荧光光谱

1.荧光介绍 1.荧光介绍
1）荧光产生及其物理机制 ）
荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一 能量较低的光， 荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光 旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。 旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光 和发射光频率之差称为斯托克频移。 和发射光频率之差称为斯托克频移。 满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽， 满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽， 射线到红外光谱区仍然是荧光 仍然是荧光。 从X射线到红外光谱区仍然是荧光。 其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等） 其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等） 也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。 也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如： 钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。 钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。
F=Fe 0
公式中的τ即为荧光寿命 公式中的 即为荧光寿命
−t / τ
荧光寿命和量子产率示意图
Γ Q= Γ + knr 1 τ= Γ + knr
Q为量子产率，Γ为荧光发射速率，knr为 为量子产率， 为荧光发射速率， 为量子产率 非辐射转移速率, 为荧光自然寿命 为荧光自然寿命.通常 非辐射转移速率 τn为荧光自然寿命 通常 量子效率和波长相关， 量子效率和波长相关，但生化的荧光通常 和波长无关。 和波长无关。
2).荧光光谱的特征 2).荧光光谱的特征 a.Stokes位移 Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 。 发射光谱的波 长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 . 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量( 电子跃迁到不同激发态能级 ， 吸收不同波长的能量 ( 如 能级图λ 2 ,λ 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重 ，产生不同吸收带， 态的最低振动能级再跃迁回到基态， 态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光 (如λ ‘2 )。 如 。 c. 镜像规则 . 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（ 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。 一样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布与第 一激发态上的各振动能级分布类似 （振动波函数一样）； 振动波函数一样） 基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。 迁也然。
1）荧光光谱仪 ） 光源
3 .荧光光谱仪及使用 技术 .荧光光谱仪及使用
激发单色器 样品池 检测器
−e
−kc( x+dx)
] = I0kce dx
−kcl
−kcx
溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。 溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。
F = A∫ dI = AI0 ∫ kce dx = AkI0[1− e ]
如果kcl<<1 进行展开， 如果kcl<<1，进行展开，有 kcl<<1， (kcl)2 (kcl)3 e−kcl =1− kcl + + + ••• ≈1− kcl 2! 3 !
µa
I
µe
X F∥
Z
Y F⊥
3r + 2 p= 2+ r 2p r= 3−p
5. 荧光实验方法及其用途
荧光猝灭 荧光各向异性 荧光能量共振转移 时间分辨荧光光谱 荧光标记 双光子荧光光谱
1）.荧光猝灭
荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。 荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。 狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶 质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。 质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。 原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起 原因： 荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。 荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。 卤素离子、重金属离子、氧分子都是猝灭剂。 卤素离子、重金属离子、氧分子都是猝灭剂。 研究主要集中在可测量的“狭义荧光猝灭” 研究主要集中在可测量的“狭义荧光猝灭”。 生化方面主要应用猝灭现象指示分子之间的相互作用。 生化方面主要应用猝灭现象指示分子之间的相互作用。 揭示发色团和猝灭剂的接近程度， 揭示发色团和猝灭剂的接近程度，反映发色团在蛋白和 膜上的局域位置， 膜上的局域位置，质子的通透性和膜的通透性 。 碰撞猝灭可以用来确定猝灭及的扩散系数。 碰撞猝灭可以用来确定猝灭及的扩散系数。 采用Stern-Volmer方程来解释 采用 方程来解释
2.常用荧光光谱 2.常用荧光光谱
荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类 荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 荧光的激发光谱， 1）荧光的激发光谱，发射谱 激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发 激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发 ), 射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。 激发光谱曲线的最高处， 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多 ，荧光强度最大； 荧光强度最大； 荧光的发射谱：固定激发波长， 荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波 长的关系。 长的关系。
2）荧光的应用
荧光发光分为内源荧光 外源荧光。 荧光发光分为内源荧光和外源荧光。 内源荧光和 外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋 外源荧光应用很广， 白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、 白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区 大小、粘性、分子间距离等。 大小、粘性、分子间距离等。 荧光寿命和量子产率： 荧光寿命和量子产率： 荧光猝灭： 荧光猝灭： 荧光能量共振转移： 荧光能量共振转移： 时间分辨荧光光谱： 时间分辨荧光光谱： 荧光各向异性： 荧光各向异性： 荧光量子点标记，转基因荧光标记 荧光量子点标记， 双光子荧光光谱
（1）碰撞猝灭分析 Lackowicz “Principle of fluorescent p237spectroscopy”Chapt 8, p237-p265 碰撞猝灭的Stern 碰撞猝灭的Stern-Volmer 方程 SternF0 / F =1+kqτ0 [Q]＝1＋KD[Q] [Q]＝ 其中k 其中kq是猝灭速率 τ0 是无猝灭剂存在时的荧光寿命 [Q]是猝灭剂的浓度 [Q]是猝灭剂的浓度 F0/F～[Q]曲线。单一线性猝灭曲线预示所有发色团 /F～[Q]曲线 曲线。 和猝灭剂是具有相同的可接近性。 和猝灭剂是具有相同的可接近性。如果其中有一种不可接 近，则Stern-Volmer曲线不是线性的。 Stern-Volmer曲线不是线性的。 曲线不是线性的
第3讲 荧光光谱
1. 2. 3. 4. 5.
