第九章核酸类药物分析
核酸药物的药理学和临床应用
核酸药物的药理学和临床应用核酸药物是一类能够修饰或抑制细胞核酸分子的药物，这些药物分子一般都具有非常高的生物活性和特异性。
核酸药物是目前生命科学领域中最为热门的研究方向之一，因为其在治疗各种与基因相关的疾病方面具有非常广泛的应用前景。
本文将结合核酸药物的药理学和临床应用，探究该领域的发展趋势和未来展望。
一、核酸药物的药理学基础核酸药物主要是作用于DNA或RNA分子的化学物质，其主要分为两类：核酸酶和DNA或RNA结合剂。
核酸酶是一类专门分解核酸分子的酶，能够将长链核酸分子水解成较短的小分子，从而达到调节基因表达和细胞转化的目的。
DNA或RNA结合剂则是通过特定的化学结构与核酸分子结合，从而破坏DNA或RNA的复制或表达功能。
核酸药物在细胞内主要作用于以下几个方面：1. 抑制基因表达：核酸酶和RNA结合剂能够破坏或抑制mRNA的合成和转录，从而减弱或抑制该基因所编码蛋白质的表达。
2. 促进基因表达：通过核酸酶和RNA结合剂的作用，可以增强DNA或RNA的转录和合成，从而加强该基因所编码蛋白质的表达和功能。
3. 干扰RNA修饰：核酸药物还能作用于RNA修饰结构，从而干扰RNA的剪接、稳定性和转运等生物功能。
二、核酸药物的临床应用核酸药物作为一种新型治疗方案，其在医学领域的应用也越来越广泛。
目前，核酸药物在临床中主要应用于以下方面：1. 抗肿瘤药物：核酸药物在抗肿瘤方面具有非常广泛的应用前景。
其中，siRNA分子可以针对恶性肿瘤细胞的关键靶点进行靶向治疗，从而抑制肿瘤生长和扩散；miRNA分子则能够通过调节多个靶点的表达，从而发挥多效抗肿瘤作用。
2. 抗病毒药物：核酸药物也可以用于治疗多种病毒感染。
例如，在新冠肺炎的治疗中，利用mRNA技术研制了多种疫苗，成功预防和控制了该病毒的传播。
3. 代谢性疾病治疗：核酸药物也可以用于治疗代谢性疾病，如血脂异常、糖尿病和肥胖症等。
在这些疾病的治疗中，核酸药物可以通过抑制或增强关键基因的表达从而达到改善代谢状态的目的。
核酸药物类型及其临床应用
核酸药物类型及其临床应用
核酸药物是一类具有特殊生物学功能的药物，广泛用于治疗疾病、
基因治疗等方面，包括核酸疗法、miRNA治疗、RNAi治疗等多种类型。
下面我们将对核酸药物的类型及其在临床上的应用进行详细介绍。
1. 核酸药物的类型
核酸药物主要包括DNA、RNA等类别，根据其结构和功能的不同，可以划分为以下几种类型：
1.1 DNA药物：DNA药物通常用于基因疗法，可以通过递送外源基因来治疗某些基因缺陷性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜病变等。
1.2 RNA药物：RNA药物主要包括mRNA、miRNA、siRNA等，
用于调控基因表达、靶向RNA分解、抑制蛋白质合成等，具有很好的
治疗前景。
1.3 合成核酸药物：合成核酸药物是指通过化学合成制备的核酸分子，具有较强的稳定性和生物活性，可用于抗病毒、抗肿瘤等方面。
2. 核酸药物的临床应用
核酸药物在临床上有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：
2.1 基因疗法：核酸药物可通过递送外源基因来治疗基因缺陷性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜病变等，为基因治疗提供了新的途径。
2.2 抗病毒治疗：RNA药物可靶向病毒RNA，抑制病毒复制，用于治疗HIV、乙肝病毒等感染性疾病，具有很好的抗病毒效果。
2.3 抗肿瘤治疗：合成核酸药物具有抗肿瘤活性，可通过靶向RNA 分解、抑制肿瘤细胞增殖等方式，用于治疗多种恶性肿瘤。
综上所述，核酸药物作为一类新型的生物治疗药物，具有很好的应用前景和疗效，对于一些传统药物难以治疗的疾病具有重要意义。
未来随着技术的不断进步和临床试验的深入，相信核酸药物将在各个领域展现出更广阔的应用空间。
核酸类药物!!
