第4节 植物体细胞

第4节植物体细胞杂交

单克隆抗体技术:1975年，著名免疫学家米尔斯坦和同事勒尔在英国剑桥大学分子实验室内巧妙地把B淋巴细胞和能无限生长的骨髓细胞合并成一个杂交瘤细胞。杂交瘤细胞因而具备了双重特性：既能无限生长，又能产生B淋巴细胞的抗体。当杂交瘤细胞注射进老鼠的腹腔后，它就能产生一种特异性抗体。单克隆抗体应用十分广泛，被人们誉为对付癌症的“生物导弹”。

1 概述

体细胞杂交(原生质体融合):是指不同遗传背景的原生质体之间经融合而产生杂种细胞的细胞工程技术，它能使有性杂交不亲和的亲本之间进行遗传物质(包括核基因和胞质基因)的重组。

体细胞杂交程序主要包括三个步骤

材料选择与原生质体制备

原生质体融合

杂种细胞的筛选与培养

1.1 意义

①克服植物有性杂交不亲和性是非常有效的

②不仅不同亲本细胞核物质组合到一起，而且细胞质组合到一起

1.2 成就

1972年Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。

据统计，目前已有49个科，160个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。

木本植物中柑桔最为成功。

番茄+马铃薯

2 原生质体的融合

2.1融合方法

（1）化学法诱导融合（PEG）

（2）电融合法

（1）PEG法

PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）

1974年：

Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。

1976年：

Kao发现结合用高pH和高Ca2+结合融合频率更高。

用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。

PEG的作用机理：

由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

PEG诱导融合的特点：

优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。

其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

（2）电融合法

1981年：Zimmerman发明电隔合仪，并首先提出电融合概念。

交流电使原生质体排成串珠

直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿

与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：

一是不存在对细胞的毒害问题；

二是融合效率高；

三是融合技术操作简便。

电融合仪的结构特点：

一是交变电场部分；

一是高频直流电击部分。

电融合的基本过程：

细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；

膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。

电融合法原理

交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠

施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流

2.2 融合细胞类型

根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：

对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。

非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种：

3 体细胞杂种细胞鉴别筛选

（1）利用显微镜筛选：根据亲本的原生质体大小、颜色的差异筛选杂种细胞。

亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记

亲本2：碱性蕊香红荧光素标记

在荧光显微镜下，亲本1为绿色，亲本2为红色，杂种细胞可以区分

（2）互补选择法（两次不同培养条件的培养）

第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。

转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生长，甲原生质体死亡。

两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞。

如：

亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代

亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长

杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡

（3）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体

细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。

生化鉴定：同功酶鉴定。

分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。

分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质

再生植株同时具有亲本的带；

再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在另一种情况下具有另一个亲本的带。

第5节合子胚培养

胚发育和种子结构

1 胚培养概述

定义：植物胚胎培养是胚及胚器官（如子房、•胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。•包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。 培养对象胚胎发生过程中的不同发育时期的胚和具胚的器官。如：成熟胚、幼胚、胚珠培养、子房培养。

1.1胚胎培养的意义

⑴克服远缘杂种的不育性在高等植物的种间和属间胚败育，•胚发育不全而不能正常萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。

⑵使胚发育不全的植物获得后代如兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6～7个细胞，多数胚不能成活。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。

⑶缩短育种年限在杂交育种中，•应用胚培养技术可以缩短育种周期1～2年。

2 胚培养类型

离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，•一般可分为成熟胚和幼胚培养。

双子叶植物胚的简要发育过程