蛋白免疫印迹杂交技术手册
免疫印记手册第六版
《蛋白质印迹手册》第六版Western blotting技术作为生物实验室中最给力的工具之一，一直被研究人员广泛使用。
默克密理博公司的《蛋白质印迹手册》（Protein Blotting Handbook）详细介绍了western blotting的原理、操作和技巧，无论是对初学者，还是对希望进一步优化实验的达人，都将带来极大的帮助。
最新第六版的手册在优化抗体浓度和降低背景方面增加了更全面的指引，同时扩展了荧光检测的数据和操作步骤，是蛋白质印迹实验不可缺少的好伙伴。
一、膜的选择摘要：PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜，各有什么特点？我们该如何选择？近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领先供应商。
它目前提供三种PVDF膜。
这三种膜有何不同，分别适合哪些应用呢？详见本文。
印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素：•蛋白质结合能力•是否需要用醇预湿•开展多次剥离（stripping）和再生检测（reprobing）实验的能力•蛋白质观察•长期印迹保存•信噪比聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素(NC)是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。
硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。
表1. PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较与硝酸纤维素膜相比，电转到PVDF膜上有许多优点。
PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性（Pluskal等，1986）。
其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。
使用PVDF膜的另一个优点是，单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中，如考马斯蓝染色，接着切割条带进行N端测序，蛋白质水解/肽段分离/内部测序，以及免疫检测（Kurien等，2003）。
市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80 –100 μg/cm2，而PVDF膜的结合能力是100 –200 μg/cm2。
在检测血清中人免疫缺陷病毒（HIV）时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，结果表明，PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测（Lauritzen和Pluskal，1998）。
蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册
蛋白免疫印迹杂交 Western Blot 技术手册蛋白免疫印迹杂交 Western Blot WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离 再转移到杂交膜blot 上 然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析 有助于成功完成WB。
A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳 1 PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker 3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳 C 转膜与显色Western Blot 1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测 丽春红4膜的封闭 5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制2WB概述: 检测原理: 3A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步 更是决定WB成败的关键步骤 总体原则和注意事项 1 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2 保持蛋白的处于溶解状态 通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择 3 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等 低温操作 加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 尽量去除核酸 多糖 脂类等干扰分子 通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5 样品分装 长期于-80℃中保存 避免反复冻融。
A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA 附录1 全蛋白抽提试剂盒细胞质 可溶蛋白 Tris-HCl 附录1 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质 细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton 附录1 蛋白分级抽提试剂盒细胞质 磷酸化蛋白 磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1 膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA 附录1 核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA 附录1 线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次 裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂 种类与量见本节2 2 吸净PBS 加入预冷的裂解液 1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask. 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞 将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4 4℃摇动30 min 5 4℃离心12000 rpm 20 min 根椐细胞种类不同调整离心力 6 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织 尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中 加入液氮冻结组织于冰上均质研磨 长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer 冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时 裂解液体积与组织样本量有适当比例 最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml. 4 4℃离心12000 rpm 20 min 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL 或按下表配制 备注 其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下 所有步聚均需在通风橱中进行 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至9.0 6. 再煮沸至无色7. 重复上述过程直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford 法Lowry 法或BCA 法 均有商品化试剂盒可选择 操作简单、需分光光度计或酶标仪 小牛血清白蛋白BSA 作为标准曲线。
