单分子-2016-4-时间分辨光谱技术
光谱分析法大全
光谱分析法大全光谱分析法有很多仪器应用，比如紫外分光光度计、原子吸收光谱、红外光谱、原子荧光光谱、近红外光谱、激光拉曼、分子荧光等。
这些仪器如何区分呢？原理有啥区别？看完本文希望你能建构起光谱分析法的宏观概念。
光学分析法凡是根据物质与辐射能的相互作用所建立起来的定性、定量和结构分析的方法，均可称为光学分析法。
光学分析法是基于物质发射的电磁辐射(electromagnetic radiation)或物质与辐射相互作用产生的辐射信号或发生的信号变化来测定物质的性质、含量和结构的仪器分析方法。
电磁辐射是一种以电磁波的形式在空间高速传播的粒子流，具有波动性和微粒性。
根据物质与辐射能作用的性质不同，光学分析法可分为光谱法和非光谱法。
光谱法：当物质与辐射能作用时，物质内部发生能级之间的跃迁;记录由能级跃迁所产生的辐射能强度随波长（或相应单位）的变化，所得的图谱称为光谱。
利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法，简称光谱法。
非光谱法：非光谱法是基于物质与辐射相互作用时，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射、偏振等变化的分析方法。
非光谱法不涉及物质内部能级的跃迁，电磁辐射只改变了传播方向、速度或某些物理性质。
属于这类分析方法的有折射法、偏振法、光散射法、干涉法、衍射法、旋光法和圆二向色性法等。
光谱分析法的分类光谱法可分为原子光谱法和分子光谱法。
原子光谱法是由原子外层或内层电子能级的变化产生的，它的表现形式为线光谱。
属于这类分析方法的有原子发射光谱法（AES）、原子吸收光谱法（AAS），原子荧光光谱法（AFS）以及X射线荧光光谱法（XFS）等。
分子光谱法是由分子中电子能级、振动和转动能级的变化产生的，表现形式为带光谱。
属于这类分析方法的有紫外-可见分光光度法（UV-Vis），红外光谱法（IR），分子荧光光谱法（MFS）和分子磷光光谱法（MPS）等。
光谱法按不同的分类角度，可归为不同类别。
时间分辨光谱学
多维度、多模态 测量技术的发展
未来时间分辨光谱学将更加 注重多维度、多模态测量技 术的发展，如结合空间分辨 、能量分辨等技术，实现更 全面、更深入的物质结构和 动力学信息获取。
研究现状
目前，时间分辨光谱学已经广泛应用于化学、物理、生 物等领域的研究。在化学领域，时间分辨光谱学被用于 研究化学反应动力学、分子结构和化学键等；在物理领 域，时间分辨光谱学被用于研究材料的光学性质、电子 结构和自旋动力学等；在生物领域，时间分辨光谱学被 用于研究生物大分子的结构和功能、细胞代谢和信号传 导等。同时，随着新技术的不断涌现，时间分辨光谱学 的研究方法和手段也在不断更新和完善。
超快过程概述及意义
超快过程定义
发生在极短时间尺度（如飞秒、 皮秒等）内的物理、化学或生物 过程。
研究意义
揭示微观粒子间的相互作用机制 ，理解物质的基本性质和能量转 换过程。
飞秒激光脉冲技术
飞秒激光产生原理
利用锁模技术或克尔透镜锁模技术，实现激光脉冲的极短脉宽输 出。
飞秒激光特点
脉宽极短、峰值功率极高、光谱范围宽。
时间尺度
从纳秒到毫秒，甚至更长 的时间范围。
光谱特性
包括吸收、发射、散射等 光谱现象。
研究目的和意义
揭示物质动态过程
通过研究物质在不同时间尺度上的光谱变化，可以揭示其内部结 构和动力学过程的详细信息。
拓展光谱学应用领域
时间分辨光谱学为化学、物理、生物等领域的研究提供了新的方法 和手段，推动了相关学科的发展。
生物成像
利用磷光材料的长余辉特性，可实现无背景干扰的生物成像，提 高成像对比度和分辨率。
单分子检测中的光谱学方法2003-12-24
近场光学显微镜
A sample is irradiated by placing it within a few nanometers of the aperture
近场光学显微镜