储存方法
• 低于25℃避光干燥处保存。
愿你健康❤
核酸类药物——
卡介菌多糖核酸
了解核酸
• 核酸是生物大分子化合物，为生命的最基本 物质之一。 • 根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸 （简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。 • RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用—— 其中转运核糖核酸，简称tRNA，起着携带 和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸， 简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体 的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白 质的主要场所。DNA是储存、复制和传递遗 传信息的主要物质基础。
Hale Waihona Puke 它的来源• 卡介菌多糖核酸来源：经卡介 菌培养、破碎菌体，热酚法提 取纯化制成。
成 份
• 主要成分为卡介菌多糖、核酸，辅料为药 用氯化钠。本品为无色透明液体。
功效
• 该品作为一种新型免疫调节剂，主要作用是 调节机体免疫水平，增强机体的抗感染和抗 过敏能力。慢性支气管炎、哮喘、感冒、慢 性感染（如慢性肾炎）、过敏类疾病（如荨 麻疹、过敏性皮炎）、免疫复合物疾病（如 肾小球肾炎）、系统性红斑狼疮、风湿性关 节炎、免疫功能缺陷、肿瘤、神经性皮炎、 尖锐湿疣等。
使用方法
【用法用量】肌内注射， 每次0.5mg，一周2到3次， 3个月为一疗程。小儿酌 减或遵医嘱。
不良反应
不良反应 1、偶见注射部位红肿、结节，热敷后一周内自然消退。 2、偶见低烧。 3、过敏体质偶见皮疹。 4、罕见过敏反应。 禁忌证 1.严重过敏体质者慎用。
2.患急性传染病(如麻疹、百日咳、肺炎等)、急性眼结膜炎、急性中耳炎 及对本品有过敏史者暂不宜使用
核酸类药物的作用
• 核酸类药物是指具有药用价值的核酸、核 苷酸、核苷，以及碱基，是一类药物的总 称。
核酸类药物PPT课件
二、核苷及其衍生物 依据形成核苷的碱基或核糖的不同分为： 腺苷类：有腺苷、肌浸膏、核脉通、腺苷甲硫氨酸
(SAM)、辅酶型维生素B12(Co-B12)、腺苷二醛、巯 苷、嘌呤霉素(Puromycin) 尿苷类：有尿苷、氮杂尿苷(Azauridine)、碘苷、氟苷、 溴苷 胞苷类：有环胞苷(Cyclo-C)、氟环胞苷(AAFC)、氮杂 胞苷(Azacyti-dine) 肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex) 脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、 脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
德国生化学家科赛尔(Kossel)第一个系统地研究了 核酸的分子结构，从核酸的水解物中，分离出一 些含氮的化合物，命名为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸腺嘧啶，科赛尔因此获得了1910年的诺贝 尔医学与生理学奖。
在Tm时，表现出260nm的光吸收值急剧上升的增 色效应、比旋度值显著降低和黏度下降等现象。 通常DNA的Tm是增色效应达40％～50％时的温度， RNA的Tm为增色效应达30％～40％时的温度。
Tm大小与DNA的碱基组成有关。G-C之间的氢键 联系要比A-T之间的氢键联系强得多，故G-C含量 高的DNA其Tm值亦高。
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三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等球批准上市的第一个反义药物，1998 年已被美国FDA批准上市，用于二线治疗AIDS所致 的巨细胞病毒(CMV)视网膜炎。
核酸类药物分析
１离子对色谱法
核苷酸类药物的磷酸基在反相高效液相色谱条件下经 常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和测定。
离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的色谱保 留，实现准确定量。
《中国药典》（２０１５年版） 收载的环磷腺苷、三磷 酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含量测 定。
离子对色谱法是在流动相中加入适量的反离子，使其与 呈解离状态的待测组分形成离子对，增加其在非极性固定 相上的分配，从而改善其色谱保留与分离行为。
（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查 １有关物质
结构相似的其他非目标化合物，即有关物质。
以硫鸟嘌呤中“有关物质”检查为例进行说明。 硫鸟嘌呤是以鸟嘌呤为原料制备而得，终产品中可能带入残 留的原料、中间体、副反应产物等结构与硫鸟嘌呤类似的杂 质，统称为“有关物质”。该类杂质中，鸟嘌呤是已知杂质 且有对照品，采用对照品对照法进行检查；其他杂质则采用 不加校正因子的主成分自身对照法进行检查。
