pTrcHis A大肠杆菌表达载体说明

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猪前胸腺肽α在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

猪前胸腺肽α在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定王錾彧;唐丽杰;乔薪媛;姜艳平;崔文;李一经【摘要】为原核表达具有生物活性的重组前胸腺肽α(proTα),本实验利用人工合成的330 bp proTα DNA编码序列,构建重组表达质粒pET-proTα,将其转化于大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,采用MTT方法测定重组蛋白对小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖的影响.SDS-PAGE结果显示proTα重组蛋白以可溶形式表达,分子量约32 ku.重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后获得具有生物活性的蛋白,在体外能够明显促进小鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖活性,与轮状病毒共同免疫小鼠能够提高轮状病毒VP6蛋白的特异性抗体水平,并提高抗原刺激下脾细胞分泌IFN-γ水平.本研究首次确认了proTα蛋白在小鼠体内具有佐剂活性,为proTα生物活性的进一步研究及其作为疫苗佐剂的开发奠定基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2015(037)001【总页数】4页(P53-56)【关键词】猪前胸腺肽α;大肠杆菌表达;生物学活性【作者】王錾彧;唐丽杰;乔薪媛;姜艳平;崔文;李一经【作者单位】东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S852.61前胸腺肽α(Alpha-prothymosin，proTα)是由胸腺上皮细胞和胸腺内分泌细胞产生的一种具有免疫调节活性的生物活性肽，因其N 端前28 个氨基酸与胸腺肽α1(Tα1)完整序列相同而得名，其基因序列在各物种间高度保守，人、牛、羊、猪等的proTα 均由109 个氨基酸构成[1-2]。

抗肿瘤新药一豹蛙酶在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化化

抗肿瘤新药一豹蛙酶微生物与生化药学（医）王娜108120105/12/2011随着医学的进步，普通传染病逐渐被控制，恶性肿瘤(癌症)成为目前最为常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。

抗肿瘤药物市场近年来呈逐年增长的势头，目前占世界药品市场总销售额的4．2％左右。

份额虽小，但进入20世纪90年代以来，由于肿瘤病人的总体增加趋势和肿瘤发病者的年轻化趋势，临床上对于新型肿瘤治疗药的需求量急剧上升。

豹蛙酶是一种抗肿瘤药物，属于核糖核酸酶A超家族，它的核糖核酸酶活性低，细胞毒性较强，在体内外对多种肿瘤具有显著杀伤作用，是目前全球正在重点研究的100种新药之一。

豹蛙酶英文名称为onconase，最早分离自北极豹蛙的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族。

1988年Mikulski等发现蛋白经过纯化和粗提，在体外能有效地抑制人下颚癌细胞株A-253、人白血病细胞HL-60和人腺癌细胞株Colo 320等的生长并能杀死细胞，通过体内实验进一步证明了其抗肿瘤活性，同时并显示出时间剂量依赖效应。

1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据oneology和ribonuelease将其命名为onconase。

1994年Merlino等用1.7AX 射线对其三维结构做了准确的描述，其结构和性质均类似于天然蛋白质。

从1996到2004年Alfacell公司相继开展了豹蛙酶对肺小细胞肺癌、恶性间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌等临床研究，其中对恶性间皮瘤疗效显著，且副作用小。

一、豹蛙酶抗肿瘤作用机制与细胞膜表面受体结合转入细胞质，破坏细胞膜的整体性，降解胞质中高分子rRNA，抑制蛋白质合成导致减缓细胞增殖和细胞凋亡是豹蛙酶细胞毒性的基本机制，这在目前所有上市药物中是独一无二的。

豹蛙酶与细胞膜受体结合，通过内吞作用转入细胞质，同时破坏细胞膜的整体性，这一过程需要三磷酸腺苷(ATP)，是豹蛙酶细胞毒性作用的关键步骤。

大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建和表达[发明专利]

专利名称：大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建和表达专利类型：发明专利
发明人：姚泉洪,田永生,彭日荷,许晶,王波,王丽娟,韩静申请号：CN201210571635.8
申请日：20121225
公开号：CN103898098A
公开日：
20140702
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建和表达。

所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体是通过在pYN7443质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入根据梭菌密码子偏爱化学合成的大肠杆菌lacZ基因（EclacZS）编码序列构建而成的。

通过对该表达载体转化的梭菌进行大肠杆菌lacZ基因的活性测定证明了本发明的根据梭菌密码子偏爱合成的来源于大肠杆菌的LacZ基因同样也是一个适合于在梭菌中表达的报告基因。

这对于通过比较不同启动子及终止子来确定最优的启动子终止子组合来构建高产丁醇的工程菌株具有重要的理论意义。

申请人：上海市农业科学院
地址：201106 上海市闵行区北翟路2901号
国籍：CN
代理机构：上海开祺知识产权代理有限公司
代理人：费开逵
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重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定.doc