当入射光通过不透光物体上的一个直径小于波长的小孔时，如果把样品放 在近场范围内，则每一时刻样品上只有相当于小孔直径的范围被照射，此时对 样品表面扫描成像时的分辨率不取决于成像的辐射源波长，而取决于探头的最 小尖端的直径以及探头与样品间的距离。根据仪器的结构，光纤可以做成近场 信号的接收器或者作为入射微光源，光学探针由单模石英光纤制成。端部拉制 成锥形，口径在50纳米左右，然后镀上金或铝膜以避免杂散光影响。 近场光学显微镜研究的一个核心问题是如何将探针的高度控制在近场范围 内，一般利用隐失波随Z方向指数衰减的特征来达到这个目的。当探针与样品 的间距小于200纳米时，随间距的增加探测到的光子信号迅速衰减，因此可以 将探针设定在小于波长的范围内。 正如一位近场光学显微镜的先驱所说，最吸引人、最有发展前途的 是近场条件下的光谱学研究。
表面单分子的化学和物理过程表面缺陷的修复表面单分子的化学和物理过程表面单分子的化学和物理过程奇怪的比赛铜表面上一氧化碳的迁移过程表面单分子的化学和物理过程物理吸附向化学吸附转化表面单分子的化学和物理过程吸附态单分子的化学反应表面单分子的化学和物理过程单分子的电子学性质单电子最有希望的应用方向是利用具有特异电子特征的材料如碳纳米管足球烯金属或半导体量子点制造分子电子学中的单电子器件用作单电子晶体管单电子开关单电子线路和单电子逻辑器等
5、量子导线
碳纳米管（单壁和多壁）等一维纳米材料
6、单电子器件雏形
单电子晶体管 单电子逻辑器 碳纳米管整流器 电子开关
单个生物大分子的物理化学
仪器分析光谱法总结
AES 原子发射光谱：原子的外层由高层能及向底层能级，能量以电磁辐射的形式发射出去，这样就得到了发射光谱。
原子发射一般是线状光谱。
原理：原子处于基态，通过电至激发，热至激发或者，光至激发等激发作用下，原子获得能量，外层电子从基态跃迁到较高能态变成激发态，经过10-8s ，外层电子就从高能级向较低能级或基态跃迁，多余能量的发射可得到一条光谱线。
光谱选择定律：①主量子数的变化△n 为包括零的整数，②△L=±1,即跃迁只能在S 项与P项间，P 与S 或者D 间，D 到P 和F 。
③△S=0，即不同多重性状间的迁移是不可能的。
③△J=0，±1。
但在J=0时，J=0的跃迁是允许的。
N 2S+1L J影响谱线强度的主要因素：1激发电位2跃迁概率3 统计权重4激发温度（激发温度↑离子↑原子光谱↓离子光谱↑）5原子密度原子发射光谱仪组成：激发光源，色散系统，检测系统，激发光源：①火焰：2000到3000K ，只能激发激发电位低的原子：如碱性金属和碱土金属。
② 直流电弧：4000到7000K ，优点：分析的灵敏度高，背景小，适合定量分析和低含量的测定。
缺点：不宜用于定量分析及低熔点元素的分析。
③交流电弧：温度比直流高，离子线相对多，稳定性比直流高，操作安全，但灵敏度差④火花：一万K ，稳定性好，定量分析以及难测元素。
每次放电时间间隔长，电极头温度低。
适合分析熔点低。
缺点：灵敏度较差，背景大，不宜做痕量元素分析（金属，合金等组成均匀的试样）⑤辉光 激发能力强，可以激发很难激发的元素，（非金属，卤素，一些气体）谱线强度大，背景小，检出限低，稳定性好，准确度高（设备复杂，进样不方便）⑥电感耦合等离子体10000K 基体效应小，检出限低，限行范围宽⑦激光 一万K ，适合珍贵样品分光系统：单色器：入射狭缝，准直装置，色散装置，聚焦透镜，出射狭缝。
棱镜：分光原理：光的折射，由于不同的光有不同的折射率，所以分开。
分子光谱分析PPT课件
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（3）核磁共振波谱法
（Nuclear Magnetic Resonance ，NMR）
核磁共振波谱实际上也是一种吸收光谱。
在强磁场的激励下，一些具有磁性的原子核可 以裂分为两个或两个以上的核磁能级。如将射频 区域的电磁辐射与其发生相互作用，就会产生对 射频能的吸收，同时实现核磁能级之间的跃迁， 称为发生了核磁共振。
某些高能量的化学反应释放出的化学能可 以激发产物分子或体系共存的其它分子发光， 这种发光叫化学发光。
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4、其 它 分 子 光 谱
