流式细胞技术课件
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流式细胞术课件
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞技术讲义优秀课件
▪ Performance in a 96-well plate has the following advantages:
Washing process is much easier and faster
tubes: washing requires centrifugation 200g 5mins
流式细胞技术讲义
Needs rise to the evolution of science and techology!
需求带来技术进步
液相蛋白的定量定性检测
Method for quantification of liquid protein
Com常mo用n 的M检eth测od方法 Is there a meth如od何th能a够t 一个样品同 can quantify mor时e 快th速an检测多因子
Content
Introduction Principle of Flowcytomix technology based on the Microspheres Advantages of flowcytomix technique Application of easy-to-use analysis software Introduction of Flowcytomix production
▪ Rat Th1/Th2 6plex (GM-CSF, IFN-g, IL-1a, IL-4, MCP-1, TNF-a)
BMS820FF BMS821FF BMS725FF
Vacuum Filtration Manifold
Filtration Manifold suitable
▪ PALL cat # P/N 5017
《流式细胞技术》PPT课件
完整版ppt
34
CBA(Cytometric Bead Array)
完整版ppt
35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
完整版ppt
完整版ppt
作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
140
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
《流式细胞术的原理》PPT课件
补偿不好调。 4. 尽量选择应用广、亮度高的荧光素 5. — 荧光素的强弱用Stain Index染色指数来表示，
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞技术荧光抗体课件
总结词
人工智能和大数据在流式细胞技术中具有广阔的应用前景，可以提高数据分析的准确性和效率。
详细描述
人工智能和大数据技术的应用可以实现对流式细胞数据更深入地挖掘和分析，提高数据分析的准确性 和效率。同时，这些技术的应用还可以帮助科研人员更好地理解细胞样本的复杂性和多样性。
06
案例分享：流式细胞技术在肿瘤免疫研究中的 应用
调整仪器参数，包括激光功率 、检测器灵敏度和补偿等，以 获得最佳荧光信号。
数据收集
收集细胞样品在流式细胞仪中 的荧光信号数据。
数据处理与分析
02
01
03
数据预处理
去除噪声和去除异常值，对数据进行清洗和整理。
数据分析
利用统计学方法和图形可视化工具对数据进行深入分 析。
结果解释
根据数据分析结果得出结论，回答实验问题或验证假 设。
3. 抗体标记细胞 4. 流式细胞仪检测细胞表面抗原表达
5. 数据处理与分析
研究方法与实验流程
研究方法 2. 通过单克隆抗体对目标抗原进行特异性识别和标记。
1. 采用流式细胞术对肿瘤组织样本进行细胞表面抗原表 达检测。
3. 采用计算机软件进行数据分析，获取各种细胞的表达 水平及比例关系。
数据处理与分析结果展示
荧光抗体的种类与选择
在选择荧光抗体时，需 要考虑以下几点
抗体的特异性：应选择 能够特异性识别目标抗 原的抗体。
抗体的敏感性：应选择 能够检测低浓度抗原的 抗体。
抗体的稳定性：应选择 能够在保存期间保持稳 定性的抗体。
荧光抗体的标记方法
直接标记：将荧光染料直接连接到抗体上，使其能够直接 与目标细胞结合。
荧光抗体在流式细胞技术中的优势与局限性
人工智能和大数据在流式细胞技术中具有广阔的应用前景，可以提高数据分析的准确性和效率。
详细描述
人工智能和大数据技术的应用可以实现对流式细胞数据更深入地挖掘和分析，提高数据分析的准确性 和效率。同时，这些技术的应用还可以帮助科研人员更好地理解细胞样本的复杂性和多样性。
06
案例分享：流式细胞技术在肿瘤免疫研究中的 应用
调整仪器参数，包括激光功率 、检测器灵敏度和补偿等，以 获得最佳荧光信号。
数据收集
收集细胞样品在流式细胞仪中 的荧光信号数据。
数据处理与分析
02
01
03
数据预处理
去除噪声和去除异常值，对数据进行清洗和整理。
数据分析
利用统计学方法和图形可视化工具对数据进行深入分 析。
结果解释
根据数据分析结果得出结论，回答实验问题或验证假 设。
3. 抗体标记细胞 4. 流式细胞仪检测细胞表面抗原表达
5. 数据处理与分析
研究方法与实验流程
研究方法 2. 通过单克隆抗体对目标抗原进行特异性识别和标记。
1. 采用流式细胞术对肿瘤组织样本进行细胞表面抗原表 达检测。
3. 采用计算机软件进行数据分析，获取各种细胞的表达 水平及比例关系。
数据处理与分析结果展示
荧光抗体的种类与选择
在选择荧光抗体时，需 要考虑以下几点
抗体的特异性：应选择 能够特异性识别目标抗 原的抗体。
抗体的敏感性：应选择 能够检测低浓度抗原的 抗体。
抗体的稳定性：应选择 能够在保存期间保持稳 定性的抗体。
荧光抗体的标记方法
直接标记：将荧光染料直接连接到抗体上，使其能够直接 与目标细胞结合。
荧光抗体在流式细胞技术中的优势与局限性
相关主题
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流式细胞仪的发展史
➢ 30年代：设想使细胞检测自动化 ➢ 50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞
成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选 ➢ 70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术 ➢ 1973年：第一台商用流式细胞仪FACS I ➢ 发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提
高电子信号的处理能力等
For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signal
For Pure PE+ cells, = FITC signal - % PE signal
FITC
After compensation
PE+ cells
GOOD compensation: Y-mean of the FITC cell = the Ymean of -/- cells
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
荧光测定
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电 倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAria
FACSCount
LSRII
FACSCanto
FACSVantage
Beckman公司流式细胞仪
Gallios流式细胞仪
Navios流式细胞分析系统
MoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统
流式细胞术的特点
➢ 测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； ➢ 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内
部结构）、化学特性（如DNA、RNA）的多参数测量，并具有明 显的统计学意义； ➢ 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、 显微荧光光度技术、分子生物学技术、免疫学技术、流体力学、 细胞化学、图像技术等众多领域的知识和成果； ➢ 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药 理学，遗传学及临床检验学等
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性
胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、流式细胞技术原理
1、流式细胞仪的基本结构：
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以 90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
测得的FS与SS信号通过 计算机处理，可得到FS-SS 图，由此可仅用散射光信 号对未染色的活细胞进行 分析或分选。 此为血细胞分类的基本原 理，但不能分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液 中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的 百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测 量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞 的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
液流系统示意图Injector Tp Shealth Fluid
Fluorescence Signal Focused Laser Beam
样本管
鞘液管
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
荧光补偿
每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发 射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正 荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。
FITC APC
PE
PerCP/Cy5.5
荧光补偿
PE+ cells
PE
FITC + cells
To do colour compensation:
第15章 流式细胞技术的原理和应用
陈鲤翔 副教授 Email：lxchen@
流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其 他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定 量分析和分选的技术。
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细 胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展 起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
➢ 液流系统 ➢ 光学系统 ➢ 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染
色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样
本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其 靠近孔壁而阻塞喷孔。
X-mean of the PE cell = the X-
PE
mean of -/- cells
FITC + cells
PE+ cells
OVER compensation
PE FITC + cells
FITC
FITC
细胞分选
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
光学系统示意图
光信号的测定
• 散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向
散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗 粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。