细菌内毒素检测技术与应用

• 例子：如果用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用
头孢曲松钠舒巴坦钠的最低有效浓度为：
• 4、样品稀释过程中加液量的计算
稀释过程中，假设从溶液S1取（X）ml溶液稀释
（n）倍至S2，加液量为（y）,则满足
Y=（n-1）* x
• 例子：如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液
量为： Y=（3.8-1）* 0.5=1.4（ml）,即0.5ml的
• 例子2：注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为
2.0~8.0g，分3~4次给药，一日最高剂量不超过
12g.
• 2、最大有效稀释倍数（MVD）
--供试品MVD按下式计算：MVD=cL/λ
A.C为供试品浓度，其中当L以EU/ml表示时，c
为1.0ml/ml；
B.M为内毒素限值；
C.λ 为鲎试剂的灵敏度（凝胶法）或标准曲线
S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S2。
• 5、计算
A、2010版药典：紫杉醇注射液细菌内毒素检查：
取本品，加内毒素检查用水稀释制成每1ml中含
紫杉醇0.15mg或更低浓度，依法检查每1mg紫杉醇
中含内毒素的量应小于0.40EU，问应该选用灵敏度
为多少的鲎试剂来做检测？？
解答：
λ =MVC*L=MVC*0.4EU/mg
原检查的药品约20种。 – 2000年,国际调和委员会使USP,EP和JP达成《BET的国际 调和案》,统一的BET法收载于USPXXIV版NF19的第二增补 本中,并于2001年1月1日生效
• 2)国内
–1983年,由11个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的 成立。 –1988年,卫生部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标 准 –1991年,卫生部部颁标准规定4种药品可使用细菌内毒素 检查法。
– 鲎试剂的灵敏度越来越高
凝胶法最高达0.0075EU/ml,商品试剂0.015EU/ml 定量 法高达0.001EU/ml
• 4)BET应用的领域越来越广
– 药品检验 – 药品生产过程质控 – 临床应用:辅助诊断 – 其它领域:食品卫生,环境保护
二、细菌内毒素的理论基础
• 1、细菌内毒素 • 2、鲎试剂 • 3、BET检查用水 • 4、BET检查程序 • 5、5,2005年版细菌内毒素检查法 • 6、相关参数的计算 • 7、试验相关知识
药典要求：MVC ≤0.15mg/ml，
则选用鲎试剂灵敏度 λ
≤0.15mg/ml*0.4EU/mg=0.06EU/ml
B、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠细菌内毒素：
取本品，用内毒素检查用水制成每1ml中含
0.6mg的溶液，依法检查，每1mg本品中含内毒素的
量应小于0.050EU，问应该选用灵敏度为多少的鲎
异性鲎试剂。
• 2)鲎试剂的规格
(1)单次实验试剂
(2)多次试验试剂
• 3)鲎试剂的质量标准
(1)灵敏度
●
定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试
剂产生阳性的标准内毒素的最低浓度，单位为EU/ml。常用
的鲎试剂的灵敏度有：0.25、0.125、0.03。
(2)自身凝集：阴性对照在37度4h不产生阳性反应。
• 1、细菌内毒素
1)化学成分及特性
– 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物
– 是高分子量脂多糖复合物(LPS)
单体分子量介于10,000至20,000道尔顿 典型地以
100,000至500,000道尔顿的聚合体形式存在
(1)特性
- 致热性：内毒素作用于人体细胞,使之释放内原性热原,
再刺激下丘脑体温调节中枢, 引起发热反应。 - 耐热性：需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活。 - 分子极性：多糖链有亲水性,脂肪链具有疏水性,在水中 呈不均匀分布 。 - 酸碱性：与强酸强碱水解反应。 - 鲎反应性： 能与鲎试剂发生多级酶促反应,形成凝胶。 除上述性质外,LPS还有许多其它的生物活性
• 3、BET发展趋势与特
• 1)BET技术的发展趋势
(1)细菌内毒素检查取代热原检查
- BET法所具有的优点:快速,灵敏,可标准化等
(2)走向统一的BET法
- WHO实现了内毒素的国际标准品(IS)的效价
(IU)与各国内毒素标准品的效价(EU)的统一,即
1IU=1EU。
• 2)BET技术及应用发展的特点
(1)BET方法呈多样化
–凝胶法 –比浊法 - 动态比浊法 - 终点比浊法 –比色法 - 动态比色法 - 终点比色法
(2)BET趋向自动化
– 凝胶法 恒温设备方面,干式恒温仪器逐步取代水浴恒温 箱
– 定量BET 试管式定量检测仪 酶标板式定量检测仪 全自
动的BET系统 专用的数据软件
• 3)BET试剂的发展
最低点浓度（光度法）。
• 例子：如果使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射
用头孢曲松钠舒巴坦钠（浓度为10mg/ml，