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（1）拉曼光谱 （Roman Spectroscopy）
光通过物质时，有少部分在侧向散射开来，这种
现象叫做光的散射。这可看作是光子与物质分子碰 撞的结果。大部分散射光的频率和入射光相同，即 碰撞过程中光子与物质分子并不交换能量，这种散 射称为弹性散射。但也有小部分散射光其频率与入 射光不同，这种散射称为非弹性散射，是入射光子 与物质分子碰撞时产生能量交换，光子把一部分能 量给予分子或从分子获得一部分能量的结果。这种 分子与光子交换的能量也是量子化的，即分子所得 失的能量必需与分子中某两个能级之差相等。由此 形成的光谱叫拉曼光谱，观察到的散射光的频率变 化 ，v相应于分子振动转动能级的改变。
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（2）光声光谱（Photoacoustic Spectroscopy，PAS）
当物质吸收光受到激发后，返回初始态可通过辐 射跃迁或无辐射跃迁。前一过程产生荧光或磷光，后 一过程则产生热。
假如吸收光的强度呈周期性变化，密闭容器内热 的生成呈周期性变化，容器内压力涨落也呈周期性， 由于调制光的频率一般位于声频范围内，所以这种压 力涨落就成为声波，从而被声敏元件所感知。
时间分辨光谱和稳态光谱
时间分辨光谱和稳态光谱1. 引言1.1 时间分辨光谱的定义时间分辨光谱是一种通过在时间上分辨光谱信号来研究物质的光谱特性的方法。
它能够实时观察物质在不同时间点上的光谱响应，从而揭示物质的动态变化过程。
通过时间分辨光谱，我们可以了解物质在激发态和基态之间的能量转移路径、激发态的寿命、化学反应的动力学过程等信息。
时间分辨光谱的快速响应和高时间分辨率使其在研究快速动力学过程和光化学反应中具有重要应用价值。
通过对时间分辨光谱数据的分析和处理，可以获得物质的光谱动力学信息，进一步深入理解物质的光谱特性和反应机制。
时间分辨光谱在生物医学、材料科学、化学反应动力学等领域有着广泛的应用，为研究人员提供了一个强大的工具来探索物质的微观结构和动态行为。
1.2 稳态光谱的定义稳态光谱是指在系统达到稳定状态时所测得的光谱。
在稳态光谱中，系统的能级分布保持不变，各能级之间的占据数达到平衡，从而呈现出一定的能级结构和波长分布。
稳态光谱通常用于研究物质的结构、成分和性质，可以帮助我们了解物质的光学特性、化学反应过程等。
稳态光谱具有稳定性高、信号强度高、测量精度高等特点，因此在很多领域得到广泛应用。
在化学分析领域，稳态光谱常常用于物质的定性和定量分析；在生物医学领域，稳态光谱可用于研究生物分子的结构和功能；在材料科学领域，稳态光谱可用于研究材料的光学、电学性质等。
稳态光谱的应用范围非常广泛，对于推动科学研究和技术发展具有重要意义。
2. 正文2.1 时间分辨光谱的特点时间分辨光谱是一种通过测量物质在不同时间尺度上的光学响应来研究其动力学过程的技术手段。
其特点主要包括以下几个方面：1. 高灵敏度：时间分辨光谱能够提供高灵敏度的光学信号，使得可以检测到物质在极短时间尺度上的变化。
2. 高分辨率：该技术具有高分辨率的特点，能够准确地测量物质在时间上的变化，并能够区分不同光谱特征的信号。
3. 非破坏性：时间分辨光谱通常是非破坏性的，可以在不破坏样品的情况下对其进行测量，适用于对一些脆弱或难获取的样品的研究。
第一节时间分辨光谱测量技术
激发光脉冲截至后相对于激发光脉冲的不同延 迟时刻测得的荧光发射谱。
两种表示法：
荧光衰减谱
N(t) or I(t)
和时间分辨荧光光谱
激发脉冲
荧光衰减曲线 1/e
t
τ 荧光衰减光谱
I
t=0ns
t=5ns
t=10ns λ
I
λ
t 时间分辨荧光光谱
一、时域测量方法
单脉冲激发 (single-pulse excitation)方法。
1、光学显微镜的分辨率与衍射极限
r 0.61 n sin
•λ—光波波长 •N.A.=nsinθ——数值孔径。 N.A.=1.3-1.5→δr～λ/2.