荧光是怎么产生的？有什么用途？ 荧光是怎么产生的？有什么用途？ 常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？ 常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？ 荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪 荧光强度和物质浓度是什么样的关系 还有哪 些因素会影响到荧光强度？ 些因素会影响到荧光强度？ 荧光光谱的有哪些光谱参数？ 荧光光谱的有哪些光谱参数？ 有哪些实验方法？ 有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么 用途？ 用途？
τn = 1/ Γ
（ 2). 荧光各向异性
荧光偏振： 荧光偏振： 荧光偏振（参数）： 荧光偏振（参数）： p=(F∥ p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥) (F∥ +F⊥ 荧光各向异性: 荧光各向异性: γ=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +2F⊥) =(F∥ (F∥ +2F⊥ p和γ同时描述荧光偏振。 和 同时描述荧光偏振。 从对称性考虑， 从对称性考虑，Fx=Fy, 通常用γ 通常用γ描述荧光偏振 各向异性与偏振度转换： 各向异性与偏振度转换：
内转换 S2 S1 能 量 吸 收
内转换 振动弛豫 系间跨越
T1 发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
λ
λ2
λ ′2
λ3
a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10 a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时， 此时， 光吸收 荧光分子处于激发态 激发态。 荧光分子处于激发态。 b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用， b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射 激发态的分子由于内部的作用 内转换 跃迁过渡到低的能级 过渡到低的能级。 跃迁过渡到低的能级。 c)外转换：处于电子激发态 c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的 激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的 外转换 作用，以及能量转移 能量转移， 作用，以及能量转移，过渡到低的能级 d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子 d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子 荧光发射 激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态 的分子将以辐射的方式回到基态， 激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命 约为10ns左右。 10ns左右 约为10ns左右。 e)系间转换：不同多重态 有重叠的转动能级间的非辐射跃迁 e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 系间转换 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋 轨道耦合进行。 轨道耦合进行 f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振 ）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。 动弛豫的时间10 动弛豫的时间 -12 s。 。
3）.荧光光谱的环境效应 ） 荧光光谱的环境效应
4. 荧光光谱参数
1）荧光光谱参数： ）荧光光谱参数：
（1) 荧光寿命和荧光量子产率 去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是 去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失， 以指数形式衰减。 以指数形式衰减。定义荧光强度降低到激发状态最大荧 光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。 1/e所需要的时间称为荧光寿命 光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。荧光寿命是个 很重要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。 很重要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。 荧光寿命方程： 荧光寿命方程：
发射单色器
检测器 荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。 荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背 景是没有入射光， 暗背景” 因此灵敏度更高。 景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏度更高。
2）荧光强度和溶液浓度的关系
I0
薄层吸收的光强为： 薄层吸收的光强为：
dF
−kcx
dI = I0[e
−kcx
样品池长度通常为1cm 样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为 1cm，
F' = K'φI0εc
荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。 荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。 原因可能是： 原因可能是： a 浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。 浓度增加，分子碰撞机会增加 增加了非辐射损耗 碰撞机会增加， 非辐射损耗。 b 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光） 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光） 。（内滤光 c 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收） 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收） 。（自吸收 d 仪器原因
（2)静态猝灭 2)静态猝灭
荧光发色团和猝灭剂形成不发荧光的复合物， 荧光发色团和猝灭剂形成不发荧光的复合物，吸收光以 以无辐射跃迁的形式回到基态。 后，以无辐射跃迁的形式回到基态。 [FQ] 解离常数为： 解离常数为： Ks = [F][Q]
F0 = [F] +[FQ] [F0 ] −[F] Ks = [F][Q] F0 =1+ Ks[Q] F 与动力学猝灭的形式相仿， 与动力学猝灭的形式相仿，然而荧光寿命并没有发生改 静态猝灭也是和猝灭剂呈线性关系， 变。静态猝灭也是和猝灭剂呈线性关系，因此需要通过改变温 度或测量荧光寿命来区分。 T/η 因为和扩散系数相关） 度或测量荧光寿命来区分。kq～T/η（因为和扩散系数相关）