蛋白质免疫印迹技术
（一）多克隆抗体的概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接
受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 （Monoclone antibody）。 由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种 各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用
血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 （serologic reaction）。
编辑ppt
二、印迹法（blotting）
印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
编辑ppt
抗体的种类
抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白 （immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中，是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同， 分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。
编辑ppt
抗原的分类
抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称
为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原
称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
编辑ppt
淋巴组织
免疫活性细胞
免疫活性介质
编辑ppt
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹技术【62页】
免疫应答的类型
（一）固有性免疫应答（innate immune response) 又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体
在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。
（二）适应性免疫应答（adaptive immune response） 又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出
每2～3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，
制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需 再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达 到预期水平时，即可放血制备抗血清。
ห้องสมุดไป่ตู้
抗体的产生顺序与丰度
（七）抗血清的采集与保存
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血， 一是颈动脉放血，也可心脏采血。
解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五 上）。
2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置 （加少量NaOH促溶） （周四下午）。
苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠
标记部位 头 左前肢 左后肢 背 右前肢 右后肢 左耳朵 右耳朵
组号 1 2 3 4 5 6 7 8
生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。 （具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）
抗原和免疫原性
抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特 异性反应的物质。
常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。
效价 抗血清的效价，就是指血清中所含 抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用 的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体 均适用。
实验七 蛋白质免疫印迹实验(Western Blotting)
二试剂和器材
1．试剂 PBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml, 分装后，15磅20分钟灭菌。 4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶 于1ml无水乙醇中制成母液。将50µ14-CN对母液和 5µ130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰 乙酸 氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水
一 实验原理
电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治” 结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓 冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶 上转移到固体支持物上。
一 实验原理
二试剂和器材
2．器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 φ25cm培养皿
玻璃棒
三 操作步骤
1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的 硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示
10、100、1000 uL 枪头与移液枪、EP 管、EP 管防爆夹、96 孔板、单格或 5 格孵育盒、镊子、锡纸、保鲜膜、
滤纸、乳胶手套、薄膜手套、医用口罩等
A 蛋白样本提取制备
A-1 细胞或组织裂解
A-2 蛋白定量
A-3 电泳上样样品的准备 一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要
(2) 主要试剂： 1） RIPA 等裂解液 2） 2×或 5×或 6×或 10×蛋白上样缓冲液 3） 彩色预染蛋白质分子量标准 4） 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine, TEMED） 5） 10%过硫酸铵（ammomium persulfate, APS） 6） TrisCl,1.5M(PH 8.8) 缓冲液 7） TrisCl,1M(PH6.8) 缓冲液 8） 30% Acr-Bis(29:1) (即 30% acrylamide-bisacrylamide) 9） 甘氨酸（Glycine） 10）Tris 碱（Trisbase） 11）十二烷基硫酸钠（SDS） 12）甲醇（methanol） 13）吐温-20（Tween-20） 14）牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉 15）PVDF 膜 16）ECL 显色底物 A 液和 B 液 （3）抗体 1）β-Actin 等内参抗体 2）辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 等带 HRP 的二抗 3）指标抗体
C-7 显色 (化学发光法) 现在最常用的是化学发光法：HRP 化学发光底物 Lumino（l ECL 法 chemiluminescence）及其改良法， 对
于 HRP 偶联的二抗，一般传统上使用 ECL 和 ECL+，推荐使用后者，更灵敏。其中不同商家的产品特点总 结 如下表：
蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册
蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。
A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。
蛋白免疫印迹（WesternBlot）
蛋白免疫印迹（WesternBlot）1.4.9 细胞裂解液50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。
1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。
1.4.12转膜缓冲液Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。
4℃避光保存。
1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。
1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。
1.4.15 10%SDSSDS 10g，ddH2O定容100ml。
1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）丙烯酰胺29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃保存一月。
1.4.17 10×TBST缓冲液浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再做10 倍稀释。
1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。
1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）APS 10g，ddH2O定容100ml。
免疫印迹(Western Blot)操作规程
免疫印迹（Western Blot）操作规程实验目的：免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达15.14g Tris 10 ml 10% SDS 溶解后调节 pH 到6.8 需要注意的是要在低温调节pH电极缓冲液：1L 6g Tris 28.8g Gly 溶解后加10ml 10% SDS 定容到1L样品处理液：须配制20*buffer 200mM Tris 20mM EDTA pH 8.05*loading buffer(see Takara)组分：250mM Tris-HCL(PH6.8) 10%SDS 0.5%BPB 50%甘油 5%β-巯基乙醇（2-ME）1M Tris-HCL(PH6.8) 1.25mlSDS 0.5gBPB 25mg甘油 2.5ml去离子水溶解后定容到5ml小份（500ul/份）分装后，于室温保存。
使用前将25ul的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading buffer可在室温下保存一个月左右。
实验操作程序：样品处理由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM(sigma)及NaF25mM(sigma)）。
注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
蛋白裂解液：PBS+1%Triton+1%SDS+1*Protease inhibitor cockerIII (蛋白酶抑制剂，MEK:59134-1set)+Na3VO4 0.1mM(sigma)及NaF 25mM(sigma)）。
或者Phosphatase Inhibitor Cocktail III (磷酸酶抑制剂，biovision：K276-1EA) 培养的细胞（定性）：1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示
B 电泳
B-1 PAGE 胶的制备 聚丙酰胺凝胶 PAGE 电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE 胶是由两种化合物聚合 而成的，即丙烯酰胺（acr）和 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为 中性、水溶性、三维网 状结构。 不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高 浓度胶分离。
浸泡甲醇中 1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分 钟， 否则转膜时会导致条带变形。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽春红染色， 丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法： 将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变
B-2 蛋白分子量 Marker 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白免疫印迹技术(WesternBlot)介绍
• 上样
SDS-PAGE电泳
Staking gel Separating gel
转膜
• 膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素
（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋 白印迹。 • 孔径
蛋白免疫印迹技术介绍
主要内容
• Western Blot原理 • Western Blot特点及应用 • Western Blot一般流程 • Western Blot常见问原理
• 混合样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离，凝胶 中的蛋
一抗、二抗孵育
• 抗体选择 • 抗体稀释液 • 孵育条件 • 漂洗
显色
显色
• 化学发光检测
• 荧光法
显色
GE AI800凝胶成像系统
Western Blot 常见问题
• 样品制备 样本保存 蛋白酶抑制剂
• 抗体 正规厂家，有示例图 抗体保存 一抗二抗匹配 内参和对照
Western Blot 常见问题
法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优 缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应 蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品 浓度
SDS-PAGE电泳
• SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的 氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
Western Blot 应用
• 从混合蛋白样品中检测目的蛋白 • 目的蛋白的组织定位 • 目的蛋白的表达量分析 • 目的蛋白与其他大分子间相互作用
蛋白免疫印迹杂交实验方法
Western Blot（蛋白质免疫印迹技术）一、实验原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后，将蛋白转移至固相支持物—NC膜上，根据抗原和抗体之间的反应特性，通过特异性试剂（抗体）作为探针（一抗/二抗），对靶物质（抗原）进行检测。
蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
Western Blot 流程图：样品聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）转膜封闭洗膜（3×5mins）孵育一抗（4度过夜或室温4-6小时）洗膜（3×10mins）孵育二抗（室温2小时）洗膜（3×10mins）显影SDS-PAGE分离蛋白的原理和操作:1. SDS-PAGE作用原理聚丙烯酰胺凝胶是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
另外一种是SDS-PAGE，SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
WB 技术手册