2、隐失波(evanescent wave) 辐射场
非辐射场 （隐失波）
3、近场扫描光学显微镜
Near scanning optical microscopy(NSOM)
③泵浦－探测(pump-probe)时间分辨光谱 （直接吸收或增益法，ps级）
泵浦光
样品
探测光
t
Eu3+ 掺杂SiO2气凝胶薄膜的时间分辨光 谱及发光动力学
Eu3+荧光光谱
时间分辨光谱
第二节 近场光谱
（Near-Field Spectroscopy） •近场扫描光学显微镜+传统的光谱仪 •突破衍射极限的超高分辨率，获得nm微 区的光谱信息。
•将光辐射的时间特性转变为空间特性 •皮秒 (10-12s) 级超快光辐射
条纹照相机的原理图
光阴极 栅极 聚焦极 阳极 偏转板 荧光屏
被测光脉冲
PMT
扫描发生器
照相机 z
y
The resolution is given by the speed of the voltage sweep.
(整理)中国科学院大学,生物单分子技术,张竹青,考试总结
一.单分子技术单分子技术是指在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等，是纳米技术和分子生物物理学的自然延伸和必然趋势。
生命单元的基本功能主要取决于单个大分子，单分子操纵方法在研究单个生物分子的性质上有着独特的优势。
与测量分子集合体整体性质的传统方法(如光散射，光偏振，粘滞性等)相比，单分子技术具有直接，准确，实时等优点。
主要的研究手段有两种：1。
单分子光谱学（Single-molecule spectroscopy 和Single-molecule FRET）2。
单分子力谱（AFM和光镊）二荧光光谱荧光光谱先要知道荧光，荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。
当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。
1荧光光谱物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。
如果把荧光的能量--波长关系图作出来，那么这个关系图就是荧光光谱。
荧光光谱当然要靠光谱检测才能获得。
荧光光谱。
高强度激光能够使吸收物种中相当数量的分子提升到激发量子态。
因此极大地提高了荧光光谱的灵敏度。
以激光为光源的荧光光谱适用于超低浓度样品的检测，例如用氮分子激光泵浦的可调染料激光器对荧光素钠的单脉冲检测限已达到10-10摩尔/升，比用普通光源得到的最高灵敏度提高了一个数量级。
荧光光谱有很多，如原子光谱1905年，Wood首先报道了用含有NaCl的火焰来激发盛有钠蒸气的玻璃管，并得到了D线的荧光，被Wood称为共振荧光。
在Mitchell及Zemansky和Pringsheim的著作里讨论了某些挥发性元素的原子荧光。
火焰中的原子荧光则是Nichols和Howes于1923年最先报道的，他们在Bunsen焰中做了Ca、Sr、Ba、Li及Na的原子荧光测定。
光致发光组分测量
光致发光组分测量
光致发光是指在吸收光能后，物质发射出的荧光或磷光。
测量光致发光组分的主要方法有如下几种：
1. 光谱测量：利用分光光度计或荧光光谱仪测量样品在不同波长下的发光强度。
通过比较样品在不同波长下的发光谱线，可以确定其光致发光组分的类型和含量。
2. 单光子计数：通过单光子计数仪测量样品发出的光子数量，从而确定光致发光组分的浓度。
这种方法适用于低浓度样品或有单分子发光的系统研究。
3. 时间分辨荧光光谱：利用荧光寿命测量技术，测量样品发光的寿命和荧光强度。
通过时间分辨荧光光谱仪的测量，可以进一步了解光致发光组分的动力学过程和化学性质。
4. 图像分析：利用荧光显微镜或荧光成像仪，观察和记录样品的光致发光图像。
通过图像分析，可以获得样品中不同位置的光致发光组分的分布和形态信息。
综上所述，光致发光组分的测量可以通过光谱测量、单光子计数、时间分辨荧光光谱和图像分析等方法来实现。
不同的方法可以提供不同方面的信息，根据需要选择适当的测量方法。
第7章讲义时间分辩光谱_766107711
一个调Q 开关激光的泵浦功率P P (t), 振荡阈值，反转密度出功率P L (t)的示意图Such an optical switch can be realized, for instance, if one of the resonatormirrors is mounted on a rapidly spinning motor shaft. Only at that time t0 where the surface normal of the mirror coincides with the resonator axis is the incident light reflected back into the resonator, giving a high Q value of the laser cavity. The optimum time t0 can be selected by imaging the beam of a light-emitting diode (LED)after reflection at the spin motor onto the detector D , which provides the trigger signal for the flash lamp of the Q-switch laser.用快速转动的反射镜当Q －开关在激光腔内放入一个Pockel-cell 和两个相互垂直的偏振器当Q －开关。
Pockel-cell 有一块各向异性晶体，在电场下能旋转光的偏振方向。
锁模激光(Mode-Luck Lasers)当激光腔内没有选频元件时，激光腔内同时有多模振荡，模之间无位相关系。
如果用一个光调制器把所有同时振荡的模的位相耦合起来，这些模的振幅相干叠加出的激光会是ps 超短脉冲。
这种模的耦合又叫锁模，产生的激光叫锁模激光。
主动锁模示意图. 如图，把一个调制器放入激光腔内。
时间分辨光谱技术
时间分辨光谱技术
时间分辨光谱技术(Time-Resolved Spectroscopy,TRS) 是一种分析物质结构和动力学特性的技术，它通过测量物质在一定时间内的光谱变化，来确定物质的结构和动力学特性。
TRS 技术通常涉及两个步骤：脉冲荧光光谱和时间分辨光谱。
脉冲荧光光谱技术(PFS) 用于测量物质在一定时间内的荧光强度变化，而时间分辨光谱技术(TDS) 则用于测量物质在一定时间内的光谱变化。
TDS 技术可以通过测量物质在一定时间内的光谱变化来确定物质的结构和动力学特性。
这种技术可以用来确定物质的分子量、结构式、反应机理等。