重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定尹凤红1,2，肖清江2，周卫东2，陈清西1*(1.厦门大学生命科学学院，福建厦门361102；2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建厦门361022)摘要：采用大肠杆菌作为宿主表达重组人胸腺肽α1(rhTα1)融合蛋白，纯化获得rhTα1并对其鉴别．于300 L发酵罐进行中试发酵表达rhTα1融合蛋白；经IPTG 诱导，离心发酵液收集菌体，菌体经破碎、离心、亲和层析捕获，获得融合蛋白；每升发酵液可获得约170 mg硫氧环蛋白-胸腺肽α1融合蛋白．融合蛋白经肠激酶酶切后、经亲和层析、反相层析、体积排阻层析等纯化步骤，获得高纯度rhTα1；通过本纯化工艺获得的rh Tα1原液经SDS-PAGE和HPLC-SEC的检测纯度均大于99%；采用玫瑰花结形成率测定rh Tα1活性与市售化学合成胸腺肽（日达仙）标准品一致；质谱分析分子质量为3066.59 u，分子质量大小与去乙酰化的rhTα1理论分子质量(3066 u)一致；N端测序结果与理论值一致．说明本工艺可实现工业化规模生产．关键词：重组人胸腺肽α1蛋白；表达；纯化．中图分类号：Q 356．1 文献标志码：A 文章编号：收稿日期：2015-03-30基金项目：国家高技术研究发展（863）计划（2007AA021604）*通信作者：chenqx@胸腺素α1（Thymosin-alpha 1，Tα1）作为免疫调节因子，可以启动T淋巴细胞的成熟，刺激分泌干扰素及各种淋巴细胞介素，以及增强自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性．对Tα1的临床研究主要集中在治疗乙型肝炎及丙型肝炎方面，能够显著增强机体免疫力，对肝炎病毒的复制繁殖具有显著的抑制作用[1-3]；也有有关Tα1治疗肺癌等肿瘤及其他免疫缺陷疾病的报道[4-5]．1977年由Goldstein等首次在胸腺组织内发现．人胸腺肽α1是由28个氨基酸组成，N端乙酰化的酸性多肽，其相对分子质量为3108 u、等电点为4.2、分子中有6对重复氨基酸残基；氨基酸序列为：N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile- Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C[6]．目前人胸腺肽α1生产工艺主要有两种：一种是生化提取法，另一种是化学合成法．生化提取材料来源受限，有效成分胸腺肽α1含量低（小于1%），成本高；化学合成的胸腺肽α1虽然已经临床应用，但价格昂贵，在合成过程中污染环境．当前临床用药以合成法生产的胸腺五肽和Tα1为主，其销售金额占据国内该类药物93% 的市场份额[7]．采用基因工程技术生产的rhTα1通过查询CFDA暂未有获批产品．有关基因工程技术表达纯化的rhTα1暂时还停留在实验室水平，发酵规模从摇瓶至20 L不等[8,9]．本文采用基因工程技术，构建高效表达rhTα1的表达菌株，在中试规模下，发酵表达并分离纯化，获得高纯度、高活性的rh Tα1，为rhTα1产业化大生产打下坚实的基础．1 材料和方法1.1材料大肠杆菌TOP10/ pThioHis A-Tα1 基因工程菌株由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白胨为Oxoid公司产品，丙烯酰胺为Promega公司产品；Chelating Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、SOURCE 30RPC及G-25填料为GE 公司产品；Tα1标准品（日达仙）购自SciClone；其它试剂均为国产分析纯．实验使用主要仪器：30 L、300 L全自动发酵罐，B．Braun Biotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，BECKMAN公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic 100蛋白纯化仪，GE公司；MALDI-TOF MS，Bruker 公司；N端蛋白序列分析仪，岛津公司；1.2 方法1.2.1 rhTα1 融合蛋白的发酵表达取rhTα1工程菌株TOP10/pThioHis A-Tα1，按1：400（体积比）接种于150 mL LB培养基/1000 mL三角瓶，37 ℃、200~250 rpm培养6~8 h为一级种；一级种子按1：200（体积比）接种至24 L LB培养基/30 L种子罐，37 ℃、200~250 rpm 培养6~8 h为二级种．二级种按1：6（体积比）接种到含150 L LB培养基的D300发酵罐中，37 ℃，DO 30%~60%培养，待菌液浓度达OD600nm=3.0，用含1 mmol/L IPTG的氮源补料液1.5 L于2 h内流加诱导，过程中补加碳源或2 mol/L NaOH以维持pH 7.0，诱导总时长约7 h．1.2.2 菌体收集和破碎发酵完毕，离心收集菌体，菌体用pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬后采用35 MPa高压破碎2次；再用高速冷冻离心机以10℃，10000 rpm离心40 min，获得上清液．1.2.3 rhTα1融合蛋白的捕获初步纯化离心上清液，上样Chelating Sepharose Fast Flow（CS）层析柱，采用pH 8.0的20 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液和pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，以梯度洗脱方式洗脱目的蛋白，按峰收集目的样．1.2.4 rhTα1融合蛋白的酶解亲和层析捕获的rhTα1融合蛋白，用5K超滤膜（0.1 m2）浓缩，超滤替换成pH 8.0的1 mmol/L CaCl2，50mmol/L Tris-HCl缓冲体系，收集样品，并调节浓度至1 mg/mL；按摩尔比为1:30（EK酶/底物）的比例，加入EK酶并混匀，4~8℃酶切16 h．1.2.5 rhTα1的分离纯化取EK酶切后的样品，首先通过Chelating Sepharose Fast Flow（CS）层析柱初步纯化，上样预先用pH 8.0的20 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的CS柱，收集样在214 nm检测．进一步应用Q Sepharose Fast Flow（QFF）层析柱纯化，将CS穿透样上样至预先用pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡好的QFF层析柱，用pH 8.0的250 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱目的多肽．然后，将收集到的QFF柱后的目的多肽通过SOURCE 30RPC层析柱进行精细的纯化，用流动相0.07%三氟乙酸-2.0%乙腈(体积分数)和流动相0.07%三氟乙酸-80.0%乙腈(体积分数)梯度洗脱，按峰收集目的多肽．继而用Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化，采用pH 8.0的400 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱目的样品，收集获得rhTα1．最后，精细分离纯化后的样品以不高于20%的柱床体积上样Sephadex G-25 Medium分子筛，用pH7.0的10 mmol/L PBNa缓冲液洗脱，收集目的样；0.22μm过滤膜过滤除菌，分装即为原液，-65℃以下冻存．1.2.6 rhTα1的纯度检测和理化性质鉴定采用脱E受体法测定Tα1活性，显微镜下计数不少于200个淋巴细胞的玫瑰花环，计算玫瑰花环形成率．rhTα1的纯度鉴定采用SDS-PAGE及高效液相（HPLC-SEC）的方法分析检测．SDS-PAGE电泳的积层胶浓度为5%(质量分数)，间隙胶浓度10%(质量分数)，分离胶浓度16%(质量分数)；上样量20 µg，电压80~160V，考马斯亮蓝G250染色．HPLC-SEC的方法样品释到0.2 mg/mL，取50 µL上样(10 µg)，按面积归一化法计算其纯度．1.2.7 重组人胸腺肽α1的氨基酸序列分析及质谱分子量检定采用Edman降解法检测rhTα1的N末端15个氨基酸序列，检测分析委托中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院中心实验室进行，仪器为PE/ABI PROCISE 491测序仪，检测程序PL-PVDF-protein．采用BRUKER公司REFLEX TM III型基质辅助激光解吸电离/飞行时间（MALDI-TOF MS）质谱仪，MALDI-TOF MS法测定rhTα1分子质量；基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）．2 结果与分析2.1 rhTα融合蛋白的发酵表达不同诱导时间的发酵液进行取样，扫描后取相同OD600的菌体，高温破碎，15%SDS-PAGE电泳检测，试验结果见图1-A，rhTα1融合蛋白表观分子质量约为19 k u，随着诱导时间的延长，发酵的目的产物逐渐增加，诱导后4 h后表达稳定，随着时间的延长可以获得更多的生物量的积累．利用软件SmartView2001分析计算得到细胞裂解蛋白中融合蛋白所占比例为40%．300 L发酵罐最终可获得发酵液约190 L，离心可获得3.3 k g菌体．A．rhTα1融合蛋白发酵菌体裂解样电泳图：lane1：LWM ；lane3：rhTα1诱导0 h对照；lane4：rhTα1诱导1 h后；lane6~11：rhTα1诱导2~7 h样品．B．菌体破碎及rhTα1融合蛋白的CS捕获电泳图谱：lane1：LWM；lane3：CS层析柱清洗样；lane5：发酵菌体处理上清；lane6：发酵上清；lane7：破碎后离心沉淀处理上清；lane8：破碎后上清；lane9：CS层析柱穿透样；lane10：CS层析柱目的样．图1 发酵菌体裂解液、菌体破碎及CS捕获电泳图Fig.1. Analysis of Tα1 fermentation、crushing and capture by SDS-PAGE2.2 菌体破碎菌体破碎后，进行SDS-PAGE电泳检测，试验结果见图1-B lane7，在高压破碎的离心沉淀中无目标蛋白检出（菌体高压破碎的离心沉淀，重悬后进行煮沸裂解），lane8的破碎后上清中含有rhTα1融合蛋白，证明细胞破碎完全，破碎条件合适．2.3 rhTα1融合蛋白的捕获初步纯化通过基因工程设计与构建，发酵表达的rhTα1融合蛋白N末端带有6个His 氨基酸，可特异性与CS层析填料结合，基于这个原理，采用CS层析填料来捕获rhTα1融合蛋白，并与其它蛋白或杂质分离．含有rhTα1融合蛋白的破碎上清通过CS层析柱后，rhTα1融合蛋白特异性结合到层析柱上，而其它蛋白或杂质则穿透或被冲洗掉，然后通过洗脱液洗脱目的蛋白，获得高纯度的rhTα1融合蛋白．纯化洗脱图谱见图2-A，电泳检测图谱见图1-B，由图1-B判断，上样的穿透样(lane 9)及层析柱清洗样（lane3）均为杂质，目的洗脱样（lane10）为高纯度的rhTα1融合蛋白．试验结果显示，采CS层析柱，在该纯化条件下，捕获分离效果良好，可获得高纯度的rhTα1融合蛋白．