２含氯量 盐酸阿糖胞苷的生产过程中可能会因成盐不完全或产生一 些其他的盐酸盐杂质，造成药物中盐酸的含量发生变化， 即氯含量发生变化。因此通过含氯量测定可控制其纯度。
３含氟量 氟尿嘧啶原料药中氟化程度也可通过含氟量来进行控制。
三、含量测定 核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的弱
碱性，可采用非水碱量法进行含量测定； 其共轭结构具有一定的紫外吸收，可通过测定最大吸
《中国药典》（２０１５年版） 利用两者在紫外吸收 图谱上的差异，采用紫外－可见分光光度法对６－羟基嘌 呤的量进行控制，巯嘌呤在３２５ｎｍ处具有强烈的紫外 吸收，而６－羟基嘌呤的最大吸收波长在２５５ｎｍ、３ ２５ｎｍ处基本无吸收，故通过规定２５５ｎｍ与３２５ ｎｍ波长处的吸光度比值不得过０.０６，即可对６－羟 基嘌呤的量进行控制。
核酸药物的化学合成及药理学研究
核酸药物的化学合成及药理学研究核酸药物是近年来发展很快的一类药物，主要用于治疗肿瘤、病毒感染等疾病。
其独特的作用机制和治疗效果受到了广泛的关注。
本文将介绍核酸药物的化学合成和药理学研究。
一、核酸药物的化学合成1、寡核苷酸合成核酸药物中最常见的一类是寡核苷酸。
寡核苷酸的合成主要采用固相合成和液相合成两种方法。
固相合成是指将核苷酸的单体分别连接在含有支链的固相载体上，再通过化学反应逐步合成出目标寡核苷酸。
相比较而言，液相合成更加灵活，可以通过筛选反应条件和去保护基体系等方式，优化反应过程，提高产率和纯度。
2、磷酸二酯合成磷酸二酯合成是核酸药物中另一种重要的化学合成方法。
该方法主要采用的是磷酸二酯的亲核取代反应，将两个不同的核苷酸连接在一起。
这种方法的优点在于能够制备具有特定序列的核酸药物，以达到更好的治疗效果。
二、核酸药物的药理学研究1、治疗肿瘤核酸药物具有非常独特的药理学特性，主要体现在两个方面。
一方面，寡核苷酸可以基于序列的亲和力，高度特异地靶向肿瘤细胞，起到治疗作用；另一方面，核酸药物还可以抑制基因转录和翻译等生物过程，从而抑制肿瘤生长和转移。
当然，核酸药物的治疗效果不仅仅局限于肿瘤，还可以用于治疗病毒感染等多种疾病。
2、药动学和药效学研究核酸药物的药动学和药效学研究非常重要。
药动学研究主要涉及药物在体内的药代动力学过程，包括吸收、代谢和排泄等。
药效学研究则是研究药物的生物学效应和治疗效果。
这些研究为合理用药提供了依据，并且为药物的开发和改造提供了方向。
三、结语核酸药物是当前药物研究领域的一个热点，其治疗作用和药理学特性受到广泛的关注。
通过不断地优化化学合成方法和药理学研究，相信核酸药物的治疗效果和应用范围会越来越广泛。
核酸类药物的分析
取本品50mg，置10mL凯氏烧瓶中，加50%硫酸溶 液1mL，加热约3分钟，冷却，滴加硝酸3滴～4滴， 继续加热至溶液几乎无色后，冷却转移至纳氏比色 管中，用水10mL分次洗涤烧瓶，洗液并入比色管中 ，加钼酸铵硫酸试液2.5mL与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶 液1mL，用水稀释至 25mL，摇匀。如显色，与标准 磷酸盐溶液1.5mL，加水10mL，再加钼酸铵硫酸试液 2.5mL与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1mL，用水稀释使 成25mL，摇匀制成的对照液比较，不得更深（0.03% ）。
二、硫鸟嘌呤
•淡黄色结晶性粉末，无臭或几乎无臭，在水 、乙醇或三氯甲烷中不溶，在氢氧化钠试液 中易溶。
•2-氨基嘌呤- 6（1H）硫酮，按干燥品计算， 含C5H5N5S不得少于97.0%。
S HN H2N N
H N
nH2O N
鉴别
• 1. 取本品约10mg，加等量甲酸钠混匀，缓缓加 热，所产生的气体能使湿润的醋酸铅试纸显黑 色或灰色。
• RNA中戊糖为D-核糖，碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶和尿嘧啶。约90%的RNA在细胞质中，在细胞核内 含量约占10％，它直接参与体内蛋白质的合成。
核酸的理化性质
（一）形态 （二）溶解性 （三）粘度 （四）两性解离 （五）化学反应 （六）紫外吸收性质
第二节 嘌呤类核苷酸药物分析
主要是通过典型的化学基团反应，在适当条件下产 生颜色、荧光，沉淀或气体等来进行鉴别； 可以利用嘌呤碱基中的共轭双键在紫外区260nm处
三、硫唑嘌呤
•2-[5-(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑基)硫代]-1H-嘌呤。 按干燥品计算，含C5H7N7O2S不得少于98.0%。
CH3 N N
S
核酸药物的研究与应用
核酸药物的研究与应用在当今医药领域中，核酸药物是一个备受关注的研究领域。
不同于传统的化学合成药物，核酸药物是通过基因工程技术将人工合成的核酸序列靶向作用于疾病的基因或蛋白质分子，以达到治疗或预防疾病的效果。
随着科学技术的不断进步，核酸药物的研究与应用也越来越广泛。
一、核酸药物的分类及研究核酸药物主要分为三类：寡核苷酸、合成siRNA和基因治疗药物。
其中，寡核苷酸是一种富含磷酸骨架和核苷碱基的药物，具有良好的化学稳定性和口服吸收性，因此在临床应用中具有较广泛的应用前景。