TDS 技术在化学、环境科学、材料科学和生命科学等领域得到了广泛应用。
总结起来，时间分辨光谱技术是一种分析物质结构和动力学特性的技术，它可以通过测量物质在一定时间内的光谱变化来确定物质的结构和动力学特性。
第11章单分子光谱_502604452
染料进人DNA 前后发光变化0306090k H z(a)TIR-FM( NR MCB, 4:ss1-5)Fig. 1. (A) The wtGFP chromophore, consisting of a cyclized tripeptideFIG. 2. Excitation and emission spectra for the BFP–GFP and BFP–YFP combinations. (A) The BFP (P4-3 variant) and GFPS65T excitation and emission spectra are shown, illustrating the overlap in BFP emission with GFP absorption, a critical requirement for FRET. (B) The overlap in BFP emission with the YFP excitation spectra. The filter sets used to detect the signals from these fluorescent protein pairs and minimize the spectral cross talk are also illustrated (gray lines). FIG. 4. FRET microscopy with BFP and GFP. Pituitary GHFT1-5 cells were cotransfected with expression vectors encoding GFP–and BFP–C/EBP D244. (A) A reference image showing the nucleus of a cell coexpressing these two proteins was acquired using the GFP filter set to establish the expression level for GFP–C/EBP D244 (bar 5 10 m m). (B) A second digital image was obtained at the same focal plane using the donor filter set to detect the BFP–C/EBP D244 signal. (C) By changing only the emission filter and using identical conditions as for (B), the acceptor (FRET) image was then acquired. The histograms shown demonstrate that the signal in the FRET channel exceeds the donor signal, and is greater than the signal expected for spectral cross talk alone (see Fig. 3A).SM analysis of cellular events (NR MCB, 4:ss1-5)a. Science, 294:864;b. EMBO J, 19:892;c. Science, 295:1083; Nat CB, 2:168Speckle analysis Figure 7 Phosphorylation of EGF–EGFR complexes. A431 cellswere perforated using streptolysin O and stimulated with 10 ngCy5–EGF for 1 min. Phosphorylation of the EGFR was detected withMyosin V1Ion channelCombinations of SM techniques for in vitro protein analysisNR MCB, 4:ss1-5) a, b, BBRC, 290-311; c,d, Single Molecule, 3-33ZnS-capped CdSe Quantum DotA. QD covalently coupled to protein through mercaptoacetic acid量子点Luminescenceimages of cultured HeLa cellsA. Incubated withMercapto-QDs B. QD-transferrinConjugates Antibody-inducedagglutination ofQDs that werelabeled withHuman IgG•In the presence ofBSA (0.5 mg/ml)B. Aggregated QDs inducedby a specific polyclonalantibody (0.5ug/ml)Science, 264:415 (1994)How Strong Is a Covalent Bond?The rupture force of single covalent bonds under anexternal load was measured with an atomic forcemicroscope (AFM). Single polysaccharide molecules werecovalently anchored between a surface and an AFM tipand then stretched until they became detached. By usingdifferent surface chemistries for the attachment,it was found that the silicon-carbon bond ruptured at 2.0 60.3 nanonewtons, whereas the sulfur-gold anchor rupturedat 1.4 6 0.3 nanonewtons at force-loading rates of 10nanonewtons per second. Bond rupture probabilityScience, 283:1727Fig. 1.