高效液相色谱

高效液相色谱二、定义色谱法(Chromatography)：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。

*经验性学科色谱法的分离原理利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以及在两相间分配系数的差异,当两相相对移动时各组分在两相中反复多次重新分配结果使混合物得到分离。

两相中固定不动的一相称固定相(Stationaryphase)移动的一相称流动相(Mobilephase)携带样品流过整个系统的流体。

色谱发展史◆年前俄国的植物学家Tswett创立了色谱法。

由Tswett创立的色谱法分离效率低分离时间长根据样品的不同一般分离需要几小时至几天。

◆世纪年代至年代初先后出现了纸色谱（paperchromatography,PC）和薄膜色谱法(thinlayerchromatography,TLC)。

特点：较经典色谱法简单、分离时间短样品量要求小。

◆年James和Martin提出了气相色谱法（gaschromatography,GC)特点：以气体作为流动相。

应用范围广泛受到人们重视。

但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。

◆世纪年代后期由于新型色谱柱填料的高压输液泵和高灵敏度的检测器的出现发展出了高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatography,HPLC）。

液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用*LCGCCE:泳毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),是近年来发展最快的分析方法之一。

SFC：supercriticalfluidchromatography超临界流体色谱。

一、液固吸附色谱（一）分离原理（二）常用吸附剂（三）吸附剂和流动相的选择经典液相色谱（一）分离原理各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质硅胶氧化铝聚酰胺硅胶结构：内部硅氧交联结构→多孔结构表面有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心特性：）与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性↑吸附能力↑→强极性吸附中心不易洗脱）吸水→失活→～OC烘干分钟(可逆失水)→吸附力最大→OC烘干(不可逆失水)→活性丧失无吸附力适用：分析酸性或中性物质氧化铝碱性氧化铝pH～适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH＞适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH～适于分析酸性、中性物质聚酰胺氢键作用氢键能力↑强组分越后出柱（三）吸附剂和流动相的选择：依据被测组分、吸附剂和流动相的性质被测组分性质（极性大小）：烃＜＜羧酸醇吸附剂的活性：吸附剂的活性↑大对被测组分的吸附能力↑强强极性物质选择弱吸附剂弱极性物质选择强吸附剂流动相的极性：流动相极性↑大对被测组分的洗脱能力↑大“相似相溶”原则：根据组分性质、吸附剂的活性选择适当极性的流动相三者关系图示：组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性二、薄层色谱法（一）概述（二）定性参数（三）吸附剂的选择（四）展开剂的选择（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析（一）概述．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上形成薄层而进行色谱分离和分析的方法．操作过程：铺板→活化→点样→展开→定位(定性)洗脱(定量)．分离机制：吸附（分配离子交换空间排阻）．特点：分析快速、灵敏、显色方便．应用：药物杂质检查、纯度测定LLL（二）定性参数比移值Rf讨论Rf与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关色谱条件一定Rf只与组分性质有关是薄层色谱基本定性参数说明组分的色谱保留行为）K↑大Rf↓小）薄层板一定对于极性组分展开剂极性↑大Rf↑大（容易洗脱）展开剂极性↓小Rf↓小（不容易洗脱））Rf范围：Rf（组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）Rf=（常用）（最佳）相对比移值Rs参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差大大提高重现性和可靠性参考物可以是后加入纯物质也可为样品中已知组分相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关范围可以大于或小于（三）吸附剂的选择根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强弱极性吸附剂被测物极性弱强极性吸附剂（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择）根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析定性分析日光紫外光显色定量分析洗脱法薄层扫描法三、纸色谱法将固定相放在纸上以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液液分配色谱法固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：同液液分配色谱定性参数：RfRf与组分性质、流动相及溶解度有关极性组分→易保留Rf小（流动相极性↑Rf↑）非极性组分→易流出Rf大（流动相极性↑Rf↓）高效液相色谱知识经典LC与HPLC比较HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便HPLC:采用高压输液泵高效微粒固定相和高灵敏度检测器GC与HPLC比较分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物高效液相色谱的固定相和流动相（－）固定相高效液相色谱固定相依据承受高压能力来分类可分为刚性固体和硬胶两大类。

刚性固体以二氧化硅为基质可承受O×～O×Pa的高压可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。

如果在二氧化硅表面键合各种官能团就是键合固定相是目前最广泛使用的一种固定相。

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。

可承受压力上限为×Pa。

固定相按孔隙深度分类可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

*表面多孔型固定相基体是实心玻璃珠在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。

表面活性材料为硅胶的固定相如国外的ZpaxCorasilI和IIVydacPellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等表面活性材料为氧化铝的固定相如Pellumina为聚酰胺的如Pellion。