3.3 kg菌体破碎并经亲和层析捕获后可获得融合蛋白约33 g，折算每升发酵液可获得融合蛋白173 mg，目的蛋白表达水平基本满足工业化规模生产．2.4 rhTα1融合蛋白的酶切通过基因工程设计，表达的rhTα1融合蛋白的N末端6个组氨基酸（His）通过肠激酶酶切识别氨基酸序列与rhTα1连接，因此采用肠激酶酶切rhTα1融合蛋白，以获得正确氨基酸序列的rhTα1．EK酶切的rhTα1融合蛋白SDS-PAGE检测图谱见图3-A，由图3-A lane1、lane3可见，4~8℃酶切16 h后，融合蛋白酶切效率达85%以上．2.5 r hTα1的纯化2.5.1 rhTα1的初步分离纯化rhTα1融合蛋白，经EK酶切后，目的蛋白rhTα1与组氨酸纯化标签断裂分开，因此采用CS层析柱结合组氨酸纯化标签，而穿透为rhTα1，由于穿透样品浓度稀，体积大，不利于进行后续纯化处理，因此采用QFF层析柱浓缩CS穿透样品．因胸腺肽一级结构中无含苯环氨基酸，280nm检测收集样品不灵敏，故采用214nm 检测收集样品．CS及QFF纯化洗脱图谱分别见图2-B和图2-C，电泳检测图谱见图3-A，由图3-A可见，CS层析的穿透样表观分子质量大于2.5ku，为rhTα1，经QFF浓缩后，无明显杂质．2.5.2 rhTα1的精细分离纯化为了获得高纯度的rhTα1，进一步采用反相分离技术，分离去除rhTα1的相关蛋白或杂质后，再用QFF层析柱去除有机溶剂和浓缩目的样品．纯化洗脱图谱见图2-D、2-E，电泳检测图谱见图3-B，由图3-B可见，精细纯化后再浓缩可获得高纯度的rhTα1．2.5.3 rhTα1的原液制备QFF层析柱精细纯化后的rhTα1用G-25 分子筛脱盐替换为pH7.0，10 mmol/L PBNa缓冲液，收集目的样；其洗脱见图谱2-F，由图2-F可见，目的样品峰与离子峰分离效果良好，G-25层析柱收集到的样品用0.22 µm过滤膜过滤除菌，分装即为原液，-65℃以下冻存．A. rhTα1融合蛋白的CS捕获图谱；B. rhTα1的CS层析初步纯化图谱；C. rhTα1的QFF阴离子层析浓缩图谱；D. rhTα1的RPC反相层析精纯图谱；E. rhTα1的QFF阴离子层析浓缩图谱；F. rhTα1的G-25分子筛脱盐图谱．图2 rh Tα1的分离纯化层析图谱Fig.2. Purification of Thymosinα1 by AKTA Basic 100A.融合蛋白酶切及CS柱捕获小肽胶电泳图谱；lane1：超滤浓缩样（融合蛋白）；lane2：小肽Maker；lane3：EK酶切样；lane4~6：CS柱穿透样；lane7：洗脱杂质；Lane 8：QFF浓缩样品.B. rhTα1的精细分离纯化电泳图谱；lane1：小肽Maker；lane2~6：RPC反相层析peak 1~5；lane7：QFF浓缩样.图3 Tα1纯化样品电泳检测图谱Fig.3. Analysis of Thymosinα1 by SDS-PAGE2.6 rhTα1原液活性、纯度检测及理化性质鉴定2.6.1 rhTα1原液活性检定胸腺肽可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其E受体功能，从而反映胸腺肽的生物活性．本检测参考《胸腺肽溶液质量标准》脱E受体法测定玫瑰花结增加率反应Tα1活性．结果见表1，自制rhTα1的玫瑰花结增加率为50.0%，市售化学合成的胸腺肽α1（日达仙）的玫瑰花结增加率为53.3%，相比较空白均有明显提高；另外本次检测自制样品活性为日达仙的96%，基本一致．表1. rhTα1活性计算Tab.1. calculation activety of rhTα1编号样品花环形成率/% 活性增加量/% 花环增加率/% T/C值/%B 空白21.2T r hTα1(自制) 31.8 10.6 50.0 95.5C 日达仙(市售) 32.3 11.1 53.3注：活性增加率＝增加量/空白.2.6.2 rhTα1纯度检定1）采用SDS-PAGE电泳检测rhTα1的纯度以日达仙作为参照品，分别上样控制带5%，2%，1%，电泳结果（见图4）表明：供试品中无可见杂蛋白，样品的电泳纯度大于99%．lane1：LWM；lane2：空；lane3：rhTα1供试品20 μg；lane4：空；lane5：日达仙20 μg；lane6：日达仙1 μg；lane7：日达仙400 ng；lane8：日达仙200 ng.图4 rhTα1供试品16%SDS-PAGE tricine电泳检测图谱Fig.4. Analysis of Purity rhTα1 product Detector by tricine SDS-PAGE2）采用HPLC检测rhTα1的纯度HPLC-SEC检测方法进行本样品的关键纯度检测．重组人胸腺肽α1 HPLC-SEC的检测结果见图5，结果表明检测样品中rhTα1的峰面积占总面积的99.84%，表明有关物质远小于5%的注册标准[10]（制剂）．图5. rhTα1原液HPLC-SEC 检测图Fig.5. Analysis of Purity of rhTα1 by HPLC-SEC2.6.3 重组人胸腺肽α1鉴别检测1）rhTα1的N端氨基酸序列测定N端序列测定是蛋白质及多肽一级结构确认的重要组成部分，也是重组蛋白药物质量控制的必检项目．经N端氨基酸序列测定，rhTα1样品N-末端15个氨基酸残基序列为N-SDAA V DTSSE ITTKD-C．检测结果与已知rhTα1的N-末端氨基酸残基序列一致．2）rhTα1质谱法测定分子量检测结果：供试品rhTα1质谱检测分子质量为3066.59 u（见图6），分子质量大小与去乙酰化的Tα1理论分子质量(3066 u)一致．图6 MALDI-TOF MS法测定rhTα1分子质量Fig.6. Mass spectrum of rhTα1 by MALDI-TOF MS3讨论目前常用的制备低分子量多肽的基因工程重组技术有两种，一种是通过串联多个目标基因来获得高表达，虽然该方法已有较多成功例子，但是本实验室尝试使用四段或两段多肽的串联表达，结果均未见目的蛋白表达，因此本实验室放弃该方法；另一种方法是通过融合表达，其优点是融合蛋白可携带纯化标签，可通过亲和层析高效获得高纯度目的蛋白，大大简化了下游纯化工作，因此本实验室采用第二种方法制备重组人胸腺肽α1．本方法主要分为3个纯化部分：1）采用CS亲和层析作为捕获步骤，捕获带有纯化标签的目标蛋白，快速的与细胞破碎后释放的酶、核酸、菌体蛋白、内毒素以及色素分离，有利于融合蛋白的稳定；2）EK酶切后蛋白首先用CS亲和层析纯化，存在于酶解混合物中的硫氧还蛋白以及少量未被酶解的融合蛋白由于分子中仍存在His-tag序列，因而被吸附于CS柱上，而酶解释放出来的游离rhTα1则出现在穿透峰中；3）将穿透目标样品用QFF柱浓缩后，再经SOURCE 30RPC 反相层析进行精纯，再次浓缩后替换缓冲体系，即为rhTα1纯品．样品活性、纯度分析及鉴别，采用脱E受体法测定Tα1活性，以日达仙作为参考品，其活性相当；用质谱检测rhTα1分子质量为3066.59 u，与去乙酰化的rhTα1理论分子质量3066 u相符；rhTα1样品N-末端15个氨基酸残基序列为SDAA VDTSSE ITTKD，检测结果与已知胸腺肽α1的N-末端15个氨基酸残基序列为一致；SDS-PAGE结果表明，rhTα1纯度超过99%；HPLC-SEC纯度为99.84%，远大于5%的注册标准．本检测中使用的参考品为市售胸腺肽α1，商品名为日达仙，其为化学合成，分子质量与天然的胸腺肽α1一致为3108u．相关报道称采用基因工程重组技术得到N端未乙酰化的胸腺肽α1，其全部化学性质和体外生物活性与化学合成的胸腺肽α1及天然的胸腺肽α1相一致[11]，本实验室结论与其一致．用该方法生产胸腺肽α1比用化学合成生产的胸腺肽α1成本大为降低，与生化提取方法相比，又具有操作简单，易于放大、工艺取材不受限制以及活性高等优点，本实验获得高纯度的重组人胸腺肽，为重组Tα1的工业化生产提供可靠的技术支持．参考文献：[1] Sugahara S. Ichida T. 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Biochemistry，1980, 19: 6096-6104.Expression, Purification and Identify of Recombinant HumanThymosin-alpha1 in E.coliYIN Feng-hong1, XIAO Qing-jiang2, ZHOU Wei-dong2, CHEN Qing-xi1*(1.School of Life Science, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2.Amoytop BiotechniqueCompany of Xiamen, Xiamen 361022, China)Abstract: In the present study, Expression, Purification and Identify of Recombinant Human Thymosin-alpha1in E.coli were reported. The Recombinant Human Thymosin-alpha 1 (rhTα1) fusion protein was conducted in the 300 L fermentation; The fusion protein induced by IPTG, Centrifugal for bacteria, By crushing, centrifugal, affinity chromatography, for Recombinant Human Thymosin-alpha 1 - Thioredoxinfusion protein; The yield of The fusion protein was 170 mg from 1 liter of bacterial culture medium. after the proteolysis by Enterokinase (EK), affinity chromatography of Ni-Sepharose , RPC and exclusion chromatography，High purity rhTα1 was obtained. By SDS-PAGE and HPLC-RPC for protein purity analysis, rhTα1 could reach the purity of more than 99%.This article used Rosette formation test technique to test the activity of rhTa1, rhTα1 activity and commercially available chemical synthesis are (ZADAXIN) quite. Mass spectrum of rhTα1by MALDI-TOF was 3066.59 Dalton, The molecular weight and theoretic result(3066 Dalton) agree well . The analysis of N-terminal accorded with the theory. which showed a foundation for industrialized production of rhTα1.Key words: recombinant human thymosin-alpha 1 (rhTα1); expression ; purification．。

