无乳链球菌的检测试剂盒、检测方法与相关技术

本技术公开了一种无乳链球菌的检测试剂盒及其检测方法。

该试剂盒包括用于稀释奶液样品的无菌生理盐水、用于菌体裂解的裂解缓冲液，该试剂盒还包括：用于将溶液中残余的乳蛋白和脂类物质溶解在溶液中的洗涤液，用于吸附在分散的二氧化硅的载体上的核酸脱离在溶液中的洗脱液，以及，吸附体系；其中，所述吸附体系为重悬有包埋性单分散二氧化硅磁性微球的裂解缓冲液。

本技术通过上述检测试剂盒提取含有待检生物材料的核酸，再通过PCR检测反应体系对上述核酸进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳观察，当220bp处出现条带则判定为阳性样。

本技术能直接从奶液中提取无乳链球菌的核酸，检测效率更高、假阳性率也更低。

权利要求书
1.一种无乳链球菌的检测试剂盒，该试剂盒包括用于稀释奶液样品的无菌生理盐水、用于菌体裂解的裂解缓冲液，其特征在于，该试剂盒还包括：用于将溶液中残余的乳蛋白和脂类物质溶解在溶液中的洗涤液，用于吸附在分散的二氧化硅的载体上的核酸脱离在溶液中的洗脱液，以及，吸附体系；其中，所述吸附体系为重悬有包埋性单分散二氧化硅磁性微球的裂解缓冲液。

2.如权利要求1所述的无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括浓度均为25％的纯乙醇和异丙醇、浓度为100mmol/L的NaCl、浓度为10mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl；
所述洗脱液包括浓度为10mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的EDTA。

3.如权利要求1所述的无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述裂解缓冲液中的guanidine thiocyanate浓度为3mol/L、EDTA的浓度为20mmol/L、Tris-HCl的pH为6.8、浓度为10mmol/L、Triton X100浓度为40mg/mL、DL-dithiothreitol的浓度为10mg/mL。

4.如权利要求1所述的无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述无菌生理盐水中氯化钠的浓度为0.9％wt。

5.一种无乳链球菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)通过上述权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒提取含有待检生物材料的核酸；
(2)通过PCR检测反应体系对上述核酸进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳观察。

6.如权利要求5所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述提取包括以下步骤：
A、往牛奶离心后所得的沉淀中加入裂解缓冲液和吸附体系，重悬、静置、离心、弃上清；
B、加入裂解缓冲液混匀、离心、弃上清，重复该操作一次；
C、加入洗涤液混匀、离心、弃上清，重复该过程一次；
D、加入100％乙醇溶液混匀、离心、弃上清，在温箱中干燥管底沉淀10min；
E、加入洗脱液，重悬沉淀，在65℃水浴加热，离心，取上清。

7.如权利要求6所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，在步骤A中，所述牛奶用无菌生理盐水将牛奶样品稀释、离心、弃上清，重复该过程一次。

8.如权利要求5所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述PCR检测反应体系中无乳链球菌上下游引物为：
无乳链球菌上游引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
无乳链球菌下游引物R：5-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3’。

9.如权利要求8所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，所述PCR检测反应体系是25μL反应体系：Green Taq Mix 12.5μL，dd H2O 8.5μL，无乳链球菌上下游引物各1μL，待检测菌液2μL；
该PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

技术说明书
一种无乳链球菌的检测试剂盒、检测方法
技术领域
本技术属于病原微生物检测领域，尤其涉及一种无乳链球菌的检测试剂盒，以及通过上述检测试剂盒直接从奶液中检测无乳链球菌的检测方法。

背景技术
奶牛乳房炎是奶牛的多发病，也是引起奶牛业发展的重要疾病之一，能引起产奶量及其品质下降，造成严重的经济损失。

常见的致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等。

无乳链球菌是牛群中乳腺炎的重要传染性病原菌，对规模饲养的奶牛，其危害是相当严重的。

据报道，无乳链球菌可引起新生儿败血症、脑膜炎、呼吸道和妇女生殖感染等。

在检测上，传统乳房炎病原菌的检测是通过细菌培养、生化反应或是免疫学诊断来确定，虽然较为准确，但由于需专人操作、周期长，成本高等因素，难以满足临床检验需求。

近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术在检测致病菌方面得以广泛应用，并且展现出其快速、特异的优势和前景。

国内外对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的检测方法已有一定的相关研究基础。

他们利用已知无乳链球菌16sRNA序列设计特异性引物，通过PCR 方法鉴定，然而对于病原微生物的分子检测是建立在目标DNA扩增基础上的，因此，高效提取DNA致病细菌是一个重要的步骤，这就限定了PCR鉴定技术的推广应用。

技术内容
本技术的目的在于提供一种能够准确、高效地直接从奶液中检测无乳链球菌的检测试剂盒。

本技术的再一目的在于提供上述检测试剂盒直接从包括奶液在内的乳液中直接检测无乳链球菌的方法。

本技术是这样实现的，一种无乳链球菌的检测试剂盒，该试剂盒包括用于稀释奶液样品的无菌生理盐水、用于菌体裂解的裂解缓冲液，该试剂盒还包括：用于将溶液中残余的乳蛋白和脂类物质溶解在溶液中的洗涤液，用于吸附在分散的二氧化硅的载体上的核酸脱离在溶液中的洗脱液，以及，吸附体系；其中，所述吸附体系为重悬有包埋性单分散二氧化硅磁性微球的裂解缓冲液。

