2.1土壤酸性磷酸酶活性测定

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土壤酶活性测定方法

土壤酸性磷酸酶活性的测定1．试剂配制(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6HO,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至2250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）原液由以下成分组成:三羟甲基氨基甲烷12.1g顺丁烯二酸11.6g柠檬酸14g硼酸6.3g溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。

取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。

最后稀释至1L，即得。

(3)甲苯(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml)(5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L.2．测定步骤置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色.3．计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示，W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t）式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）；t —反应时间（h）；=1hm—样品土壤的重量（g）无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。

每个处理做1个。

标准曲线的制作：1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。

2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml，②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。

土壤酶测定方法

土壤磷酸酶（酸性）——磷酸苯二钠比色法（一）试剂1.pH5 醋酸盐缓冲液：A:L 醋酸溶液（稀释至1000ml）B:L 醋酸钠溶液 A 液+B液稀释至 100ml若使用无水乙酸及乙酸钠配制 1 升PH为的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算以下：①无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为，则需无水乙酸的体积为×1000/=（毫升）；②乙酸钠用量的计算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82，则需无水乙酸钠的质量为×82× 1=11（克）。

使用无水乙酸及乙酸钠配制 1 升PH为的乙酸盐缓冲液的方法以下：用量筒量取毫升无水乙酸至1000 毫升烧杯内，再用台秤称取无水乙酸钠11 克至该烧杯，而后用量筒量取=996 毫升蒸馏水至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并呈平均的溶液即为1 升PH为的乙酸 - 乙酸钠缓冲液。

或许：量 7ml 醋酸钠液 +3ml 醋酸液混淆即得。

2.% 磷酸苯二钠： pH5醋酸缓冲液3.氯代二溴对苯醌亚胺：称取 2 ，6- 二溴苯醌氯酰亚胺，用 10ml 96%乙醇（48ml 乙醇 +2ml 水）溶解，储存于棕色瓶中，寄存在冰箱中，保留的黄色溶液未变褐色以前均可使用。

4.酚标准溶液：酚原液 --- 取 1g 苯酚溶于蒸馏水中，定容至 1000ml 水中，保留于棕色瓶中。

酚工作液 --- 取 10 ml 酚原液稀释至 1000ml 水中，每毫升含酚5.甲苯硫酸铝溶液，称取硫酸铝，定容至100ml。

（二）实验步骤1.标线制作取 0，1， 3，5，7，9，11，13ml 酚工作液，置于 50ml 容量瓶中，加入5ml 缓冲液和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min 后比色测定。

以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。

2.样品测定称取风干土样（过 20 目筛，去除杂质），搁置于 200ml 容量瓶（离心管）中，加甲苯，轻摇 15min 后，加入 20ml %磷酸苯二钠，认真摇匀后搁置于 37°C恒温箱中培育 24h，后于培育液中加入 %硫酸铝溶液过滤。

土壤酸性磷酸酶活性测定方法

土壤酸性磷酸酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定⑴原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。

⑵测定方法①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.2 mL甲苯和4 mL ph6.5 磷酸缓冲液，再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，摇匀；③而后在2500r/min下离心5min；取上层清夜于10ml 离心管4000r/min下再离心5min.④取上清液在410 nm处比色，并记录吸收光值。

⑶标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。

表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、120.005?mol/mLpNP（mL）0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 0.09 0.10 0.11 0.12H2O（mL）0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.72 0.71 0.70 0.69 0.68pNP的含量（?mol）0、0.00005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006摇匀0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液（mL） 40.5mol/L CaCl2（mL） 10.5mol/L NaOH（mL） 4②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。

土壤酶类检测

土壤酶类检测土壤酶参与土壤中各种生物化学过程，如腐殖质的分解与合成；动植残体和微生物残体的分解，及其合成有机化合物的水解与转化；某些无机化合物的氧化、还原反应。

土壤酶的活性大致反映了某一种土壤生态状况下生物化学过程的相对强度；测定相应土壤酶的活性，可间接了解某种物质在土壤中的转化情况。

不同植烟模式对土壤酶类物质活性的影响迪信泰检测平台采用生化法，可实现高效、精准的检测多种土壤酶类物质。

目前可检测的土壤酶类物质包括土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤纤维素酶和土壤脱氢酶等。

