细胞培养板的选择和使用

细胞培养板的选择和使用（四）

点击次数：1678 作者：clearair00 发表于：2008-07-23 10:32转载请注明来自丁香园

来源：丁香园

（一）培养板的清洗和消毒

培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。

问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作?

答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。

我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。

其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：）

我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。

我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板

子，也不是很贵。

我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。

永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。

紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？

板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！

泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。

1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。

2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。

(二)方法讨论

细胞培养板常用来进行不同的处理效应观察，有些检测可能直接就在培养板中进行，这里面有些什么样的经验或小窍门呢？

1．细胞培养与MTT

问:做MTT时，96孔培养板细胞浓度该是多少？

答:我觉得细胞的浓度并不需要那么精确，关键是接种于每孔的细胞数就大致处于同一水平。

比如我做MTT，起初用的细胞浓度为5000/ml，每孔100ul，培养3天观察，发现细胞数太少，各孔OD值反面难于比较。后来我换用10000/ml，结果就很好。

当然细胞数也不能太多，这其实取决于你细胞的生长速度，生长快的细胞，可接种浓度低点。这主要是使细胞增殖率不致受处理因素之外的其他因素影响，比如接触抑制，营养竞争。

总之，做MTT时细胞数应较低，目的就是为了排除其他因素的影响，以使每孔细胞生长情况尽可能地反映出处理因素的影响。

细胞接种的浓度和你的实验目的、要求、细胞种类、处理因素的特殊要求都有关系。没有简单的，每孔接种多少的一个标准。当然，可以用楼上建议的浓度开始摸索。同时，注意肿瘤细胞核正常细胞的生长数度也不一样，前者生长快，后者慢，细胞数的量也有讲究。到底多少合适，得根据你的实验具体要求来摸索。我做b16转染时，因为脂质体要求细胞融合度为30%-50%，曾经没孔接种过300-500个细胞，效果非常好，

问:我做的MTT为什么同一组的两孔差别那么大呢？做了两次都是这样！

答:产生差别的原因有多种

1.在加细胞时，细胞沉淀下来，导致两孔细胞数不同。我们通常用磁力转子对细胞缓慢搅拌，时刻保

持细胞处于悬浮状态。

2.96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。

对于生长较快的细胞，例如每12小时到24小时就传代一次的细胞，应该起始浓度低一些，我一般是96孔板每孔加10 4个细胞，培养液每孔加200ul。

有些细胞生长较慢，例如72小时才传代一次，或者是原代细胞，起始浓度应高一些，我一般是96孔板每孔加2X10 4个细胞，培养液每孔加200ul。

问:96孔板培养板能否代替酶标板测吸光度？是可以拆成一条一条的那种好还是不可以拆的好？

1.最好是用酶标板，因为96孔板的各孔透光性不一致;

2.拆成一条条的方便使用一些。

MTT法计数细胞的相对数，可以对96孔板培养的细胞在用药物刺激后的直接计数；也可以把细胞制备成细胞悬液，加到96孔板中，然后加MTT孵育、计数。

所以，如果是前者，必须用培养板；如果是后者，可以用酶标板。平底的，酶标板好一些。

问：我的干预因素是乳剂（白色），对结果可能会有影响吧，如何才能减少这些干扰?

答：当然可以用，如果你害怕干扰因素对实验产生影响，那么建议你设定一空白调零孔，如100ul

的培养基加上10ul的药物，测定的样品吸光度减去空白调零孔即可！

测单一时间点的OD值，直接在培养板里就是了。测不同时间点的，需要在不同的培养板里。细胞在培养板里侧就是了。干扰因素可以测前离心一下。