(A)Photograph of our AFM set-up. The CCD camera is not inview.Fig. 2. Functionalization of an AFM tip with concavalin A.Fig. 3.Steps in the acquisition of an AFM force measurement.The first step is the approach of the cantilever with a cell bound to the substrate. This is followed by contact between the cell and substrate and retraction of the cantilever, which results in the separation of the cell from the substrate. The cantilever is bent during this process. The arrows indicate the direction of cantilever movement.(Biol ProcedOnline.2004;6: 1–9)/SunneyXie’s Group 谢晓亮2 固定，9博士后，11博士生，2技术员，2访问学者，4本科生2845 cm-1, taken with parallel polarized beams along the x axis (notethe polarization dependence).Probing Single Molecule Dynamics Photon-by-PhotonWe use a confocal microscope to detect the fluorescence signal from a single molecule. Different from the conventional time correlated single photon counting (TCSPC), for each detected fluorescence photon with index, p, we record both the delay time respect to its excitation pulse, τp, and the chronological arrival time tp(see the accompany figure). Instead of binning the detected photon to calculate the fluorescence lifetime, the lifetime correlation function C(t), can be calculated with the novel photon-by-photon correlation method. Such a method provides dynamical information with a high time resolution and a broad range of time scale.。
单分子知识点
光漂白(photonic bleaching)是在光照条件下使其发生化学反应或是构象改变,而失去发荧光的特性,就是所谓的漂白.它常用于生物体内扩散速率常数的测定. 光漂白抗性就是抗光漂白性吧~~我是这么理解的。
下面的是搜索的关于绿色荧光蛋白^_^·GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder). GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测.GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP 荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.常用的显微技术共聚焦显微镜原理：共焦显微镜[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。
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2016年6月13日星期一
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时间幅度转换仪（TAC）
Time-to-Amplitude Converter
The ORTEC Model 567 Time-toAmplitude Converter 测量“开始”到“ 结束”之间的脉冲时间间隔。 把时间间隔测量转换为模拟电脉冲信号 的幅度。
START-to-STOP CONVERSION TIME Minimum ≤5 ns. TIME RESOLUTION FWHM ≤0.01% of full scale plus 5 ps for all ranges.
2016年6月13日星期一
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二阶关联函数的测量
1. 时间幅度转换仪（TAC） 使用时间关联单光子计数测量，将单光子探测 器输出的TTL脉冲同时连接到时幅转换仪的开始端 和停止端，停止端信号相对于开始端信号的时间间 隔通过TAC转化成与之成正比的脉冲幅度。 2.多通道分析仪（MCA） 不同幅度的电脉冲信号输入多通道分析仪进行脉冲 高度统计分析，得到脉冲光的关联函数。
P2(t; t +τ) = η 2 I(t) ∙ I(t+τ)
2016年6月13日星期一 5
二阶关联函数 Second-order correlation function
Photon emission is characterized in terms of a second-order correlation function: g(2)(t; t +τ). It is the joint probability P2(t; t +τ) for photon counts in the interval [(t; t +dt) and (t+τ; t +τ+dt)], normalized by the probability for two independent counts.
量子跳跃 单分子激发态与三重态之间的跳跃。 2. 分子动力学 通过测量单分子荧光的强度关联函数，确 定单分子在ns至几百秒之间的动力学变化特 性。
1.