重组人胸腺肽α在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法[发明专利]

专利名称：重组人胸腺肽α在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法
专利类型：发明专利
发明人：刘建宁,孙自勇,陈均勇,张菁,吴盛
申请号：CN200410055550.X
申请日：20040804
公开号：CN1706946A
公开日：
20051214
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组人胸腺肽α在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法。

本发明用PCR将化学合成的人胸腺肽α基因扩增并克隆到pMD18－T载体中，经过
KpnI/SacI酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体pET32b中硫氧还蛋白下游。

将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中，经IPTG诱导，Zn－Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得35mg硫氧还蛋白－胸腺肽α融合蛋白。

经凝血因子Xa酶切、Zn－Sepharose亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得3.8mg重组人胸腺肽。

小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。

申请人：南京大学
地址：210093 江苏省南京市汉口路22号
国籍：CN
代理机构：南京天华专利代理有限责任公司
代理人：夏平
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pET-32c(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-32c(+)编号名称北京华越洋VECT-‐600 pET-‐32c(+)pET32c载体基本信息别名: pET32c, p et 32c质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5901bp5' 测序引物: T75' 测序引物序列: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: thioredoxin (N端); H is (中间和C端) 载体抗性: Ampicillin备注: Production o f s oluble, a ctive t arget p roteins; N-‐term t hrombin c leavage s ite; Nterm e nterokinase c leavage s ite; a,b,c v ary b y M CS稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒pET32c载体质粒图谱和多克隆位点信息pET32c载体简介The pET-‐32 series is designed for cloning and high-‐level expression of peptide sequences fused with t he 109aa T rx•Tag™ thioredoxin p rotein (1). C loning s ites a re a vailable f or p roducing f usion proteins a lso c ontaining c leavable H is•Tag® a nd S•Tag™ sequences f or d etection a nd p urification. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented s o t hat i nfection w ith h elper p hage w ill p roduce v irions c ontaining s ingle-‐stranded D NA that corresponds to the coding strand. Therefore, single-‐stranded sequencing should be performed u sing t he T7 t erminator p rimer.pET32c载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCACAGATA TCCCATGGCC TTGTCGTCGT CGTCGGTACC 241 CAGATCTGGG CTGTCCATGT GCTGGCGTTC GAATTTAGCA GCAGCGGTTT CTTTCATACC 301 AGAACCGCGT GGCACCAGAC CAGAAGAATG ATGATGATGA TGGTGCATAT GGCCAGAACC 361 AGAACCGGCC AGGTTAGCGT CGAGGAACTC TTTCAACTGA CCTTTAGACA GTGCACCCAC 421 TTTGGTTGCC GCCACTTCAC CGTTTTTGAA CAGCAGCAGA GTCGGGATAC CACGGATGCC481 ATATTTCGGC GCAGTGCCAG GGTTTTGATC GATGTTCAGT TTTGCAACGG TCAGTTTGCC541 CTGATATTCG TCAGCGATTT CATCCAGAAT CGGGGCGATC ATTTTGCACG GACCGCACCA 601 CTCTGCCCAG AAATCGACGA GGATCGCCCC GTCCGCTTTG AGTACATCCG TGTCAAAACT 661 GTCGTCAGTC AGGTGAATAA TTTTATCGCT CATATGTATA TCTCCTTCTT AAAGTTAAAC 721 AAAATTATTT CTAGAGGGGA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCCCTATAGT GAGTCGTATT 781 AATTTCGCGG GATCGAGATC GATCTCGATC CTCTACGCCG GACGCATCGT GGCCGGCATC 841 ACCGGCGCCA CAGGTGCGGT TGCTGGCGCC TATATCGCCG ACATCACCGA TGGGGAAGAT 901 CGGGCTCGCC ACTTCGGGCT CATGAGCGCT TGTTTCGGCG TGGGTATGGT GGCAGGCCCC 961 GTGGCCGGGG GACTGTTGGG CGCCATCTCC TTGCATGCAC CATTCCTTGC GGCGGCGGTG 1021 CTCAACGGCC TCAACCTACT ACTGGGCTGC TTCCTAATGC AGGAGTCGCA TAAGGGAGAG 1081 CGTCGAGATC CCGGACACCA TCGAATGGCG CAAAACCTTT CGCGGTATGG CATGATAGCG 1141 CCCGGAAGAG AGTCAATTCA GGGTGGTGAA TGTGAAACCA GTAACGTTAT ACGATGTCGC 1201 AGAGTATGCC GGTGTCTCTT ATCAGACCGT TTCCCGCGTG GTGAACCAGG CCAGCCACGT 1261 TTCTGCGAAA ACGCGGGAAA AAGTGGAAGC GGCGATGGCG GAGCTGAATT ACATTCCCAA 1321 CCGCGTGGCA CAACAACTGG CGGGCAAACA GTCGTTGCTG ATTGGCGTTG CCACCTCCAG 1381 TCTGGCCCTG CACGCGCCGT CGCAAATTGT CGCGGCGATT AAATCTCGCG CCGATCAACT 1441 GGGTGCCAGC GTGGTGGTGT CGATGGTAGA ACGAAGCGGC GTCGAAGCCT GTAAAGCGGC 1501 GGTGCACAAT CTTCTCGCGC AACGCGTCAG TGGGCTGATC ATTAACTATC CGCTGGATGA 1561 CCAGGATGCC ATTGCTGTGG AAGCTGCCTG CACTAATGTT CCGGCGTTAT TTCTTGATGT 1621 CTCTGACCAG ACACCCATCA ACAGTATTAT TTTCTCCCAT GAAGACGGTA CGCGACTGGG 1681 CGTGGAGCAT CTGGTCGCAT TGGGTCACCA GCAAATCGCG CTGTTAGCGG GCCCATTAAG 1741 TTCTGTCTCG GCGCGTCTGC GTCTGGCTGG CTGGCATAAA TATCTCACTC GCAATCAAAT 1801 TCAGCCGATA GCGGAACGGG AAGGCGACTG GAGTGCCATG TCCGGTTTTC AACAAACCAT 1861 GCAAATGCTG AATGAGGGCA TCGTTCCCAC TGCGATGCTG GTTGCCAACG ATCAGATGGC 1921 GCTGGGCGCA ATGCGCGCCA TTACCGAGTC CGGGCTGCGC GTTGGTGCGG ACATCTCGGT 1981 AGTGGGATAC GACGATACCG AAGACAGCTC ATGTTATATC CCGCCGTTAA CCACCATCAA 2041 ACAGGATTTT CGCCTGCTGG GGCAAACCAG CGTGGACCGC TTGCTGCAAC TCTCTCAGGG 2101 CCAGGCGGTG AAGGGCAATC AGCTGTTGCC CGTCTCACTG GTGAAAAGAA AAACCACCCT 2161 GGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC 2221 ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTAAGTTAGC 2281 TCACTCATTA GGCACCGGGA TCTCGACCGA TGCCCTTGAG AGCCTTCAAC CCAGTCAGCT 2341 CCTTCCGGTG GGCGCGGGGC ATGACTATCG TCGCCGCACT TATGACTGTC TTCTTTATCA 2401 TGCAACTCGT AGGACAGGTG CCGGCAGCGC TCTGGGTCAT TTTCGGCGAG GACCGCTTTC 2461 GCTGGAGCGC GACGATGATC GGCCTGTCGC TTGCGGTATT CGGAATCTTG CACGCCCTCG 2521 CTCAAGCCTT CGTCACTGGT CCCGCCACCA AACGTTTCGG CGAGAAGCAG GCCATTATCG 2581 CCGGCATGGC GGCCCCACGG GTGCGCATGA TCGTGCTCCT GTCGTTGAGG ACCCGGCTAG 2641 GCTGGCGGGG TTGCCTTACT GGTTAGCAGA ATGAATCACC GATACGCGAG CGAACGTGAA 2701 GCGACTGCTG CTGCAAAACG TCTGCGACCT GAGCAACAAC ATGAATGGTC TTCGGTTTCC 2761 GTGTTTCGTA AAGTCTGGAA ACGCGGAAGT CAGCGCCCTG CACCATTATG TTCCGGATCT 2821 GCATCGCAGG ATGCTGCTGG CTACCCTGTG GAACACCTAC ATCTGTATTA ACGAAGCGCT 2881 GGCATTGACC CTGAGTGATT TTTCTCTGGT CCCGCCGCAT CCATACCGCC AGTTGTTTAC 2941 CCTCACAACG TTCCAGTAAC CGGGCATGTT CATCATCAGT AACCCGTATC GTGAGCATCC 3001 TCTCTCGTTT CATCGGTATC ATTACCCCCA TGAACAGAAA TCCCCCTTAC ACGGAGGCAT 3061 CAGTGACCAA ACAGGAAAAA ACCGCCCTTA ACATGGCCCG CTTTATCAGA AGCCAGACAT 3121 TAACGCTTCT GGAGAAACTC AACGAGCTGG ACGCGGATGA ACAGGCAGAC ATCTGTGAAT3181 CGCTTCACGA CCACGCTGAT GAGCTTTACC GCAGCTGCCT CGCGCGTTTC GGTGATGACG 3241 GTGAAAACCT CTGACACATG CAGCTCCCGG AGACGGTCAC AGCTTGTCTG TAAGCGGATG 3301 CCGGGAGCAG ACAAGCCCGT CAGGGCGCGT CAGCGGGTGT TGGCGGGTGT CGGGGCGCAG 3361 CCATGACCCA GTCACGTAGC GATAGCGGAG TGTATACTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA 3421 GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG 3481 AGAAAATACC GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC 3541 GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA 3601 TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT 3661 AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA 3721 AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT 3781 CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG 3841 TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC 3901 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC 3961 GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA 4021 TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT 4081 ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC 4141 TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA 4201 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA 4261 AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA 4321 AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT 4381 TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC 4441 AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC 4501 ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC 4561 CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA 4621 AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC 4681 CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC 4741 AACGTTGTTG CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA 4801 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA 4861 GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA 4921 CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT 4981 TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT 5041 TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG 5101 CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA 5161 TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC 5221 AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG 5281 ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG 5341 GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG 5401 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGAAATTG TAAACGTTAA TATTTTGTTA 5461 AAATTCGCGT TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC CGAAATCGGC 5521 AAAATCCCTT ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT TCCAGTTTGG 5581 AACAAGAGTC CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA AAGGGCGAAA AACCGTCTAT 5641 CAGGGCGATG GCCCACTACG TGAACCATCA CCCTAATCAA GTTTTTTGGG GTCGAGGTGC 5701 CGTAAAGCAC TAAATCGGAA CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG ACGGGGAAAG 5761 CCGGCGAACG TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC TAGGGCGCTG5821 GCAAGTGTAG CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA TGCGCCGCTA 5881 CAGGGCGCGT CCCATTCGCC A//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyanpDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMOpCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPOpBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His CpBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+)pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐HispRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+)pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H TapKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+)PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LICpET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis BpET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3XpGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99a pET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177 pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10 pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KG pGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。

