高效液相色谱

高效液相色谱

二、定义色谱法(Chromatography)：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。

*经验性学科色谱法的分离原理利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以及在两相间分配系数的差异,当两相相对移动时各组分在两相中反复多次重新分配结果使混合物得到分离。

两相中固定不动的一相称固定相(Stationaryphase)移动的一相称流动相(Mobilephase)携带样品流过整个系统的流体。

色谱发展史◆年前俄国的植物学家Tswett创立了色谱法。

由Tswett创立的色谱法分离效率低分离时间长根据样品的不同一般分离需要几小时至几天。

◆世纪年代至年代初先后出现了纸色谱（paperchromatography,PC）和薄膜色谱法(thinlayerchromatography,TLC)。

特点：较经典色谱法简单、分离时间短样品量要求小。

◆年James和Martin提出了气相色谱法（gaschromatography,GC)特点：以气体作为流动相。

应用范围广泛受到人们重视。

但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。

◆世纪年代后期由于新型色谱柱填料的高压输液泵和高灵敏度的检测器的出现发展出了高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatography,HPLC）。

液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用*LCGCCE:泳毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),是近年来发展最快的分析方法之一。

SFC：supercriticalfluidchromatography超临界流体色谱。

一、液固吸附色谱（一）分离原理（二）常用吸附剂（三）吸附剂和流动相的选择经典液相色谱（一）分离原理各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质硅胶氧化铝聚酰胺硅胶结构：内部硅氧交联结构→多孔结构表面有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心特性：）与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性↑吸附能力↑→强极性吸附中心不易洗脱）吸水→失活→～OC烘干分钟(可逆失水)→吸附力最大→OC烘干(不可逆失水)→活性丧失无吸附力适用：分析酸性或中性物质氧化铝碱性氧化铝pH～适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH＞适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH～适于分析酸性、中性物质聚酰胺氢键作用氢键能力↑强组分越后出柱（三）吸附剂和流动相的选择：依据被测组分、吸附剂和流动相的性质被测组分性质（极性大小）：烃＜＜羧酸醇吸附剂的活性：吸附剂的活性↑大对被测组分的吸附能力↑强强极性物质选择弱吸附剂弱极性物质选择强吸附剂流动相的极性：流动相极性↑大对被测组分的洗脱能力↑大“相似相溶”原则：根据组

分性质、吸附剂的活性选择适当极性的流动相三者关系图示：组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性二、薄层色谱法（一）概述（二）定性参数（三）吸附剂的选择（四）展开剂的选择（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析（一）概述．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上形成薄层而进行色谱分离和分析的方法．操作过程：铺板→活化→点样→展开→定位(定性)洗脱(定量)．分离机制：吸附（分配离子交换空间排阻）．特点：分析快速、灵敏、显色方便．应用：药物杂质检查、纯度测定LLL（二）定性参数比移值Rf讨论Rf与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关色谱条件一定Rf只与组分性质有关是薄层色谱基本定性参数说明组分的色谱保留行为）K↑大Rf↓小）薄层板一定对于极性组分展开剂极性↑大Rf↑大（容易洗脱）展开剂极性↓小Rf↓小（不容易洗脱））Rf范围：Rf（组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）Rf=（常用）（最佳）相对比移值Rs参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差大大提高重现性和可靠性参考物可以是后加入纯物质也可为样品中已知组分相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关范围可以大于或小于（三）吸附剂的选择根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强弱极性吸附剂被测物极性弱强极性吸附剂（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择）根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析定性分析日光紫外光显色定量分析洗脱法薄层扫描法三、纸色谱法将固定相放在纸上以纸做载体进行

点样、展开、定性、和定量的液液分配色谱法固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：同液液分配色谱定性参数：RfRf与组分性质、流动相及溶解度有关极性组分→易保留Rf小（流动相极性↑Rf↑）非极性组分→易流出Rf大（流动相极性↑Rf↓）高效液相色谱知识经典LC与HPLC比较HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便HPLC:采用高压输液泵高效微粒固定相和高灵敏度检测器GC与HPLC比较分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物高效液相色谱的固定相和流动相（－）固定相高效液相色谱固定相依据承受高压能力来分类可分为刚性固体和硬胶两大类。

刚性固体以二氧化硅为基质可承受O×～O×Pa的高压可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。

如果在二氧化硅表面键合各种官能团就是键合固定相是目前最广泛使用的一种固定相。

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。

可承受压力上限为×Pa。

固定相按孔隙深度分类可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

*表面多孔型固定相基体是实心玻璃珠在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。

表面活性材料为硅胶的固定相如国外的ZpaxCorasilI和

IIVydacPellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等表面活性材料为氧化铝的固定相如Pellumina为聚酰胺的如Pellion。

特点：多孔层厚度小、孔浅相对死体积小出峰迅速、柱效亦高颗粒较大渗透性好装柱容易梯度淋洗时能迅速达平衡较适合做常规分析。

由于多孔层厚度薄最大允许量受限制。

．全多孔型固定相由直径为nm的硅胶微粒凝聚而成。

如国外的PorasilZobbex、Lichrosorb系列上海试剂一厂的堆积硅珠青岛海洋化工厂的YWG系列天津试剂二厂的DG系列等。

由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相如国外的LichrosorbALOXT。

特点：颗粒很细（μm）孔仍然较浅传质速率快易实现高效、高速。

特别适合复杂混合物分离及痕量分析*（二）流动相高效液相色谱中流动相是液体它对组分有亲和力并参与固定相对组分的竞争。

对流动相溶剂的要求是：（）溶剂对于待测样品须具有合适的极性和好的选择性。

（）溶剂要与检测器匹配。

对于紫外吸收检测器应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。

所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时溶剂对此辐射产生强烈吸收此时溶剂被看作是光学不透明的它严重干