此外，迪信泰检测平台还提供土壤酶类生化试剂盒产品，以满足您的不同需求。

迪信泰检测平台可检测土壤酶类项目土壤脲酶(UE)活性检测土壤蔗糖酶(S-SC)活性检测土壤过氧化氢酶(S-CAT)活性检测土壤酸性磷酸酶(S-ACP) 活性检测土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP) 活性检测土壤中性磷酸酶(S-NP)活性检测土壤脱氢酶(SDHA)活性检测土壤纤维素酶(S-CL)活性检测土壤硝酸还原酶(S-NR)活性检测土壤亚硝酸还原酶活性检测土壤多酚氧化酶(PPO)活性检测β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性检测土壤α-葡萄糖苷酶(S-α-GC) 活性检测土壤碱性蛋白酶活性检测土壤中性蛋白酶活性检测土壤酸性蛋白酶活性检测土壤过氧化物酶(S-POD)活性检测土壤淀粉酶活性检测土壤几丁质酶活性检测土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(SNAG)活性检测土壤亮氨酸氨基肽酶(S-LAP) 活性检测土壤酸性转化酶(S-AI) 活性检测土壤漆酶活性检测土壤木质素过氧化物酶(S-LiP) 活性检测土壤锰过氧化物酶(S-Mnp) 活性检测土壤谷氨酰胺酶(S-GLS) 活性检测土壤芳基硫酸酯酶(S-ASF) 活性检测FDA水解酶活性检测土壤中性木聚糖酶(NEX)/土壤中性半纤维素酶活性检测土壤酸性木聚糖酶(ACX)/土壤酸性半纤维素酶活性检测土壤碱性木聚糖酶(BAX)/土壤碱性半纤维素酶活性检测土壤植酸酶活性检测土壤羟胺还原酶(HR)活性检测生化法测定土壤酶类样本要求：1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL，测定样品不返还，请您保留备份。

土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶

土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。

在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。

积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。

研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。

磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。

测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。

后一种称为无机磷含量法。

研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。

所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。

测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。

常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。

3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。

4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。

土壤养分及酶活性测试方法

硝态氮的测定：《双波长分光光度法测定土壤硝态氮》，土壤肥料，2006（1）：50～52，涂常青，温欣荣。

原理：利用硝酸盐和亚硝酸盐在203nm 和230nm 波长处有较强紫外吸收峰，利用双波长系数倍数法的公式：21kA A A λλ-=∆选择合适波长时，从而消除亚硝酸盐、有机质的影响。

消除干扰后，硝酸盐氮的含量与A ∆呈线性关系，线性范围为0～2.0L /mg ，由此建立了测定土壤硝态氮的新方法。

硝酸盐氮标准比色液：称取0.7220g 与105℃烘箱中烘干2h 干燥冷却后的3KNO 与小烧杯中，加入二次蒸馏水溶解，定量转入1000ml 的容量瓶中，定容、摇匀，即为10ml /ug 的硝酸盐氮标准液。

称取该溶液10.00ml 于100ml 容量瓶中，定容、摇匀，即为10ml /ug 的硝酸盐氮标准比色溶液。

亚硝酸盐氮标准比色液：称取0.1232g 2NaNO 于小烧杯中，加入二次蒸馏水，定量转入250ml 容量瓶中，定容、摇匀，即为100ml /ug 亚硝酸盐氮标准溶液。

称取该溶液10.00ml 于100ml 容量瓶中，定容、摇匀，即为10ml /ug 亚硝酸盐氮标准比色液。

实验方法：1、k 系数的确定：分别准确移取10ml /ug 硝酸盐氮使用液2.00ml 、10ml /ug 亚硝酸盐氮标准使用液2.00ml 、土壤浸提液2.5ml 置于各自的25ml 比色管中，用二次蒸馏水定容、摇匀，用1cm 的石英比色皿，以二次蒸馏水作参比，在UV -紫外可见分光光度计上在190～300nm 范围内扫描，从而确定土壤样品、硝酸盐氮的最大吸收波长203nm ，在230nm 处吸收较弱，而亚硝酸盐氮在210nm 处有最大吸收，在230nm 吸收较弱。

选取203nm 、230nm 为测量波长和参比波长测定土壤中硝态氮，从而可消除样品中主要干扰组分亚硝酸盐氮的干扰。

据0kA A 230203=-的公式计算，求得72.2k =。

酸性磷酸酶活性测定方法

实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。

2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。

以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。

它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。

3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。

4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。

5．实验内容（1）酶液提取。

称取1g 样品，用5mL 研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm 下离心10min 。

吸出上清液，即为酶粗提液。

可放在冰箱中储存备用。

（2）活力测定。

取酶液0.1—1mL （视酶含量多少而定），加水至1mL ，然后加入缓冲液1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL 。

空白对照用1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。

充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min ，时而摇动。

10min 后，加入1m0.5mol/LNaOH 溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。

在400nm 波长下测吸光度A 。

（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol 数表示。

酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的g W V V A ⨯⨯⨯min 1011.3019.0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol 吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L 时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol 化为nmol 乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。

在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或者塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