pTrc-CKS使用说明

pTrc-CKS pTrc-CKS pET系列表达载体基本信息：启动子: Trc/lac复制子: ColE1 ori终止子: rrnB T1 terminator质粒分类: 大肠杆菌载体；PET系列表达质粒质粒大小: 5.2kb质粒标签: N-CKS,C-6×His，N-P3C原核抗性: 氨苄青霉素Amp克隆菌株: DH5α培养条件: 37℃，有氧，LB表达宿主: BL21(DE3)诱导方式: IPTG或乳糖及其类似物5'测序引物: 5 ATC CAT GTT GCT GTT GCT CAG G 3 3'测序引物: 5 GAT TTA ATC TGT ATC AGG 3pTrc-CKS载体质粒图谱和多克隆位点信息：pTrc-CKS载体简介：pTrc-CKS表达载体采用E.coliTrc启动子和蛋白质工程改造过CKS(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)基因融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。

CKS融合表达是美国Abbot 公司的专利，CKS融合蛋白研制成功HIV和HCV重组抗原并取得FDA认证在美国上市。

CKS是一个非常稳定且高度可溶的理想融合伴侣。

本发明除去掉CKS C端8个氨基酸外，还将C端Met突变成ThrpTrc-CKS载体序列pTrc-CKS其他相关pET系列表达载体：pProEX HTC pET-24pProEX HTA pET-23dpMBP-P pET-23cpMBP-C pET-23bpLLP-STII/Plpp-STII pET-23pETM-30 pET22b-EBFPpET303/CT-His pET22b-EGFPpET302/NT-His pET-22bpET-52b pET-21dpET-51b pET-21bpET-50b pET-21apET-48b pET-21pET-47b pET-20bpET-44c pET-19bpET-44b pET-17bpET-44a 非空（BamHI-XhoI）pET-14bpET-43.1c pET-12cpET-43.1b pET-12bpET-43.1a pET-12apET-42c pET-11dpET-42b pET-11cpET-42a pET-11bpET-41c pET-5apET-41b pET-5bpET-41a pET-3dpET-39b pET-3cpET-37b pET-3bpET-35b pET-3apET-33b pTrc-CKSpET-32c pLpp-OmpApET-32b pET28a-OFP pET-32a pET28a-ECFP pET30a-EcoRV pET28a-EBFP pET-30c pProEX HTB pET-30b pET-TrxpET28a-SUMO pETM-11pET28a-EYFP pET-HispET28a-DsRed2 pET-GSTpET28a-EGFP pET-DsbApET-29c pETBlue-2pET-29b pET-40bpET-29a pET-31bpET-28c pET-30apET-28b pET28a-mCherry pET-28a pET-25bpET-27b pET-24apET-26b pET-23apET-24d pET-15bpET-24c pET-21cpET-24b pET-16bpET-11a。

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达¹100039北京解放军第302医院成军施双双钟彦伟夏小兵王刚王琳刘妍陈菊梅摘要利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体(ScF v)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-core-ScFv。

以重组的HCV核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-core-ScFv基因的噬菌体克隆。

从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经NcoI/Not I酶切鉴定,该ScFv基因由750bp组成。

将其亚克隆到pCAN TA B5E表达载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DN A序列测定,符合ScF v的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。

I PT G诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV-core-ScFv的表达。

酶联免疫吸附法(EL ISA)证实表达的HCV-core-ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性。

对转化的JM109大肠杆菌上清中表达的HCV-co re-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAG E),证实表达的HCV-core-ScFv的分子量为28kDa。

