第六章、基于全基因组序列的高通量基因克隆

点突变的M2单株混合群体可以作为 一种研究资源供社会共享，用于研究感 兴趣的基因有无发生突变。只要将感兴 趣基因的序列输入，在突变系列库中查 找这一基因有无突变体的存在。如果有 就可以索取对应的突变体植株。
用这一载体总共产生了13，450个T-DNA 插入系。GUS的组织化学检测表明GUS着 色频率比不带增强子的载体高二倍。增 强子插入位点附近的基因表达明显增加。 因此用pGA2715转化的系既可用gus报告 基因筛选启动子，又能产生功能获得 （gain-of-function）突变。
第三节、 TILLING （Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）
第六章、基于全基因组序列的 高通量基因克隆
பைடு நூலகம்
第一节、 概述
• 拟南芥菜和水稻的基因组测序已经完成， 玉米、小麦等主要农作物的基因组测序 工作也已启动。在许多作物中已获得了 大量的表达序列标签（EST）信息。利用 这些丰富的序列信息可以大大加快功能 基因的鉴定、遗传机理的探索等。
各种生物的基因组序列完成以后， 一般都可以从Internet网上获得，同时发 展了许多新的技术来利用、开发这些序 列信息，这从更本上改变了人们探究生 物学的方法和途径。反过来，这些新的 技术与方法的应用又加快了人们对一些 主要作物的改造。将来生物领域会怎样 发展很难预计。
Identification of an R gene by inactivation with transposons
当含有Ds的转基因植株同含有Ac 的转基因植株杂交后，在后代中可以观 测到高频率的突变体，包括生长、形态 发育、开花期、抗性等的变化。首先要 确定这些变异是否由Ds引起。Ds转座频 率在后继世代大大下降。
所以基因组序列完成之后，接下来的是大规 摸功能基因的鉴定。已明确构成被子植物基因 组最基本的约20，000～25，000功能基因。 高通量功能基因克隆：通过插入失活的方法 产生大量的突变体，特别是在拟南芥菜、水稻 、玉米、矮牵牛花和金鱼草中。对插入位点的 旁邻基因组序列进行克隆，通过计算机搜索可 获得导致突变性状的基因序列。
6.2.1. T-DNA标签
在拟南芥菜中，许多基因通过T-DNA 标签的突变系被分离到。 在美国University of Wisconsin已建立 了含60，480个拟南芥菜T-DNA标签系的 群体。 在水稻中也用类似的方法获得T-DNA 标签系，因为T-DNA是随机插入，又可以 多代遗传，估计需要471，000个T-DNA标 签系才有99％的可能性在任一基因中含有 T-DNA插入。
在水稻中通过农杆菌介导将Ac/Ds 系统导入到水稻中，在Ac存在的情 况下，80％Ds可以从原来位置上切 离，配子中的切离频率不超过40％， 能产生大的突变体群体。
6.2.3. 反转座子标签
水稻中内源因子Tos17可以在组织培 养过程中被激活，拷贝数可扩增到30个。 用Tos17的基因knockout系统被发展 起来。Tos17倾向于插入到基因区，插入 频率比非基因区高二倍。通过这一方法 已克隆到水稻homeobox基因OSH15，水 稻光敏色素A等。
第三节、 基因陷阱（Gene Trap）
• 报告基因（reporter gene）的插入产 生融合基因，融合基因可用来检测 单个基因的表达。通过这样方法， 根据基因在不同时间和不同条件下 的表达谱来分离基因。因为插入 DNA的序列已经知道，这一序列可 用作“标签”很容易分离到基因。
报告基因用来构建三种基本的基因 陷阱载体：增强子陷阱、启动子陷阱 和基因陷阱。每一种类型能应答插入 位点的顺式作用调控序列。