土样在自然条件下烘干装入袋中备用。

所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。

往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。

醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。

硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）与0.2mol/l的硼酸混合。

纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱与水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。

加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱与溶液1ml，加水至200ml。

静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳固，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳固后，570nm比色绘制标准曲线。

测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。

土壤微生物量及土壤酶活性测定方法

2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。

它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。

土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。

2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。

2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。

2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。

根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。

表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。

表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。

土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

土壤磷酸酶测定方法

磷酸单酯酶（对硝基苯磷酸盐法）(Tabatabai, 1994)1.原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。

酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。

2.试剂: （1）甲苯。

（2）pH 6.5缓冲溶液：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol ﹒L－1）溶液调至pH6.5，用水定容；或pH 11缓冲溶液：用氢氧化钠（0.1 mol﹒L －1）溶液调至pH11，用水定容。

通用缓冲液：称取12.1g三（羟甲基）氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3g硼酸于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用。

)（4）对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。

（5）0.5 M CaCl2溶液：称取73.5 g CaCl2﹒2H2O溶解于700 mL水中，用水定容到1L。

（6）0.5 mol﹒L－1 NaOH溶液：称取20 g NaOH 溶解于700 mL水中，用水定容到1L。

（7）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0 g 对硝基苯酚于700 ml 水中，稀释至1L，低温保存。

配置工作曲线用的溶液。

将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml三角瓶中（分别含0 mg、0.01 mg、0.02 mg、0.03 mg、0.04 mg、0.05 mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5 ml，再加入1 ml的CaCl2和4 ml 的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400 nm－420 nm条件下比色。

3. 仪器:50mL三角瓶；培养箱；分光光度计4. 步骤:将1.00 g新鲜土样（< 2 mm）放入50mL三角瓶中，加入0.2 mL 甲苯、4 ml的缓冲液和1 ml的对硝基苯磷酸二钠溶液。

土壤酶活活性测定方法

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。

用2mL甲苯处理15分钟。

往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。

仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。

与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。

摇匀，将悬液过滤。

吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。

然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

2.1土壤酸性磷酸酶活性测定

土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。

在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。

积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。

研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。

磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。

磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。

（2）pH5醋酸盐缓冲液。

a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL）14.8ml A + 35.2ml B混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。

酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。

（5）甲苯。

（6）0.3%硫酸铝溶液。

标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。

以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。

2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。

吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。

用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。

3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。

土壤酸性磷酸酶(soil acid phosphatase)活性测定试剂盒(分光光度法)使用说明

土壤酸性磷酸酶（soil acid phosphatase）活性测定试剂盒（分光光度法）使用说明货号:BC0140规格:50T/48S产品简介：土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。

酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。

产品内容：试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

用前加50mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。

临用前加1152μL无水乙醇（自备），48μL蒸馏水充分溶解。

（变褐色后不能再使用）标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。

操作步骤：一、粗酶液提取：称取风干混匀土壤约0.1g，加入0.05mL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。

8000rpm，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL蒸馏水，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A空白管。

3.标准管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL标准液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A标准管。

4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL上清液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A测定管。

土壤磷酸酶测定方法

土壤磷酸酶测定方法4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)： 1、试剂配制（1）甲苯（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L （1毫升含25mg酚）（3）缓冲液（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液（pH9.0）A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中 B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得缓冲溶液配制：(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。

B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL 醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得（2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0） A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL 蒸馏水中 B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O）溶于1000mL蒸馏水中柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得（5）2.5％铁氰化钾（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。

（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL） 2、操作步骤：称取5ｇ土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。

酸性磷酸酶的检测实验报告

酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。

2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。

3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。

二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。

连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。

2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。

酸性磷酸酶催化反应。

再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。

在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。

三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。

b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。

在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。

c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。

d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。

培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。

用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。

2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。

生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。

3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。

蒸馏水冲洗，吸去多余水分。

4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。

土壤酶活性的测定

土壤酶活性的测定1.土壤样品采集与制备取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。

充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。

供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。

2.土壤酶活性的测定方法2.1.土壤脲酶比色法测定多酚氧化酶、过氧化物酶活性采用邻苯三酚比色法测定；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法；碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法（2）测定操作步骤：称2g过1mm筛风干土，置于100mL三角瓶中，注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液，振荡(120次/分钟)20分钟。

随即加入3N硫酸5mL，稳定未分解的过氧化氢并终止反应。

用慢速型滤纸过滤瓶中的土壤悬浊液，吸取25nil滤液，用0.01N高锰敏钾滴定至淡粉红色终点。

结果计算：设滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为B滴定25而原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为A高锰酸钾滴定度的校正值为T=(A-B)×T/2等于20分钟土壤的过氧化氢酶活性(mL 0.lmol KMnO4/g)2.2.脲酶采用靛酚蓝比色法操作步骤：取2.5g风干土，置于50mL三角瓶中，加0.5mL甲苯，15min后加5mL 10%尿素液和10mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液。

摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后取0.5mL滤液注入25mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000mL，则得1mL含0.1mg氮的标准液。

绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。

标线绘制：取稀释的标准液l、3、5、7、9、11、13mL，移于50rnl容量瓶中，然后加入蒸馏水至20mL。

再加4mL苯酸钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

用哪些方法可以探究土壤中的成分

用哪些方法可以探究土壤中的成分探究土壤中的成分是土壤科学研究的重要内容之一，了解土壤中的成分可以帮助我们更好地评估土壤的肥力、适宜种植何种作物以及培育土壤等方面。

下面将介绍几种常用的方法来探究土壤中的成分。

1. 土壤成分的物理分析物理分析是了解土壤中粒径组成、质地、颗粒间的紧密程度等物理特性的方法之一，可以通过以下几种方法进行：（1）粒径分析：利用粒度分析仪对土壤样品进行粒径分布分析，通过分析不同粒径的比例和分布情况，可以推测土壤的水分透气性、保水性等特性。

（2）质地测定：通过测定土壤中不同颗粒大小的含量，确定土壤的质地类型，一般可以根据三种不同大小颗粒之比例来判定，即黏粒、壤土以及砂粒的比例。

（3）土壤密度测定：通过比较一定体积土壤的湿重与干重，可以计算出土壤的容积重量和容重，从而评估土壤的紧密程度和通气性。

2. 土壤成分的化学分析化学分析是了解土壤中不同元素含量及其化学性质的方法之一，可以通过以下几种方法进行：（1）土壤酸度测定：利用酸度指示剂或pH计测定土壤的酸碱度，可以从中推测土壤的酸性或碱性程度。

同时，配合酸度测定，可以测定土壤的碳酸盐含量以及pH值对土壤中其他元素的影响。

（2）土壤含水率的测定：通过测定一定重量土壤的干重和湿重，可以计算出土壤的含水率，从而了解土壤的保水性能。

（3）土壤养分测定：利用化学方法，分析土壤中常量元素含量（如氮、磷、钾等）和微量元素含量（如铁、锰、锌、铜等），以了解土壤中的养分状况，进而制定合理的土壤肥力调整措施。

3. 土壤成分的生物学分析生物学分析是了解土壤中微生物数量、活性以及其他生物参数的方法之一，可以通过以下几种方法进行：（1）土壤微生物量测定：通过土壤DNA提取、PCR扩增等方法，可以测定土壤中微生物的总量和不同类群的丰度，以及其对土壤生物活性的贡献程度。

（2）土壤酶活性测定：通过测定土壤中脲酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶等酶活性，可以评估土壤中的有机物质矿化速率和营养转化能力。

土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶

土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶1.土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。

在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。

积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。

研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。

磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

2.Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。

测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。

后一种称为无机磷含量法。

研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。

所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。

测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。

常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。

（用缓冲液配制）；取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、-1浓度的酚标准溶液梯度。

30min后比色测定。

绘制标准曲0.0018、0.0022和0.0026mg?g线。

5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37?下培养24h。

土壤生态修复相关酶指标测定

土壤生物化学指标测定土壤脱氢酶（dehydrogenase）活性测定（比色法）（一）分析意义脱氢酶能酶促脱氢反应，它起着氢的中间传递体的作用。

在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。

脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。

（二）方法选择与原理Lenhard（1956）最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。

后来对上述的方法做了不同的改进和完善。

用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。

（三）试剂配制1、0.5%TTC 溶液2、甲苯3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M 三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml 与0.1MHC138.5ml混合后，用水稀释至100ml。

4、硫化钠5、0.1mol/L葡萄糖溶液。

（四）实验步骤1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中，定容，制成1 mg/L的母液。

分别向6支50ml比色管中依次注入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL mg/ml标准TTC溶液，用蒸馏水定容至5mL。

在试管中依次加入2 mL Tris-HCl缓冲液，2mL蒸馏水，2mL TTC系列溶液，对照组不加TTC，再各加入1 g低亚硫酸钠，摇匀，待溶液充分显色后，各管准确加"ml甲苯，振荡萃取2min，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞绘制标准曲线。

2、操作过程：取1g新鲜土壤，置于50ml比色管中，依次加入4mlTris-HCl盐酸缓冲液、2ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液，震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。

同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸储水替代）。

3、结果计算：脱氢酶活性二TF含量/0.5g —土壤含水量脱氢酶活性，以24h后1g干土中TF的生成量表示。