为应用HCV-core-ScF v进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。

关键词丙型肝炎病毒;核心蛋白;单链可变区抗体;表达中国图书资料分类号Q78EXPRESSION OF SOLUBLE HUMAN ScFv AGAINST C ORE PROTEIN OF HEPATITIS C VIRUS IN E COLICheng Jun,Shi Shuangshuang,Zhong Yanw ei et al.Gene T herapy Research Center, Institute of Infectious Diseases,The302Hospital of PLA,Beijing100039 Abstract T o construct expr essive vector for human ScF v against core protein of hepatitis C vir us(HCV-core-ScF v),and to ex press soluble HCV-core-ScF v in E.coli JM109.U sing phage display technique,the recombinant phages were panned by recombinant core antigen which was coated in a microtiter plate,and after fiv e rounds of biopanning,86 clones were identified specific to cor e antig en.750bp fr ag ment could be released from the plasmid of posit ive phage clones,and the sequence analysis indicated that we hav e obrained the ScFv DN A fragment.T hen DN A fragment was inserted into the expressive vector pCA NT AB5E,and E.coli host JM109was transfor med and induced by IPT G.T he specificity of ScFv in the cultur e medium was ev aluated by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).T he molecular weig ht of expressed HCV-core-ScFv protein is28000dalton as deter mined w ith the aid of SDS-polyacr ymide gel elec-trophoresis(PAG E).T he ex pressed HCV-cor e-ScFv protein w ill be useful in the immunohi stochemical study of liver tissue fr om patients w ith hepatit i s C and gene therapy against HCV infection.Key words HCV;core,single chain Fv ant ibody;expression丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗病毒治疗,目前除了部分病人对重组干扰素A(IFN A)具有一定的治疗反应以外,还没有更为确切的治疗方法。

pTrc99a大肠杆菌表达载体说明

pTrc99a编号载体名称北京华越洋生物VECT5460 pTrc99apTrc 99a载体基本信息别名: pTrc99a, p Trc 99a质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体拷贝水平: 高拷贝启动子: Trc克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4176 b p5' 测序引物及序列: RV-‐M: G AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3' 测序引物及序列: pTrcHis-‐R: G ATTTAATCTGTATCAGG载体标签: none载体抗性: 氨苄备注: 宿主菌: E.coli. 相关载体: p BR322, p Trc97. 稳定性: 瞬时表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pTrc 99a载体质粒图谱和多克隆位点信息pTrc 99a载体简介细菌表达，可诱导蛋白表达，使用IPTG进行诱导（1 m M I PTG）。

pTrc 99a载体序列ORIGIN1 GTTTGACAGC TTATCATCGA CTGCACGGTG CACCAATGCT TCTGGCGTCA GGCAGCCATC 61 GGAAGCTGTG GTATGGCTGT GCAGGTCGTA AATCACTGCA TAATTCGTGT CGCTCAAGGC 121 GCACTCCCGT TCTGGATAAT GTTTTTTGCG CCGACATCAT AACGGTTCTG GCAAATATTC 181 TGAAATGAGC TGTTGACAAT TAATCATCCG GCTCGTATAA TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA 241 TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGACCATGG AATTCGAGCT CGGTACCCGG GGATCCTCTA 301 GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTTGGCT GTTTTGGCGG ATGAGAGAAG ATTTTCAGCC 361 TGATACAGAT TAAATCAGAA CGCAGAAGCG GTCTGATAAA ACAGAATTTG CCTGGCGGCA 421 GTAGCGCGGT GGTCCCACCT GACCCCATGC CGAACTCAGA AGTGAAACGC CGTAGCGCCG 481 ATGGTAGTGT GGGGTCTCCC CATGCGAGAG TAGGGAACTG CCAGGCATCA AATAAAACGA 541 AAGGCTCAGT CGAAAGACTG GGCCTTTCGT TTTATCTGTT GTTTGTCGGT GAACGCTCTC 601 CTGAGTAGGA CAAATCCGCC GGGAGCGGAT TTGAACGTTG CGAAGCAACG GCCCGGAGGG 661 TGGCGGGCAG GACGCCCGCC ATAAACTGCC AGGCATCAAA TTAAGCAGAA GGCCATCCTG 721 ACGGATGGCC TTTTTGCGTT TCTACAAACT CTTTTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA 781 ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA 841 AGAGTATGAG TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC 901 TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA GATCAGTTGG 961 GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG TAAGATCCTT GAGAGTTTTC 1021 GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT 1081 TATCCCGTGT TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG 1141 ACTTGGTTGA GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG 1201 AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA CTTCTGACAA 1261 CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA CATGGGGGAT CATGTAACTC 1321 GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA 1381 CGATGCCTAC AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC 1441 TAGCTTCCCG GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC 1501 TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG 1561 GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA 1621 TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG 1681 GTGCCTCACT GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA 1741 TTGATTTAAA ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC 1801 TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA 1861 AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT AATCTGCTGC TTGCAAACAA 1921 AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC 1981 CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT 2041 AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC 2101 TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG GACTCAAGAC 2161 GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG GGGTTCGTGC ACACAGCCCA 2221 GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG 2281 CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG2341 GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT 2401 TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT 2461 GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC 2521 ACATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGT 2581 GAGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG 2641 CGGAAGAGCG CCTGATGCGG TATTTTCTCC TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA 2701 TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG TATACACTCC 2761 GCTATCGCTA CGTGACTGGG TCATGGCTGC GCCCCGACAC CCGCCAACAC CCGCTGACGC 2821 GCCCTGACGG GCTTGTCTGC TCCCGGCATC CGCTTACAGA CAAGCTGTGA CCGTCTCCGG 2881 GAGCTGCATG TGTCAGAGGT TTTCACCGTC ATCACCGAAA CGCGCGAGGC AGCAGATCAA 2941 TTCGCGCGCG AAGGCGAAGC GGCATGCATT TACGTTGACA CCATCGAATG GTGCAAAACC 3001 TTTCGCGGTA TGGCATGATA GCGCCCGGAA GAGAGTCAAT TCAGGGTGGT GAATGTGAAA 3061 CCAGTAACGT TATACGATGT CGCAGAGTAT GCCGGTGTCT CTTATCAGAC CGTTTCCCGC 3121 GTGGTGAACC AGGCCAGCCA CGTTTCTGCG AAAACGCGGG AAAAAGTGGA AGCGGCGATG 3181 GCGGAGCTGA ATTACATTCC CAACCGCGTG GCACAACAAC TGGCGGGCAA ACAGTCGTTG 3241 CTGATTGGCG TTGCCACCTC CAGTCTGGCC CTGCACGCGC CGTCGCAAAT TGTCGCGGCG 3301 ATTAAATCTC GCGCCGATCA ACTGGGTGCC AGCGTGGTGG TGTCGATGGT AGAACGAAGC 3361 GGCGTCGAAG CCTGTAAAGC GGCGGTGCAC AATCTTCTCG CGCAACGCGT CAGTGGGCTG 3421 ATCATTAACT ATCCGCTGGA TGACCAGGAT GCCATTGCTG TGGAAGCTGC CTGCACTAAT 3481 GTTCCGGCGT TATTTCTTGA TGTCTCTGAC CAGACACCCA TCAACAGTAT TATTTTCTCC 3541 CATGAAGACG GTACGCGACT GGGCGTGGAG CATCTGGTCG CATTGGGTCA CCAGCAAATC 3601 GCGCTGTTAG CGGGCCCATT AAGTTCTGTC TCGGCGCGTC TGCGTCTGGC TGGCTGGCAT 3661 AAATATCTCA CTCGCAATCA AATTCAGCCG ATAGCGGAAC GGGAAGGCGA CTGGAGTGCC 3721 ATGTCCGGTT TTCAACAAAC CATGCAAATG CTGAATGAGG GCATCGTTCC CACTGCGATG 3781 CTGGTTGCCA ACGATCAGAT GGCGCTGGGC GCAATGCGCG CCATTACCGA GTCCGGGCTG 3841 CGCGTTGGTG CGGATATCTC GGTAGTGGGA TACGACGATA CCGAAGACAG CTCATGTTAT 3901 ATCCCGCCGT CAACCACCAT CAAACAGGAT TTTCGCCTGC TGGGGCAAAC CAGCGTGGAC 3961 CGCTTGCTGC AACTCTCTCA GGGCCAGGCG GTGAAGGGCA ATCAGCTGTT GCCCGTCTCA 4021 CTGGTGAAAA GAAAAACCAC CCTGGCGCCC AATACGCAAA CCGCCTCTCC CCGCGCGTTG 4081 GCCGATTCAT TAATGCAGCT GGCACGACAG GTTTCCCGAC TGGAAAGCGG GCAGTGAGCG 4141 CAACGCAATT AATGTGAGTT AGCGCGAATT GATCTG//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+) pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+) pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+) pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+) pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+) pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+) pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+) pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。

