选不同的细胞克隆，外源蛋白表达水平高低不同，原因可能有二方面，一是外源质粒片段整合入细胞染色体的位置不同，有的区域转录活性高，有的转录活性低；二是不同的细胞克隆，质粒的拷贝数是不同的。
挑选高表达的单克隆细胞株一般采用两种流程：第一种方案首先通过检测外源基因的表达，逐一筛选dhfr阳性单克隆，再转到浓度持续升高的MTX之下生长，分别进行扩增；另一种方法先把dhfr阳性单克隆合并，在不断升高的MTX之下加压扩增外源基因的表达，最后挑出稳定的、高表达的单克隆细胞株。
加压扩增外源基因表达，除了单纯使用dhfr扩增系统或GS扩增系统外，也可采用G418与MTX联合作用细胞，G418与MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）联合作用细胞，或者利用dhfr扩增系统与GS扩增系统共加压。
混合克隆的表达水平远赶不上表达较高的单个克隆，这是因为转染的CHO细胞中存在不表达或低表达的非生产细胞，并可在长期生存，甚至MTX加压时占生长优势，排斥其它高表达细胞，成为细胞群体中的主要部分，导致产量严重下降，并对MTX加压无反应。
当撤除MTX，会发生外源蛋白表达量下降的情况，原因也可能在此。
5. 工程细胞大规模培养细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。
它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。
常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、检测和记录。