L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为：
• 3、最低有效浓度（MVC）
MVC=λ /L
A. λ 为鲎试剂的灵敏度（凝胶法）或标准曲线
最低点浓度（光度法）；
B.L为内毒素限值；
每步稀释于旋涡混合器混合30秒
0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSE），平行4管 NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管
封口，混匀 37℃±1℃,60±2min 结果判断：反应管缓缓倒转1800 阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者 阴性（-）：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者 实验有效：NC管全部呈阴性（- -） 2.0λ管全部呈阳性（+ + + +） 0.25λ管全部呈阴性（- - - -） 数据处理：灵敏度测定值λc＝antilg(∑X/4) X：为反应终点浓度的对数值（lg） 鲎试剂灵敏度标示值λ有效： 2λ≥λc≥0.5λ 反应终点浓度是系列浓度递减的内毒 素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度
细菌内毒素检测技术与应用
一、细菌内毒素检测技术的应用与进展
• 1、热原 • 2、历史回顾-鲎试剂与细菌内毒素检查 • 3、BET的发展趋势与特点
• 1、热原
--热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质。
--Webster将热原定义为“ 致热剂”。
• 1)早期的热原研究
– 静脉疗法的研究与热原的研究密切相关 – 在18,19世纪有很多关于静脉疗法的报道,所有病人在注射 后都伴随有发热反应,当时的医生都深信发热对人体有益 – 1912年,Hort和Penfold阐明注射发热的真正本质,将细菌
细菌性疾病》,阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象.随后 ,Bang 和Levin发明了鲎试剂。 – 1980年,FDA发表使用鲎试剂检查人用和兽用注射药终成 品内毒素的准则;美国药典20版(USPXX)收载BET法。
– 1989年英国药典收载BET法 – 1991年日本药局方收载
BET法。
– 1999年,USPXXIV版规定670种药品用BET法检查,保留热
试剂来做检测？？
解答：
λ =MVC*L=MVC*0.050EU/mg
药典要求：MVC =0.6mg/ml，
则选用鲎试剂灵敏度 λ
=0.6mg/ml*0.050EU/mg=0.03EU/ml
五、凝胶法细菌内毒素检查技术
• 1、凝胶法BET试验程序 • 2、试验器具 • 3、鲎试剂灵敏度复核 • 4、干扰初筛试验 • 5、检查法 • 6、实验相关知识及技巧
反应温度的要求（37 ± 1 ℃ ）
• 3、鲎试剂标示灵敏度的复核试验
1）实验目的
A、验证实验的条件是否满足BET实验的要求；
B、验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的
要求；
C、验证实验所用试剂是否满足BET实验的要求；
D、验证实验所用器具是否满足BET实验的要求；
2）实验步骤
A、开启恒温仪器预热；
(2)化学结构
–含有3个截然不同的区域 O-特异侧链 核心多糖 类脂A
• 2)细菌内毒素与热原的关系
– 内毒素是热原之一种。
– 医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工
业中最普遍和最主要的外源性热原,控制内毒素污
染就等于控制热原污染。
• 3) 标准内毒素与环境内毒素
–标准内毒素
–环境内毒素(主要检测对象)
• 4) 标准内毒素溶液的制备
– 中国药典2005年版BET法要求,将细菌内毒素国
家标准品用BET检查用水溶解后,需在旋涡混合器上
混匀15分钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上
混合30秒钟.其他国家的BET法也有类似的要求.
– 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀 分布
• 5)内毒素的清除方法
(1) 冲洗 (2) 蒸馏
(3) 反渗透
(4) 超滤
(5) 活性炭吸附
• 6) 内毒素的灭活方法
(1) 酸/碱水解 (2) 氧化(H2O2)
(3) 干热(180 ℃ 2h或250 ℃ 30min)
• 2、鲎试剂
1)鲎试剂的分类
(1)种类：美洲鲎试剂
和中国鲎试剂；
(2)检测方法：凝胶法
和光度法；
(3)特异性：普通和特
孵育仪器
混合食品 涡旋混合仪 其它 试管架、异丙醇浸泡的无纺布、镊 子、剪刀、砂轮、标记笔、锡箔纸
1）试验器具的要求及处理；
A、玻璃器皿需经除热原处理，以除去可能存在的
外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后
≥250 ℃干烤至少30min；
B、塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干
扰的器械；
• 2）孵育反应仪器
• 1、内毒素限值
--一般按公式 L=K/M 来确定。
A.L为供试品的细菌内毒素限值；