pGEM-T大肠杆菌表达载体说明

pGEM-T编号载体名称北京华越洋生物VECT4770 pGEM-‐TpGEM-‐T载体基本信息载体名称: pGEM-‐T质粒类型: 原核表达载体；pCR克隆载体高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: T7克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 2867 b p5' 测序引物及序列: T7 f orward3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: 瞬表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pGEM-‐T载体质粒图谱和多克隆位点信息pGEM-‐T载体序列ORIGIN1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCCGCGGGA TATCACTAGT 61 GCGGCCGCCT GCAGGTCGAC CATATGGGAG AGCTCCCAAC GCGTTGGATG CATAGCTTGA 121 GTATTCTATA GTGTCACCTA AATAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 181 GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG 241 CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT 301 TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG 361 GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG 421 TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT 481 CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA 541 AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA 601 ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC 661 CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT 721 CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA 781 GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG 841 ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 901 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA 961 CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGAACAGTA TTTGGTATCT 1021 GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC 1081 AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA 1141 AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA 1201 ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 1261 TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA 1321 GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA 1381 TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC 1441 CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA1501 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC 1561 AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA 1621 ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT 1681 TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG 1741 CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC 1801 TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT 1861 CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT 1921 GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC 1981 TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT 2041 CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 2101 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA 2161 CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG 2221 GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG 2281 TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC 2341 GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGAAATTG TAAGCGTTAA TATTTTGTTA AAATTCGCGT 2401 TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC CGAAATCGGC AAAATCCCTT 2461 ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT TCCAGTTTGG AACAAGAGTC 2521 CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA AAGGGCGAAA AACCGTCTAT CAGGGCGATG 2581 GCCCACTACG TGAACCATCA CCCTAATCAA GTTTTTTGGG GTCGAGGTGC CGTAAAGCAC 2641 TAAATCGGAA CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG ACGGGGAAAG CCGGCGAACG 2701 TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC TAGGGCGCTG GCAAGTGTAG 2761 CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA TGCGCCGCTA CAGGGCGCGT 2821 CCATTCGCCA TTCAGGCTGC GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT 2881 ATTACGCCAG CTGGCGAAAG GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG 2941 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+) pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+) pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+) pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+) pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。

大肠杆菌表达系统教(学)案蛋白表达纯化

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。

本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。

根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。

融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。

常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。

其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。

His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。

His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。

目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。

除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。

它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。

pCold-ProS2载体说明

pCold-ProS2编号载体名称北京华越洋生物VECT4580 pCold-‐ProS2pCold-‐ProS2载体基本信息载体名称: pCold-‐ProS2质粒类型: 大肠杆菌表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: C SPA克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5025 b p5' 测序引物及序列: pCold-‐F：5'-‐ACGCCATATCGCCGAAAGG-‐3' 3' 测序引物及序列: pCold-‐R：5'-‐GGCAGGGATCTTAGATTCTG-‐3' 载体标签: ProS2载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin）筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: -‐-‐组成型: 诱导型表达病毒/非病毒: 非病毒pCold-‐ProS2载体质粒图谱和多克隆位点信息pCold-‐ProS2载体简介pCold P roS2 D NA 是一种融合的冷休克表达载体，使用来源于革兰氏阴性菌Myxococcus xanthus中的Protein S作为可溶性标签。

这种Protein S存在于粘细菌的孢子衣中，由173个氨基酸残基组成，是一种非常稳定的可溶性蛋白质。

将两个Protein S的N-‐末端结构域串联，再结合ProS2 T ag的作用，就能使融合目的蛋白的稳定性和可溶性得到提高。

此外，由于目的蛋白和ProS2-‐Tag的相互作用性很低，因此可以将二者有效分离。

pCold P roS2 DNA Vector在cspA启动子的下游插入了5’非编码区(5’-‐UTR)、翻译增强元件(TEE)、His-‐Tag序列、ProS2-‐Tag和多克隆位点(MCS)。

大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达

・研究报告・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2010年第3期大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达栾海涛1　丁庆豹1　欧伶1　魏晓琨2许彦梅2(1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2上海璞诚生物科技有限公司,上海200235) 摘　要:　将大肠杆菌K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add )克隆到载体pET 228a 中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。

通过I PTG 诱导,S DS 2P AGE 检测和酶活性的测定发现,重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶,活性达到51107U /mg 蛋白。

通过酶性质的研究,腺苷脱氨酶对腺苷最适pH 和温度分别为715和40℃,且在40℃下维持稳定。

关键词:　大肠杆菌　腺苷脱氨酶　基因工程Clon i n g and Expressi on of E.coli Adenosi n e Deam i n ase GeneLuan Haitao1D ing Q ingbao1Ou L ing1W ei Xiaokun2Xu Yanmei2(1S tate Key Laboratory of B ioreactor Engineering,East China U niversity of Science and Technology,Shanghai 200237;2Shanghai Pucheng B iotechnology Co .,L td,Shanghai 200235) Abs trac t:　The gene encoding adenosine dea m inase (add )fr om Escherichia coli K12was cl oned int o exp ressi on vect or pET 228a and transfor med int o the strain E .coli BL21(DE3).The p r otein was highly exp ressed after the inducti on with I PTG,then was analyzed with S DS 2P AGE and confir med by the assay of activity .The activity of adenosine dea m inase exp ressed could reached up t o 51.07U /mg p r otein .The study of characterizati on showed that adenosine dea m inase had op ti m u m pH 7.5and op ti m u m te mperature at 40℃with ther mal stability at 40℃.Key wo rd s:　Escherichia coli Adenosine dea m inaseGene engineering收稿日期:2009211210作者简介:栾海涛,男,硕士,研究方向:生物化学与分子生物学;E 2mail:alanislht@hot m ail .com 通讯作者:欧伶,E 2mail:bi oxianleid@腺苷脱氨酶(adenosine dea m inase,ADA ,EC 3151414)是一种催化腺嘌呤核苷及其衍生物水解脱氨的酶,故又称为腺苷氨基水解酶(adenosine a m inohydr olase )。

CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书

CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书目录内容和保存介绍产品信息方法实验轮廓设计单链DNA寡核苷酸产生双链寡核苷酸连接反应转化感受态E.coli细胞分析转化子转染哺乳细胞系附录ACRISPR核酸酶载体试剂盒的图谱和特点附属产品技术支持参考附录BCRISPR核酸酶表达细胞的富集内容和含量1.1 双链（ds）对照寡核苷酸序列ds 克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。

ds 克隆对照的寡核苷酸来自退火的，并在试剂盒中提供的50μM的双链寡核苷酸。

ds 克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行再退火和稀释。

5’ CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 3’3’GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT 5’1.2感受态细胞转化效率≥1×109 cfu/微克质粒DNA1.3 TOP10细胞的基因型F-MCRAΔ（MRR-hsdRMS-mcrBC）φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1 araD139Δ（ARA-LEU）7697Galu galKpsL（STRR）endA1 nupG2 介绍2.1 产品信息2.1.1 介绍GENEART®CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPR RNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。

该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓性链球菌II型CRISPR/ Cas系统，并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统（Jinek等人，2012;。

Mali1等人，2013;。

cong等人，2013）。

带有OFP的GENEART®CRISPR核酸载体允许Cas9和CRISPR RNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选，而带有CD4的GENEART®CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPR RNA为基础的表达细胞的富集。

线性GENEART®CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPR RNA靶到表达盒，允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。

原核表达质粒(pTrcHis)载体蛋白单克隆抗体的制备及应用

原核表达质粒(pTrcHis)载体蛋白单克隆抗体的制备及应用王剑锋;李长贵;邱平;周铁群;沈月雷【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】1999(12)3【摘要】应用两种在pTrcHis上表达的融合蛋白rp15 0C和rp5 2C免疫BALB/c 小鼠后 ,获得 2株分泌抗pTrcHis载体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞 1C4和 3C10。