通过突变方法分析基因功能的主要 限制是 1）许多基因由多个拷贝组成，拷 贝紧密连锁且功能互补，很难产生功 能失活突变体； 2）对于致死突变和不育突变都无 法获得稳定的突变后代，也就无法克 隆基因。
基因芯片和Micrroarray：理论上，基因组 上所有基因的DNA序列可以被放到一个小的 固体支撑物上用来同标记的RNA进行杂交。 这样，我们可以获得每个基因对病原菌、害 虫、干旱、低温、盐碱、光周期、和各种环 境因子变化等的反应。 同样，我们可以获得大量的有关发育过程 中基因的表达变化。所有这些信息在研究基 因的功能、生理生化的机理等都非常有用。
在建立T-DNA标签系群体时最大的困 难是在当代获得足够数量的种子，可能 是由于T-DNA插入的致死效应导致育性 很低。T-DNA插入造成的功能改变常常 是隐性的，突变性状可以在分离后代中 观测到。
分析了1，600个标签系的T2代后， Jeon等人发现了各种突变的性状：最多 的 是 矮 秆 性 状 （ 7.0% ） 和 叶 色 突 变 （9.5%），苗期死亡的占1.1%，生殖器 官 也 有 少 量 变 异 ， 如 depressed paleae, filamentous flowers, extra glumes, long sterile glumes 等 。 约 1.8% 完 全 不 育 ， 0.2%提前开花、0.1%推迟开花。
在拟南芥菜中发展出了一种称为激活标 记系统（activation-tagging），已克隆了 若干个基因。这套系统是用T-DNA载体， 在其右边界整合多个CaMV35S增强子。 在拟南芥菜的激活标签库中，Weigel等 鉴定出了30多个各种性状的显性突变， 对一组突变体的分析表明增强子插入位 点附近的基因过量表达。
目前从各种作物中已获得大量的EST序列， 这些序列在模式植物和研究植物之间作为一 种基因同形体（isomorphisms），提供一种 跨基因组差异的平台，来利用模式作物广泛 的序列信息。如，在与某一功能相关的基因 被克隆到以后，就可以用它在其他作物中找 到同根基因（orthologs）。
各种显花植物大量EST的产生以及水稻、 拟南芥菜等基因组序列的完成，就有可能来 研究高等植物基因组序列的相似性。 大多数的基因在不同的高等生物中表现 出核苷酸序列和氨基酸序列的相似性。很少 有编码蛋白的被子植物基因在拟南芥菜和水 稻中没有同根基因（orthologs）。 高等植物发育上的差异可能主要是由于 转录调控因子反式调控序列的变化。
6.2.3. 激活标签（activation tagging）
传统的T-DNA或转座子插入使基因失活， 这些方法在研究冗余基因的功能时就不 敷应用，也无法分离那些功能失活后会 造成早期致死、雌雄配子败育的基因。 在拟南芥菜中，少于10％的基因标签会 产生可见的性状变异，因此必须用其他 的方法来分离功能基因。
植物基因组的大小差别很大，基因组大 小的这种差异主要是由重复序列造成。被子 植物中所必须的基因数目不会差异很大。 这可从禾谷类作物的基因组分析中看出来， 禾谷类不同作物的基因组差异很大，如水稻 的基因组只有玉米的20％、小麦的3％，而基 因组成和顺序存在着广泛的同线性。从水稻 中获得的基因序列信息可以用来从其他禾谷 类作物中分离相对应的基因。
TILLING方法：种子用EMS处理发生 诱变，当代植株（M1植株）自交，M2代 单株的DNA样本用来突变筛选，同时将 它们的种子分别储存。单株DNA样本混 合、DNA混合池排列到96孔板上用于基 因特异的PCR筛选。
PCR产物同一内切酶（CELI）混合、切 割双链中不配对的碱基。切割后的产物在 自动测序仪上电泳，分析条带。 不同的双链末端可以标上不同的染料 用来准确、快速鉴定条带。 一旦当在某一DNA混合池中检测到突变 后，进一步筛选组成这一DNA混合池的单 个DNA样品直到确定相应的突变个体。