合成siRNA则是一种可高效抑制特定基因表达的核酸药物，可用于治疗癌症、病毒、免疫性疾病以及遗传疾病等多种疾病。
基因治疗药物则是通过基因工程技术将正常的基因导入患者体内，修复或替换患者受损的基因，因此具有针对性强、治愈率高等优点。
目前，核酸药物的研究主要集中在以下几个方面：首先是药物发现和设计，包括寡核苷酸、siRNA和基因治疗药物的分子结构、药代动力学、药效学等方面的研究。
其次是药物的制备和纯化技术，如核酸药物的化学合成、纯化和包装等技术的研究和改进。
此外，核酸药物的靶向输送和表达调控等方面的研究也是目前研究热点之一。
二、核酸药物的应用前景核酸药物的应用前景非常广阔，可以应用于各种疾病的治疗和预防。
例如，针对癌症的核酸药物主要是针对癌细胞中特定基因的表达进行抑制，从而达到杀死癌细胞的效果。
此外，针对风湿性关节炎、哮喘等免疫性疾病的核酸药物则是通过抑制免疫细胞中某些特定基因的表达，从而达到抑制免疫反应的效果。
值得一提的是，目前核酸药物的应用仍存在一些挑战。
例如，药效持续性不佳、药物靶向性不足、药物副作用较大等问题是制约核酸药物进一步发展的瓶颈。
因此，未来的研究方向将主要集中在研发更高效、安全的核酸药物，并优化药物输送体系，以实现更好的治疗效果。
总之，核酸药物作为一种新型的药物，具有很好的治疗前景和广阔的应用前景。
随着科技的不断进步和研究的不断深入，我们有理由相信，在未来的日子里，核酸药物将为人们带来更多更好的治疗方案和疗效。
生物制药 第九章 核酸类药物
iRNA分特异性和非特异性两种。
用特异性抗原使动物致敏，然后从细胞中提取到的 iRNA称特异性的； 用福氏完全佐剂致敏或者不经致敏，直接提取其实是正常RNA，具有免疫触发剂或
免疫调节剂性质的重要作用。
(二) 用肝脏为原料制备iRNA 1．工艺路线
量，无菌灌装，冷冻干燥即得iRNA。
固定化酶法生产5＇-复合单核苷酸
5＇-复合单核苷酸可用于治疗白血球下降、血
小板减少以及肝功能失调等疾病。 核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、 胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物。 该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵 菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根 为材料制备磷酸酶。
(2)提取、除蛋白：清液中加入等体积内含 0.2mol/L三乙醇胺、1％十二烷基磺酸钠(SDS)、
0.002mol/L EDTA的混合溶液(pH9)。搅拌均匀
后，加等体积90％苯酚(内含0.2％8-羟基喹啉) 及等体积氯仿，于室温下振荡30min。离心得 上清液，再加入等量氯仿振摇，反复2~3次， 至中间层界面无明显蛋白层为止。离心留上清
出液pH达到7时开始部分收集，直至洗脱液中不含
核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。
5、精制及灌封
上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器浓缩后，测定核苷
酸含量，再用无热源水稀释至20毫克每毫升，加入 0.5-1.0%药用活性炭，煮沸10分，脱色和除热源， 滤除活性炭，滤液经除6号菌漏斗或0.45微米孔径 的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为 5＇-复合单核
液。
(3)沉淀、除糖原：按清液量加1/10体积20％ 醋酸钾、2倍体积冷至-20℃的无水乙醇。0℃
下放臵1h，离心，得白色沉淀。
核酸类药物
核酸类药物 基本概况 核苷酸生产工艺 三磷酸腺苷生产工艺
2013-9-22
1
生物制药工艺学——核酸类药物 概 述
核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药 物已广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心 血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸 等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这 类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干 扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷 等。 反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存 在的寡聚核苷酸片断（反义DNA和反义RNA），结合目标基因或mRNA 特定序列(靶核酸)，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。 反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程， 即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。