适 用 于 脂 类 含 量 较 耗费时间长 40～
Folin － 酚 试 肽键与 Cu2+螯合，形成蛋白 对可达 1-1500μg/ml 高的样品测定，也能 60 分钟；操作要严
剂法
质一铜复合物，还原酚磷
耐 受 相 当 浓 度 的 去 格计时；颜色深浅
钼酸产生蓝色化合物，蓝
垢剂如 SDS。
随不同蛋白质变
ß-mercaptoethanol and DTT
蛋白状态
凝胶状态
loading buffer
电泳缓冲液
还原—变性
还原和变性
有 ß-mercaptoethanol 或 有 SDS
DTT 和SDS
还原—天然
还原和非变性
有 ß-mercaptoethanol 或 无 SDS
DTT ，无 SDS
氧化-变性
2X Laemmli buffer 4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl Check the pH and bring it to pH 6.8. SDS 的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的 SDS 数量不同，所带负电荷也不同， 电泳迁移速度不同，因此 SDS-PAGE 电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
凝胶浓度 (%)
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
A-1 细胞或组织裂解
A-1-1 细胞裂解
裂解液 Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*
目的蛋白分布定位
推荐裂解液 Lysis buffe
蛋白免疫印迹
蛋白免疫印迹(Western Blot)技术指南一、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术概览蛋白免疫印迹(Western Blot，以下简称WB)是利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。
一般我们使用WB都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，通常要以表达相对稳定的蛋白作为内部对照（内参），然后采用“灰度分析软件”检测目的蛋白及内参条带的表达强度，每组目的蛋白分别以内参作为对照进行比对和相对定量，以使实验结果更加准确。
同时，同一批样品至少进行技术重复三次，然后方可进行统计学分析。
WB灵敏度可达ng级，用ECL显色法理论上可达pg级。
二、蛋白免疫印迹(WB)实验所需仪器、材料及试剂（一）主要实验仪器制冰机、超声破碎仪、低温冷冻离心机、蛋白电泳/转膜仪、多功能酶标仪、LI-COR Odyssey成像系统（二）主要实验试剂与材料15ml离心管、玻璃组织研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提试剂(改进型RIPA配方，Bioss 产品货号C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量试剂盒(Bioss产品货号C05-02001)、30%丙烯酰胺-N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss产品货号C05-03004)、10%过硫酸铵(APS)(Bioss产品货号C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss产品货号C05-03008)、4×蛋白上样缓冲液(Bioss产品货号C05-03015)、蛋白Marker(Bioss产品货号C05-090006)、电泳缓冲液(Bioss产品货号C05-03010)、转膜缓冲液(Bioss产品货号C05-05003)、考马斯亮蓝染色液(Bioss产品货号C05-04001)、TBST缓冲液(pH7.4)(Bioss产品货号C5049)、PVDF膜(Bioss产品货号C55008)或NC膜(0.22µm)(Bioss产品货号C05-05002)、丽春红染色液(Bioss产品货号C05-04002)、脱脂奶粉(Bioss产品货号C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀释液(Bioss产品货号C05-07001)、HRP标记二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或荧光标记二抗(Bioss内部操作流程选用荧光二抗，Bioss产品货号bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀释液(Bioss产品货号C05-07002)、ECL发光液(Bioss产品货号C05-07004)、膜再生液(Bioss产品货号C05-03041)Western Blot操作流程图三、蛋白免疫印迹(WB)实验标准操作流程和技术要点（一）蛋白提取●组织样品蛋白提取方法1.用灭菌（预冷）的工具分离新鲜目的组织50mg-100mg，并用生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
蛋白质免疫印迹杂交实验 -
蛋白质免疫印迹杂交实验实验目的：1. 了解制备中抗原与抗体杂交显色的原理2. 初步掌握蛋白质印迹杂交实验的操作方法3. 观察和分析着色后的蛋白质的特点和含量实验原理：蛋白质印迹法(Western Blot)是一种蛋白质学中常用的检测方法，是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到固相载体上，再用探测反应和底物着色，从而检测在所分析的细胞或组织中目的基因表达的蛋白质情况。
大致过程：Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
实验材料：1.配置SDS-PAGE凝胶相关材料及各种缓冲溶液2.蛋白质样品：可以使用适当的裂解液，裂解细胞获得。
测定每个蛋白质样品浓度？实验步骤：蛋白质印迹法主要分三个阶段进行1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)2、电转移，又称为转膜3、酶联免疫显色检测第一阶段：在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动，且分子量越小，泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察。
第二阶段：即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA,通电90 min即可将凝胶中的用恒流300 mA,通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100
μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
A-4 电泳上样样品的准备
5
A-4-1 变性、还原蛋白样本 一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将
1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
1
2
4
8
12 16 20
去离子水（μL）
20 19 18 16 12
8
4
0
对应蛋白含量（μg）
0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
2. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混
A-4-2 天然和非还原样本 某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明
书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。 某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，因此 loading buffer 和电泳液中不加入
3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，
4 4℃摇动 30 min 5 4℃离心 12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.