2016年6月13日星期一 3
Fluorescence Correlation Spectroscopy
2016年6月13日星期一
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Correlation functions 相关函数
2016年6月13日星期一 20
Lifetime measurement
500 ns 10 ns
t
Build the histogram of residuals dti
虚线 : Instrument Time Response IRF(t) 拟合线 : convolution IRF(t) * exp -t/rad
When
we measure photons emitted by a single molecule, we interpret I(t) to be photon counting rate. The joint probability（符合几率） that one photon is emitted at time t and also another photon at time t+ τ is described by the product
2016年6月13日星期一 14
单光子探测与后脉冲
后脉冲
后脉冲概率示意图
2016年6月13日星期一 15
时间分辨光谱技术
脉冲激光的自关联函数曲线与其相应的暗计数
2016年6月13日星期一 16
时间分辨光谱技术测量后脉冲概率
结果与分析
死时间结束后的 3ns内，产生后脉 冲的概率最大；
后脉冲的概率主 要受到两个俘获 能级的影响，其 能级寿命分别为 503ns和33ns。
后脉冲概率曲线及拟合曲线
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应用2: 时间分辨光谱技术测量单分子寿命
荧光辐射是分子吸收能量后由激发态回到基
态时所发生的，分子的荧光寿命曲线可以用 单指数衰减的函数表达, 其中τ0是分子的荧光 寿命。 Y I 0 exp t 0
理想单分子对于每个激发光脉冲都只发出一
S0
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T1 is a “dark” metastable state （亚稳态） When the emission stops, detected photons originate from the background
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Fig. 2. 40 ms sections of total emission time trace for three different molecules on the same sample. On-state average counts Non and off-state lifetime τoff are shown for two molecules in b and c.
统计分析每秒5M个事件。
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应用1: 时间分辨光谱技术测量ps激光的单光子响应
实验装置
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laser system
Laser pulses as short as 50 ps (FWHM); Repetition rates from single shot to 40 MHz; Laser power and pulse width adjustable via driver unit; Laser wavelength 635 nm.
T. Ha et al. / Chemical Physics Letters 271 (1997) 1-5
量子跳跃： 分子从激发态以很 小的几率跃迁到三 重态的过程。
Fig. 1, Energy level scheme. SO is the singlet ground state, S] is the first excited singlet state and T1 is the first excited triplet state. From SI the molecule may undergo an intersystem crossing to T~ with intersystem crossing rate of klsc that is usually much smaller than the radiative decay rate kR.
一阶关联函数 The first order correlation function: g1(τ) ------The correlation function of filed E(t) g1(τ)=< E(t) E(t+τ) >/ < E2(t) > 二阶关联函数 The second order correlation function: g2(τ) ------ The correlation function of intensity I(t) g2(τ)=< I(t) I(t+τ) >/ < I2(t) >
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时序图：
SPCM1 （Start） Laser pulse （Stop）
TAC
5V
MCA
0v 5v
10v
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单光子探测与后脉冲
APD光子计数器的噪声
◆暗计数
(Dark counts)
◆ 热噪声
◆ 隧穿效应
◆ 后脉冲
(Afterpulse) 当有光子入射单光子探测器时，大量的电荷流过探测器的雪崩 倍增区，一些载流子被缺陷俘获。当雪崩被抑制后，这些从缺陷中心 释放出的载流子受到电场加速，它们会再次触发雪崩，产生与前一次 雪崩脉冲相关联的后脉冲.
个光子。
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Time dependence of photon counting
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时间分辨光谱技术测量单分子寿命
The excitation pulses are directed toward the sample by the upper PBS. A small fraction of the pulse energy is transmitted through this PBS to provide a signal for the analog APD, which triggers the time-to-amplitude converter TAC.
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三重态 triplet state
Fluorescence monitoring
0.12
<n>W
Window size W=100 bin period = 50 ms
0.08 0.04 0.00 0.140 0.144 0.148 .152
S1
PISC T
T1
1 T I (t ) I (t ) lim I (t ) I (t )dt T T 0
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荧光强度关联函数 Fluorescence intensity autocrrelation function
测量不同时刻荧光光子数的关联特性。
单分子的光学探测与应用(4)
Single-molecule Optical Measurements and Application
陈瑞云
量子光学与光量子器件国家重点实验室 山西大学激光光谱研究所