2013-9-22 5
生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需
能量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需 ATP参与。ATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷(cAMP) ，是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的 调节作用。 ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量， 促使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病 有较大针对性。但外源性ATP不易进入细胞，且与体内需要
7.2。 ②发酵培养 培养温度30℃，36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨， 控制pH。通风量1：0.5v／(v· min)。 ③提取、精制 发酵液加热使酶失活后，调节pH3—3.5，过滤，分离除去 菌体，上清液通过769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL型阴离子交换树脂吸附ATP，经氯化钠—盐酸液洗脱．洗脱液经核酸类药物
核酸药物的研究与应用前景
核酸药物的研究与应用前景核酸药物是一类基于核酸或核酸衍生物治疗疾病的药物。
近年来，随着基因技术的发展，核酸药物的研究与应用逐渐得到了广泛关注。
本文将从以下三个方面来探讨核酸药物的研究与应用前景：核酸药物的类型、核酸药物的特点以及核酸药物的应用前景。
一、核酸药物的类型目前主要的核酸药物有三类：核酸药物、基因治疗药物和RNA 药物。
核酸药物是一种用于干预DNA或RNA表达的药物。
常见的核酸药物有siRNA、shRNA和miRNA等，这些药物可以通过沉默或降解靶基因的RNA分子来达到治疗的效果。
基因治疗药物是一种通过向患者体内注入包含治疗基因信息的载体来治疗疾病的药物。
这种药物可以纠正某些遗传缺陷，有效治疗一些遗传性疾病。
RNA药物是一种基于RNA技术治疗疾病的药物，常见的RNA 药物有mRNA药物和ASO药物。
mRNA药物是一种通过改变蛋白质合成的mRNA分子的表达来治疗疾病的药物。
ASO药物则是一种通过结合RNA分子来治疗某些疾病的药物。
二、核酸药物的特点相较于传统的药物，核酸药物具有以下几个特点：1. 高效性。
由于核酸药物直接作用于DNA或RNA的结构，较之传统药物效果更为显著。
2. 靶向性。
核酸药物通常是针对某些特定的基因或蛋白质进行研究和设计的，因此比传统药物更具有靶向性。
3. 安全性。
核酸药物本质上是天然存在的生物分子，因此在一定程度上减少了副作用的可能性。
4. 适应症广泛。
由于核酸药物可以应用于DNA或RNA层次的治疗，涵盖的适应症相对较广。
三、核酸药物的应用前景核酸药物具有非常广泛的应用前景。
例如，核酸药物可以用于治疗遗传性疾病、传染病和肿瘤等多种疾病。
在肿瘤治疗方面，由于肿瘤细胞恶性增殖的本质在于基因突变，而核酸药物可以直接作用于基因，因此有望成为一种高效的治疗手段。
目前，基于siRNA等核酸药物的肿瘤治疗已经进入临床试验阶段。
此外，在传染病治疗方面，RNA药物也具有广阔的应用前景。
核酸类药物分析
用提取法从细胞或动物内脏制得，如核糖核 酸Ⅰ系由健康猪的肝脏提取制得。制备过程 中不可避免会带入一定的蛋白质，吸光度检 查即为了控制核酸类药物中蛋白质的含量。 具体方法是配制一定浓度的供试液，分别在 ２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的波长处测定吸光 度，要求该吸光度比值应不得低于１.７。
纯ＲＮＡ在２６０ｎｍ和２８ 精品课件
差，凡戊糖均有此反应。
绿色 670nm
精品课件
（２）二苯胺反应
脱氧核糖核酸、脱氧核苷 酸或脱氧核苷与酸共热水解产生的脱氧核 糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色 化合物，在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
反应。
核糖核酸、核糖核苷酸无此
蓝色 595nm
精品课件
生的磷酸与过量 的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼
（１）水分在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，所 以反应体系中不应有水分。
（２）由于所用溶剂———冰醋酸有挥发性且膨胀系 数较大，高氯酸滴定液的浓
度受温度和贮存条件影响很大。滴定时与标定时的温 度差对高氯酸滴定液浓度的
影响很大，一般温度差小于１０℃时，滴定液的浓度
精品课件
（３）冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在都可能对测定 结果造成干扰，故该法必须进行空白校正，即不加供试品， 同法操作，所得结果应扣除空白。 （４）常用电位滴定法和指示剂法作为终点的指示方法，但 指示剂的终点颜色变化需用电位滴定法确定。