其中 1C4为IgG3 ,腹水ELISA效价为1∶2× 10 6;3C10为IgM ,腹水ELISA效价为1∶6 0 0。

实验表明 ,1C4分泌的抗体用于pTrcHis表达蛋白的检测具有很好的特异性 ,对工程菌体蛋白无非特异性反应。

辣根过氧化物酶HRP标记 1C4后 ,用于组装HCMVIgM检测试剂盒 ,检测HCMVIgM阳性血清。

【总页数】2页(P153-154)【关键词】表达载体;单克隆抗体;原核表达质粒;制备;应用【作者】王剑锋;李长贵;邱平;周铁群;沈月雷【作者单位】中国药品生物制品检定所【正文语种】中文【中图分类】R392－33;R446.6【相关文献】1.MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备 [J], 董丹凤;王举波;吴胤瑛;耿倩倩;李恩孝;李毅2.土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定 [J],张振华;田拥军;李磊;王宝菊;孟忠吉;陆蒙吉;杨东亮3.Mer免疫球蛋白样区原核蛋白表达和单克隆抗体制备 [J], 范磊;沈飞;谢丽倩;周梦云;阮长耿4.小鼠胆盐依赖脂肪酶蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备 [J], 杨奕;宋还雷;钱林溪5.牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备 [J], 李炎鑫;马贵平;杨汉春;刘全国;史喜菊;李冰玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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pTrcHis A编号载体名称北京华越洋生物VECT4450 pTrcHis ApTrcHisA载体基本信息别名: pTrcHisA, p TrcHis A质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: Trc克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4414 b p5' 测序引物及序列: pTrcHis-‐F: g aggtatatattaatgtatcg3' 测序引物及序列: pTrcHis-‐R:GATTTAATCTGTATCAGG 载体标签: N-‐His, N-‐EK载体抗性: Ampicillin备注: Hosts: E.coli NM522, E.coli INValphaF'. Related vectors: pSE420.稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒pTrcHisA载体质粒图谱和多克隆位点信息pTrcHisA载体简介pTrcHis载体是来由pBR322质粒衍生而来的表达载体,设计用来在大肠杆菌中进行重组蛋白的高效表达和纯化。

载体上的Trc启动子和rrnB抗终止区使得高水平蛋白表达成为可能.Trc启动子由Trp启动子的-‐35区域和Lac启动子的-‐10区域共同组成。

pTrcHis载体同时包含有一个LacIq 基因，该基因编码了Lac启动子的抑制蛋白。

LacIq基因的存在使得宿主菌是LacIq+还是LacIq-‐都可以高效抑制插入基因的转录。

进行蛋白表达时，大肠杆菌需要生长到对数生长期，然后加入1mM I PTG，去除阻遏蛋白，诱导表达。

载体上的迷你顺反子结构能够增强插入基因的转录水平，从而高水平表达目的蛋白。

DNA插入片段位于载体表达片段下游，在其上游有一个N-‐端融合表达多肽序列，该序列包含有ATG起始密码子，6xHis标签，T7噬菌体10号基因的翻译增强子，X p ress 抗原表位，肠激酶酶切识别位点。

pTrcHisA载体序列ORIGIN1 GTTTGACAGC TTATCATCGA CTGCACGGTG CACCAATGCT TCTGGCGTCA GGCAGCCATC 61 GGAAGCTGTG GTATGGCTGT GCAGGTCGTA AATCACTGCA TAATTCGTGT CGCTCAAGGC 121 GCACTCCCGT TCTGGATAAT GTTTTTTGCG CCGACATCAT AACGGTTCTG GCAAATATTC 181 TGAAATGAGC TGTTGACAAT TAATCATCCG GCTCGTATAA TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA 241 TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCGCCGCT GAGAAAAAGC GAAGCGGCAC TGCTCTTTAA 301 CAATTTATCA GACAATCTGT GTGGGCACTC GACCGGAATT ATCGATTAAC TTTATTATTA 361 AAAATTAAAG AGGTATATAT TAATGTATCG ATTAAATAAG GAGGAATAAA CCATGGGGGG 421 TTCTCATCAT CATCATCATC ATGGTATGGC TAGCATGACT GGTGGACAGC AAATGGGTCG481 GGATCTGTAC GACGATGACG ATAAGGATCG ATGGGGATCC GAGCTCGAGA TCTGCAGCTG 541 GTACCATATG GGAATTCGAA GCTTGGCTGT TTTGGCGGAT GAGAGAAGAT TTTCAGCCTG 601 ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC TGGCGGCAGT 661 AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG TAGCGCCGAT 721 GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GGGAACTGCC AGGCATCAAA TAAAACGAAA 781 GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA ACGCTCTCCT 841 GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC CCGGAGGGTG 901 GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAATT AAGCAGAAGG CCATCCTGAC 961 GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT 1021 ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG 1081 AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT 1141 CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT 1201 GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC 1261 CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA 1321 TCCCGTGTTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC 1381 TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA 1441 TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG 1501 ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC 1561 CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG 1621 ATGCCTGTAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA 1681 GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG 1741 CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG 1801 TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC 1861 TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT 1921 GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT 1981 GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC 2041 ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG 2101 ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA 2161 AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG 2221 AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG 2281 TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG 2341 TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA 2401 TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC 2461 TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC 2521 ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA 2581 GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT 2641 CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG 2701 AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC 2761 ATGTTCTTTC CTGCGTTATC CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA 2821 GCTGATACCG CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG 2881 GAAGAGCGCC TGATGCGGTA TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA 2941 TGGTGCACTC TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TACACTCCGC 3001 TATCGCTACG TGACTGGGTC ATGGCTGCGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC 3061 CCTGACGGGC TTGTCTGCTC CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA3121 GCTGCATGTG TCAGAGGTTT TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGGCAG CAGATCAATT 3181 CGCGCGCGAA GGCGAAGCGG CATGCATTTA CGTTGACACC ATCGAATGGC GCAAAACCTT 3241 TCGCGGTATG GCATGATAGC GCCCGGAAGA GAGTCAATTC AGGGTGGTGA ATGTGAAACC 3301 AGTAACGTTA TACGATGTCG CAGAGTATGC CGGTGTCTCT TATCAGACCG TTTCCCGCGT 3361 GGTGAACCAG GCCAGCCACG TTTCTGCGAA AACGCGGGAA AAAGTGGAAG CGGCGATGGC 3421 GGAGCTGAAT TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAACAACTG GCGGGCAAAC AGTCGTTGCT 3481 GATTGGCGTT GCCACCTCCA GTCTGGCCCT GCACGCGCCG TCGCAAATTG TCGCGGCGAT 3541 TAAATCTCGC GCCGATCAAC TGGGTGCCAG CGTGGTGGTG TCGATGGTAG AACGAAGCGG 3601 CGTCGAAGCC TGTAAAGCGG CGGTGCACAA TCTTCTCGCG CAACGCGTCA GTGGGCTGAT 3661 CATTAACTAT CCGCTGGATG ACCAGGATGC CATTGCTGTG GAAGCTGCCT GCACTAATGT 3721 TCCGGCGTTA TTTCTTGATG TCTCTGACCA GACACCCATC AACAGTATTA TTTTCTCCCA 3781 TGAAGACGGT ACGCGACTGG GCGTGGAGCA TCTGGTCGCA TTGGGTCACC AGCAAATCGC 3841 GCTGTTAGCG GGCCCATTAA GTTCTGTCTC GGCGCGTCTG CGTCTGGCTG GCTGGCATAA 3901 ATATCTCACT CGCAATCAAA TTCAGCCGAT AGCGGAACGG GAAGGCGACT GGAGTGCCAT 3961 GTCCGGTTTT CAACAAACCA TGCAAATGCT GAATGAGGGC ATCGTTCCCA CTGCGATGCT 4021 GGTTGCCAAC GATCAGATGG CGCTGGGCGC AATGCGCGCC ATTACCGAGT CCGGGCTGCG 4081 CGTTGGTGCG GATATCTCGG TAGTGGGATA CGACGATACC GAAGACAGCT CATGTTATAT 4141 CCCGCCGTCA ACCACCATCA AACAGGATTT TCGCCTGCTG GGGCAAACCA GCGTGGACCG 4201 CTTGCTGCAA CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT GAAGGGCAAT CAGCTGTTGC CCGTCTCACT 4261 GGTGAAAAGA AAAACCACCC TGGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC 4321 CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA 4381 ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CGCGAATTGA TCTG//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。