优选地，所述洗涤液包括浓度均为25％的纯乙醇和异丙醇、浓度为100mmol/L的NaCl、浓度为10mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl；
所述洗脱液包括浓度为10mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的EDTA。

优选地，所述裂解缓冲液中的guanidine thiocyanate浓度为3mol/L、EDTA的浓度为20mmol/L、Tris-HCl的pH为6.8、浓度为10mmol/L、Triton X100浓度为40mg/mL、DL-dithiothreitol的浓度为10mg/mL。

优选地，所述无菌生理盐水中氯化钠的浓度为0.9％wt。

本技术进一步公开了一种无乳链球菌的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)通过上述检测试剂盒提取含有待检生物材料的核酸；
(2)通过PCR检测反应体系对上述核酸进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳观察。

优选地，在步骤(1)中，所述提取包括以下步骤：
A、往牛奶离心后所得的沉淀中加入裂解缓冲液和吸附体系，重悬、静置、离心、弃上清；
B、加入裂解缓冲液混匀、离心、弃上清，重复该操作一次；
C、加入洗涤液混匀、离心、弃上清，重复该过程一次；
D、加入100％乙醇溶液混匀、离心、弃上清，在温箱中干燥管底沉淀10min；
E、加入洗脱液，重悬沉淀，在65℃水浴加热，离心，取上清。

优选地，在步骤A中，所述牛奶用无菌生理盐水将牛奶样品稀释、离心、弃上清，重复该过程一次。

优选地，在步骤(2)中，所述PCR检测反应体系中无乳链球菌上下游引物为：
无乳链球菌上游引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
无乳链球菌下游引物R：5-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3’。

优选地，所述PCR检测反应体系是25μL反应体系：Green Taq Mix 12.5μL，dd H2O8.5μL，无乳链球菌上下游引物各1μL，待检测菌液2μL(即上述步骤E中所获得的上清2μL)；
该PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

在步骤(2)中，电泳观察结果中，若220bp处出现条带则判定为阳性样；否则为阴性样。

相比于现有技术的缺点和不足，本技术具有以下有益效果：本技术检测试剂盒能直接从奶液中提取无乳链球菌的核酸，相较于传统细菌检测24小时培养期来说，大大缩短了提取时间，提高了检测效率；此外，直接利用奶液检测，即使奶液只含有微量的病原菌也可检出，这样高度的敏感性很大程度上提高了隐形乳房炎和乳房炎早期奶液检出率，最大限度地降低了假阴性情况的发生。

附图说明
图1是本技术试剂盒提取无乳链球菌的特异性检验结果；其中，泳道1～5和8～12孔分别为停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、液化沙雷氏菌，泳道6为无乳链球菌，泳道7为阴性对照；泳道M为DL2000plus DNA Marker，图中箭头指向核酸大小为220bp。

具体实施方式
为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本技术进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。

实施例1
(1)无菌生理盐水(NaCl 0.9％)将牛奶样品稀释后，离心，弃上清。

重复上述过程一次；
(2)在沉淀中加入裂解缓冲液和的吸附体系，重悬于无菌生理盐水中。

在室温放置5分钟。

离心，弃上清；
(3)再次加入裂解缓冲液并混匀。

离心，弃上清，重复此过程一次；
(4)加入洗涤液并混匀。

离心，弃上清，重复此过程一次；
(5)加入100％乙醇溶液并混匀。

离心并弃上清。

在温箱中干燥管底沉淀10min；
(6)加入洗脱液，重悬沉淀，在65°水浴加热后，离心，将上清转移到新EP管中，室温放置5min，该新EP管中所获得的上清即为待检测菌液。

实施例2
通过PCR检测反应体系对上述核酸进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳观察。

在本实施例中，PCR检测反应体系是25μL反应体系：Green Taq Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL，无乳链球菌上下游引物各1μL，待检测菌液2μL；
该PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min；
所述PCR检测反应体系中无乳链球菌上下游引物为：
无乳链球菌上游引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
无乳链球菌下游引物R：5-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3’。

其中，选择上述实施例1制备得到的待检测菌液为对象，并选取含有停乳链球菌(1×103CFU/mL)、乳房链球菌(1×103CFU/mL)、大肠杆菌
(1×103CFU/mL)、产酸克雷伯菌(1×103CFU/mL)、液化沙雷氏菌(1×103CFU/mL)的菌液为参照，通过上述PCR检测反应体系分别进行PCR反应，并将反应结果进行跑胶电泳，结果如图1所示，其中，泳道1～5和8～12孔分别为停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、液化沙雷氏菌，泳道6为无乳链球菌，泳道7为阴性对照；泳道M为DL2000plus DNA Marker，图中箭头指向核酸大小为220bp。

由图1可以看出，220bp处出现条带则判定为阳性样，即实施例1待检测菌液中含有无乳链球菌。

以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。