精品课件
１离子对色谱法
核苷酸类药物的磷酸基在反相高效液相色谱 条件下经常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和 测定。
离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的 色谱保留，实现准确定量。
《中国药典》（２０１５年版） 收载的环磷腺苷、 三磷酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含 量测定。
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代表磷酸基
第九章核酸类药物分析
核苷酸 磷 酸
碱 基
戊糖
第九章核酸类药物分析
O
NH
碱基 N
N
N
HN
NO
N
H
H
酯键 O
OH
H2O
磷酸 O P O H O H C H 2
O
糖苷键
O
H2O
OH OH
戊糖
第九章核酸类药物分析
核苷酸
酯键Leabharlann 5`碱基连接（糖苷键）4`
1`
3` 2`
第九章核酸类药物分析
（对DNA为H）
第九章 核酸类药物的分析
第九章核酸类药物分析
基本要求
✓掌握：核酸的结构和分类；嘌呤类药物 和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的 原理
✓熟悉：核酸的理化性质；反义寡核苷酸 药物鉴别、检查、含量测定的原理
第九章核酸类药物分析
第一节 概述
✓结构和分类 ✓理化性质
第九章核酸类药物分析
什么是核酸？
➢ 1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核， 当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何 一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。
第九章核酸类药物分析
第二节 嘌呤类核苷酸药物分析
嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤） 戊糖 磷酸
第九章核酸类药物分析
一、鉴别
➢ 戊糖鉴别 ➢ 嘌呤鉴别 ➢ 磷酸鉴别 ➢ 特征吸收光谱 ➢ 熔点测定
第九章核酸类药物分析
（一）戊糖的鉴别
✓ 苔黑酚反应（地衣酚反应）---凡核糖均有此反应
试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂） 现象：鲜绿色
第九章核酸类药物分析
第九章核酸类药物分析
➢ 2.复性
一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活
性的现象；通常使用热复性。（退火）
缓
慢
冷
高温变性
却
热复性
急 速 冷 却 热复性在基因测序中被第广九章泛核应酸类用药物分析
复性失败
第九章核酸类药物分析
➢ （五）颜色反应
✓ 苔黑酚反应:
脱水
Fe3+
腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸
腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 胸腺嘧啶（T)
脱氧核糖
磷酸
RNA
核糖核苷酸
腺嘌呤核苷酸 鸟嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷酸
腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 尿嘧啶（U）
核糖
磷酸
第九章核酸类药物分析
稀有碱基
的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋 结构变成单链无规律的“线团”，但不发生共价 键的断裂，这过程称之。 ✓ 变性原因：高温（一般＞75℃）、强氧化剂、强 酸、碱、尿素等； ✓ 机理：双链间氢键断开，成为两条单链（ DNA双 螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失） ✓ 特征性Tm---DNA的变性温度 82~95℃
✓ 二苯胺反应 DNA 试剂：浓硫酸，二苯胺 现象：蓝色 ✓ 与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖） 现象：玫瑰红色
第九章核酸类药物分析
（二）嘌呤的鉴别
+氨制硝酸银→白色↓→红棕色（遇光） （嘌呤碱基的特殊鉴别反应）
第九章核酸类药物分析
（三）磷酸的鉴别
有机磷→无机磷+钼酸→磷钼酸+还原剂→钼蓝
第九章核酸类药物分析
➢ 取本品1％水溶液，加氨制硝酸银试液数滴， 即产生白色胶状沉淀。---嘌呤碱基
➢ 取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，在 248nm的波长处有最大吸收，在222nm的波 长处有最小吸收。
• 嘌呤——次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、 N2、N2-二甲基鸟嘌呤。