A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或 Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C， 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组 织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心 12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本， 弃沉淀,
匀；
3. 各孔加入 200μL BCA 工作液；
4. 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）
为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37
℃放置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值；
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20
μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
B． 分光光度计测定
1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂
A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
3
推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或 COOKTAIL，或按下表配制：
备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下： 所有步聚均需在通风橱中进行：
1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至 9.0 6. 再煮沸至无色 7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积 9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用.
匀；
3. 各管加入 1000μL BCA 工作液；
4. 各管充分混匀，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光
值为纵坐标，绘出标准曲线；
5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为 100μL，加入 BCA 工作液 1000μL，充分混匀，37
℃放置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值；
ß-mercaptoethanol and DTT
蛋白状态
凝胶状态
loading buffer
电泳缓冲液
还原—பைடு நூலகம்性
还原和变性
有 ß-mercaptoethanol 或 有 SDS
DTT 和SDS
还原—天然
还原和非变性
有 ß-mercaptoethanol 或 无 SDS
DTT ，无 SDS
氧化-变性
2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的 PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择） 3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
A-3 蛋白定量
Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小
牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。三种方
法或产品比较列表如下：
方法
原理
灵敏性
干扰因素
应用
Lowry 法
蛋白质在碱性溶液中 较高约 5μg/ml
2X Laemmli buffer 4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl Check the pH and bring it to pH 6.8. SDS 的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的 SDS 数量不同，所带负电荷也不同， 电泳迁移速度不同，因此 SDS-PAGE 电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备
B 电泳 1 PAGE 胶的制备 2 蛋白分子量 Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳
C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色
凝胶浓度 (%)
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
细胞裂解操作方法：
1 培养的细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节 2）
2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106
cells/60mm dish/75cm2 flask).
蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构， 蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸
5 分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 分钟，标准的上样 buffer 称为 2X Laemmli buffer， 上样时与样本！：！混合后变性上样即可：
（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网
状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和
C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加，
D 常见问题分析与解决方案
附录 1 WB 实验试剂配制方法 附录 2 SDS-PAGE 胶的配制
WB 概述: 检测原理:
2
A 蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，更是决定 WB 成败的关键步骤， 总体原则和注意事项：
1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）
细胞质（细胞骨架等不溶蛋白） Tris-Triton（附录 1）
蛋白分级抽提试剂盒
细胞质（磷酸化蛋白）
磷酸化蛋白抽提试剂盒
细胞膜
NP-40 or RIPA（附录 1）
膜蛋白抽提试剂盒
蛋白分级抽提试剂盒
细胞核
RIPA（附录 1）
核蛋白抽提试剂盒
线粒体
RIPA（附录 1）
线粒体蛋白抽提试剂盒
亚细胞定位蛋白抽提试剂盒
适 用 于 脂 类 含 量 较 耗费时间长 40～
Folin － 酚 试 肽键与 Cu2+螯合，形成蛋白 对可达 1-1500μg/ml 高的样品测定，也能 60 分钟；操作要严
剂法
质一铜复合物，还原酚磷
耐 受 相 当 浓 度 的 去 格计时；颜色深浅
钼酸产生蓝色化合物，蓝
垢剂如 SDS。
随不同蛋白质变
A-1 细胞或组织裂解
A-1-1 细胞裂解
裂解液 Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*
目的蛋白分布定位
推荐裂解液 Lysis buffe
推荐试剂盒
全细胞
NP-40 or RIPA（附录 1）
全蛋白抽提试剂盒
细胞质（可溶蛋白）
Tris-HCl（附录 1）
胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒
线粒体蛋白提取试剂盒