特点：多孔层厚度小、孔浅相对死体积小出峰迅速、柱效亦高颗粒较大渗透性好装柱容易梯度淋洗时能迅速达平衡较适合做常规分析。

由于多孔层厚度薄最大允许量受限制。

．全多孔型固定相由直径为nm的硅胶微粒凝聚而成。

如国外的PorasilZobbex、Lichrosorb系列上海试剂一厂的堆积硅珠青岛海洋化工厂的YWG系列天津试剂二厂的DG系列等。

由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相如国外的LichrosorbALOXT。

特点：颗粒很细（μm）孔仍然较浅传质速率快易实现高效、高速。

特别适合复杂混合物分离及痕量分析*（二）流动相高效液相色谱中流动相是液体它对组分有亲和力并参与固定相对组分的竞争。

对流动相溶剂的要求是：（）溶剂对于待测样品须具有合适的极性和好的选择性。

（）溶剂要与检测器匹配。

对于紫外吸收检测器应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。

所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时溶剂对此辐射产生强烈吸收此时溶剂被看作是光学不透明的它严重干扰组分的吸收测量。

表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。

对于折光率检测器要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相以达最高灵敏度。

（）高纯度。

由于高效液相灵敏度高对流动相溶剂的纯度也要求高。

不纯的溶剂会引起基线不稳或产生“伪峰”。

痕量杂质的存在将使截止波长值增加～OOnm。

（）化学稳定性好。

不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。

()低粘度。

若使用高粘度溶剂势必增高压力不利于分离。

常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙腈等。

但粘度过于低的溶剂也不宜采用例戊烷、乙醚等它们易在色谱柱或检测器内形成气泡影响分离。

高效液相色谱法分类及分离机理分配色谱样品组分在吸附于惰性载体上的固定液和流动相之间分配系数不同键合相色谱样品组分在键合于惰性载体上的固定液和流动相之间的分配系数不同吸附色谱样品组分对固定相表面吸附力不同体积排阻色谱利用固定相孔径不同把样品组分按分子大小分开离子交换色谱不同离子与固定相上相反电荷间的作用力大小不同亲和色谱利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力进行选择性分离的一种方法（一）分配色谱（partitionchromatography）原理：固定液吸附在惰性载体上样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同分别进入两相分配而实现分离。

适用于各种样品类型的分离和分析无论是极性的和非极性的水溶性和油溶性的离子型的和非离子型的化合物。

固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。

由于液液色谱中流动相参与选择竞争因此对固定相选择较简单。

只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。

例如最常用的强极性固定液ββ′一氧二丙睛中等极性的聚乙二醇非极性的角鲨烷等。

流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。

对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。

根据所使用的流动相和固定相的极性程度将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。

如果采用流动相的极性小于固定相的极性称为正相分配色谱它适用于极性化合物的分离。

其流出顺序是极性小的先流出极性大的后流出。

如果采用流动相的极性大于固定相的极性称为反相分配色谱。

它适用于非极性化合物的分离其流出顺序与正相色谱恰好相反。

反相色谱最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。

水－甲醇体系：大约％水的时候粘度最大水－乙腈体系：％水的时候粘度最大。

(二)键合相色谱（Covalent－stationaryphasechromatography）为了更好解决固定液在载体上流失问题。

产生了化学键合固定相。

将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。

它代替了固定液的机械涂渍因此对液相色谱法迅速发展起着重大作用可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。

目前应用最广泛的一种固定相约有以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。

键合固定相优点：对极性有机溶剂有良好的化学稳定性使色谱柱的柱效高、寿命长实验重现性好几乎适于各种有机化合物的分离可以梯度洗脱。

缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。

．键合固定相类型用来制备键合固定相的载体几乎都用硅胶。

利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)反应成键,可得到各种性能的固定相。

一般可分三类（）疏水基团如不同链长的烷烃（C和C）和苯基等（）极性基团如氨丙基氰乙基、醚和醇等。

（）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基季铵盐作为阳离子交换基团的磺酸等．键合固定相的制备（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的键合固定相。

用醇与硅醇基发生酯化反应：≡Si－H＋ROH→≡Si－OR＋H由于这类键合固定相的有机表面是一些单体具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定因此仅适用于不含水或醇的流动相。