在某些情况下，基因结构和表达上的细微 变化会导致在性状上的巨大变化。 如高等植物中总共可产生200种脂肪酸，这 些脂肪酸的变化主要在双键（double bond）、 羟（基）氢氧基（hydroxyls）环氧基团 (epoxy groups)、三键 (triple bond)。这些功能基团有 一组非常相似的脂肪酰去饱和酶（fatty acyl desaturase-like enzymes）合成。研究表明只要 有4个氨基酸的替代就可以将去饱和酶转化为 脱氢酶。
第二节、高通量克隆植物功能 基因－基因标签法
在若干种植物中已通过转座子插入使基 因失活来研究基因的功能。用转移DNA（TDNA）作为诱变剂（mutagen）来标签基因已 在拟南芥菜上发展起来。T-DNA的插入是一 个随机事件，插入后可以稳定遗传。
插入突变在功能基因研究中已成为一种 非常诱人的方法，因为已发展了若干种成熟 的方法来分离插入二侧的基因组序列，建立 侧翼序列库。
在分离插入位点的侧翼序列时，首先 必须确认分离后代的各种突变性状是否 由T－DNA插入造成。只有当突变的性 状与T-DNA的插入共分离时，再来分离 侧翼序列。
6.2.2. 转座子标签
转座子标签已成为非常有用的工具来分 离新的基因。第一个成功分离植物基因的是 通过Ac/Ds（Activator-Dissociation）转座系 统。 其他的转座系统，如En/Spm （Enhancer/Suppressor-mutator）和Mu （Mutator）被用来克隆若干个玉米基因。
在增强子陷阱中，报告基因与启动 子的TATA框和转录起始位点相融合，此 时的少量启动子序列不会引起报告基因 的表达，但是，当附近有增强子元件时 启动子被激活使报告基因表达。
启动子陷阱和基因陷阱含有无启动子 的报告基因，因此只有当插入到转录单 位且方向相同时，报告基因的表达才有 可能发生。 启动子陷阱中，报告基因插入到exon 时才表达，相反，基因陷阱中的报告基 因带有剪接序列，当插入到intron中时才 表达。
基因陷阱提供了很有效的方法来鉴 定基因，因为这一系统是建立在报告基 因表达基础上的，不需要突变的性状， 因此在分离传统方法上很难分离的二类 基因上很有用：1）功能冗余的基因；2） 在不同发育阶段上起功能的基因（各个 发育阶段上的基因发生突变的话很可能 导致致死突变）。
最近，Jeong等人又开发出了新的 T-DNA载体，pGA2715，这一载体具有启 动子陷阱和激活标签二种特性。这一载 体在右边界含有一个无启动子的GUS报告 基因。另外，有多个35S增强子位于左边 界。
• 这是一种高效的用反求遗传学的方 法来研究功能基因，它可以大范围 筛选通过化学方法诱导的突变体， 适用于拟南芥菜和其他各种植物。
上面我们介绍的基因失活是外源DNA插入后引 起，所以易导致致死突变。这一方法中用化学 诱变剂处理只引起点突变，产生一种传统意义 上的等位基因系列，这种亚致死等位基因只引 起性状的变异，不会导致死亡，所以对于研究 一些必须的基因特别有用。 化学诱变剂处理的另外好处是突变的频率高、 不需组织培养等过程。这一方法中最关键的问 题是必须能灵敏检测出点突变。
基因组中有很多大的基因家属，如 细胞色素P450（参与多糖的生物合成）， 抗病相关的基因、转录因子、蛋白激酶、 磷酸化酶等。要解决的主要问题是确认 基因家属某一具体成员的确切功能。
通过同源比较的方法（BLAST Search） 可以大致预测54％基因的功能，然而仅仅通 过预测还远远不能确认这一基因在生物体中 的具体功能。 如通过序列的分析，约13％的拟南芥菜 基因推测与转录和信号传导有关。然而知道 某一基因编码激酶或转录因子并不能提供任 何有用的信息来说明这一基因控制什么样的 生理生化过程。