• 嘧啶——5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、 二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶
• 都是基本碱基的化学修饰型。
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O 1-甲基次黄嘌呤
N H3C
N
N
N
H2N
N
H
鸟嘌呤
O N
N
N
H
次黄嘌呤
第九章核酸类药物分析
二、理化性质
➢ （一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性） pH影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.0~11.0
现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物一般都用 此法测定含量
➢ HPLC
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四、实例分析
➢ 肌苷 ➢ ATP
第九章核酸类药物分析
（一）肌苷的质量分析
1.结构：C10H12N4O5 268.23
本品为9β-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含 C10H12N4O5应为98.0～102.0％。
➢ （二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂 ➢ （三）UV：λmax=260nm 蛋白质280nm
A260/A280 纯DNA＞1.8 纯RNA应达到2.0 混有杂蛋白 比值降低
第九章核酸类药物分析
第九章核酸类药物分析
➢ （四）变性和复性 ✓ 1.变性：在某些理化因素影响下，DNA双螺旋区
2.性状：
本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。 本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐 酸和氢氧化钠溶液中易溶。
第九章核酸类药物分析
3.鉴别
➢ 取0.01％供试品溶液适量,加等体积的3,5-二羟 基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁各 0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中 加热约10分钟，即显绿色。---苔黑酚反应
戊糖
核糖 (in RNA)
2｀－脱氧核糖 (in DNA)
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核苷
第九章核酸类药物分析
DNA & RNA
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碱基
嘧啶环
RNA
尿嘧啶 U
DNA
胞嘧啶 C
胸腺嘧啶 T 腺嘌呤 A
嘌呤环
鸟嘌呤 G
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类别 基本单位
核苷酸
碱基 五碳糖
酸
DNA
脱氧核糖核苷酸
➢ 1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步 澄清，在X射线衍射技术支持下1953年结构澄清。
➢ 核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA） 的通称。
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一、结构和分类
核酸
核苷酸
水
解
磷酸
核苷
戊糖
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碱基
核酸
核苷酸
代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA 而言为核糖；
RNA中核糖+浓HCl（浓H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深绿色化
合物（ λmax=670nm ）
✓ 二苯胺反应:
DNA中脱氧核糖+浓H2SO4 →5-羟基-4-羰基戊醛+二苯胺→
蓝色化合物（ λmax=595nm ）
✓ 水解后磷酸：
磷酸+钼酸→磷钼酸+还原剂（维生素C、氯化亚锡等） →钼 蓝（ λmax=660nm ）
（四）特征吸收光谱
UV：嘌呤环，嘧啶环 IR
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（五）熔点测定
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二、检查
➢ 一般检查
酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度
➢ 蛋白质检查
磺基水杨酸溶液
➢ 有关物质
纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查
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三、含量测定
➢ 紫外-可见分光光度法