流式细胞技术课件
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For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signal
For Pure PE+ cells, = FITC signal - % PE signal
FITC
After compensation
PE+ cells
GOOD compensation: Y-mean of the FITC cell = the Ymean of -/- cells
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以 90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
测得的FS与SS信号通过 计算机处理，可得到FS-SS 图，由此可仅用散射光信 号对未染色的活细胞进行 分析或分选。 此为血细胞分类的基本原 理，但不能分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
荧光补偿
每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发 射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正 荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。
FITC APC
PE
PerCP/Cy5.5
荧光补偿
PE+ cells
PE
FITC + cells
To do colour compensation:
X-mean of the PE cell = the X-
PE
mean of -/- cells
FITC + cells
PE+ cells
OVER compensation
PE FITC + cells
FITC
FITC
细胞分选
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
部结构）、化学特性（如DNA、RNA）的多参数测量，并具有明 显的统计学意义； ➢ 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、 显微荧光光度技术、分子生物学技术、免疫学技术、流体力学、 细胞化学、图像技术等众多领域的知识和成果； ➢ 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
➢ 液流系统 ➢ 光学系统 ➢ 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染
色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样
本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其 靠近孔壁而阻塞喷孔。
应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药 理学，遗传学及临床检验学等
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性
胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、流式细胞技术原理
1、流式细胞仪的基本结构：
液流系统示意图
Injector Tip Shealth Fluid
Fluorescence Signal Focused Laser Beam
样本管
鞘液管
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
第15章 流式细胞技术的原理和应用
陈鲤翔 副教授 Email：lxchen@zzu.edu.cn
流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其 他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定 量分析和分选的技术。
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细 胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展 起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液 中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的 百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测 量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞 的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
光学系统示意图
光信号的测定
• 散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向
散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗 粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAria
FACSCount
LSRII
FACSCanto
Βιβλιοθήκη Baidu
FACSVantage
Beckman公司流式细胞仪
Gallios流式细胞仪
Navios流式细胞分析系统
MoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统
流式细胞术的特点
➢ 测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； ➢ 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
荧光测定
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电 倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
流式细胞仪的发展史
➢ 30年代：设想使细胞检测自动化 ➢ 50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞
成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选 ➢ 70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术 ➢ 1973年：第一台商用流式细胞仪FACS I ➢ 发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提
高电子信号的处理能力等
For Pure PE+ cells, = FITC signal - % PE signal
FITC
After compensation
PE+ cells
GOOD compensation: Y-mean of the FITC cell = the Ymean of -/- cells
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以 90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
测得的FS与SS信号通过 计算机处理，可得到FS-SS 图，由此可仅用散射光信 号对未染色的活细胞进行 分析或分选。 此为血细胞分类的基本原 理，但不能分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
荧光补偿
每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发 射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正 荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。
FITC APC
PE
PerCP/Cy5.5
荧光补偿
PE+ cells
PE
FITC + cells
To do colour compensation:
X-mean of the PE cell = the X-
PE
mean of -/- cells
FITC + cells
PE+ cells
OVER compensation
PE FITC + cells
FITC
FITC
细胞分选
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
部结构）、化学特性（如DNA、RNA）的多参数测量，并具有明 显的统计学意义； ➢ 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、 显微荧光光度技术、分子生物学技术、免疫学技术、流体力学、 细胞化学、图像技术等众多领域的知识和成果； ➢ 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
➢ 液流系统 ➢ 光学系统 ➢ 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染
色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样
本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其 靠近孔壁而阻塞喷孔。
应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药 理学，遗传学及临床检验学等
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性
胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、流式细胞技术原理
1、流式细胞仪的基本结构：
液流系统示意图
Injector Tip Shealth Fluid
Fluorescence Signal Focused Laser Beam
样本管
鞘液管
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
第15章 流式细胞技术的原理和应用
陈鲤翔 副教授 Email：lxchen@zzu.edu.cn
流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其 他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定 量分析和分选的技术。
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细 胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展 起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液 中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的 百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测 量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞 的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
光学系统示意图
光信号的测定
• 散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向
散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗 粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAria
FACSCount
LSRII
FACSCanto
Βιβλιοθήκη Baidu
FACSVantage
Beckman公司流式细胞仪
Gallios流式细胞仪
Navios流式细胞分析系统
MoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统
流式细胞术的特点
➢ 测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； ➢ 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
荧光测定
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电 倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
流式细胞仪的发展史
➢ 30年代：设想使细胞检测自动化 ➢ 50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞
成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选 ➢ 70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术 ➢ 1973年：第一台商用流式细胞仪FACS I ➢ 发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提
高电子信号的处理能力等