医学微生物学实验 革兰染色+特殊结构
主管检验技师考试临床医学检验微生物检验讲义第13章病原性球菌及检验
病原性球菌及检验● 考点葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、奈瑟菌属生物学性状微生物学检查法临床意义（致病性、所致疾病）【内容讲解】普及共性，单记个性生物学性状形态与结构：革兰染色性，菌体形态，大小，排列状态，特殊结构。
培养特性：对气体需求，营养要求，最适pH值，最适温度，在培养基中的生长现象。
生化反应：特殊生化。
抗原：分类：致病性致病物质所致疾病微生物学检查：针对生物学性状和致病性。
一、葡萄球菌属一群革兰阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状而得名。
（一）生物学特性1.形态与结构G+，球形，0.5～1.5μm，呈葡萄串状成堆排列（在脓汁、肉浸液培养物中，可见单个，成对或短链排列），无鞭毛和芽胞，某些菌株能形成荚膜。
2.培养特性需氧或兼性厌氧，营养要求不高，最适pH为7.4，最适温度为35～37℃。
普皿：圆形、凸起、表面光滑湿润、边缘整齐并且不透明的菌落，直径为2～3mm。
可产生不同的脂溶性色素，如金黄色、白色、柠檬色色素。
血琼脂平板：几乎所有的葡萄球菌可产生α、β、γ和δ溶血素。
液体培养基：生长迅速呈均匀混浊状。
3.生化反应触酶试验（+）；多数能分解葡萄糖、麦芽糖及蔗糖，产酸不产气；分解甘露醇产酸、液化明胶和产生血浆凝固酶（多数致病性葡萄球菌）。
4.抗原（1）蛋白抗原：为完全抗原，有种属特异性，无型特异性。
存在于葡萄球菌的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，称葡萄球菌A蛋白（SPA）。
（2）多糖抗原：是半抗原，具有型特异性，有三种：①A型多糖抗原；②B型多糖抗原；③C型多糖抗原。
5.分类（1）《伯杰系统细菌学手册》（2）古典分类法6.抵抗力对理化因素抵抗力强，耐热，耐干燥，耐高盐。
是抵抗力最强的无芽胞细菌。
（二）临床意义葡萄球菌感染的特点是感染部位组织的化脓、坏死和脓肿形成。
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌是引起临床感染最常见的葡萄球菌。
（1）金黄色葡萄球菌致病物质：血浆凝固酶；葡萄球菌溶血素；杀白细胞素；肠毒素；表皮溶解毒素；毒性休克综合征毒素。
医学微生物学实验报告
医学微生物学实验报告（本科）实验室：姓名：学号：班级：海南医学院微生物学与免疫学教研室编写二OO四年四月第一次实验【实验内容】实验一微生物的形态与结构的观察实验二微生物的分布【结果记录及判定】实验一微生物的形态与结构的观察1、细菌正常形态及特殊结构的观察及记录（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：特殊结构：霍乱弧菌破伤风梭菌芽胞形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：肺炎链球菌荚膜伤寒沙门菌鞭毛形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：炭疽杆菌脑膜炎球菌2、病毒包涵体观察及记录（示教）：绘图并描述描述：狂犬病毒包涵体（H-E染色）3、真菌的形态观察及记录（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：白假丝酵母菌皮肤癣菌4、革兰染色法结果观察及记录：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：葡萄球菌大肠埃希菌实验二微生物的分布结果记录：1、空气中的细菌种类（种）：数量（个）：2、水中细菌数检测（1）自来水中细菌的种类（种）：数量（个）：（2）污水中细菌的种类（种）：数量（个）：3、物品和手指上的细菌检查（记录本人结果）物品表面的细菌种类（种）：数量（个）：手指表面的细菌种类（种）：数量（个）：结论：成绩：_________________批改教师签名：____________批改时间：________________第二次实验【实验内容】实验三微生物的分离培养实验四抗菌药物敏感性试验实验五消毒、灭菌、除菌【结果记录及判定】实验三微生物的培养1、细菌分离培养方法（分区划线接种法），生长现象为：2、纯种细菌接种技术（1）琼脂斜面接种培养，大肠埃希菌生长现象：（2）液体培养基接种法，大肠埃希菌生长现象：（3）半固体培养基接种技术①标本名称：大肠埃希菌半固体培养基②标本名称：痢疾志贺菌半固体培养基穿刺线：穿刺线：培养基：培养基：结论：结论：3、沙保弱琼脂平板上的真菌菌落观察及描述（示教）：类酵母型菌落：丝状菌落：实验四抗菌药物敏感性试验实验五消毒、灭菌、除菌一、紫外线灭菌法（示教）玻璃盖遮住平板的一半现象：现象：分析：分析：二、机械除菌法（示教）：1、未经过滤的液体培养基培养后的现象：2、经过过滤的液体培养基培养后的现象：分析：成绩：_________________批改教师签名：____________第三次实验【实验内容】实验六细菌的致病性实验七化脓性感染的细菌学检查【结果记录及分析】实验六细菌的致病性一、透明质酸酶试验（示教，实验动物：家兔）测量试验侧与对照测的黑墨水扩散范围（cm×cm）：实验侧：对照侧：分析：二、破伤风外毒素的毒素作用（实验动物：小鼠）实验现象：实验侧：对照侧：分析：实验七化脓性感染的细菌学检查一、病原性球菌的形态观察（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：葡萄球菌链球菌形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌二、病原性球菌的鉴别：三、血清学试验抗“O”试验（乳胶凝集法）实验现象：阳性对照：阴性对照：标本1：标本2：结果判定：标本1为________，标本2为_________。
微生物实验3之革兰氏染色
华中科技大学微生物学实验报告班级：生物制药1101班日期：2013 年 3 月16 日指导教师：邬建国实验组别：启明七组姓名：何明组员姓名：张玉涛、王远馨实验名称：革兰氏染色一、实验目的1.学习并掌握革兰氏染色的方法。
2.简单进行样品的革兰氏染色辨别样品中细菌类别二、实验原理1.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。
2为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。
3.革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样，染色与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。
4.阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
三、实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；检测样品：含活菌酸奶染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯四、实验方法(一)涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min ）→水洗→路哥氏碘液媒染（1min ）→水洗→95%乙醇脱色（30s ）→水洗→番红复染（5min ）→水洗→干燥→镜检。
关键点：1.严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌； 而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌；2.菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。
（二)黑曲霉菌属于真菌,细胞较大,可用水片进行观察,,先在载玻片上滴一滴水,接种,盖上载玻片,即可拿到显微镜下观察.五、实验结果与分析1.对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）大肠杆菌放大倍数40x 金黄色葡萄球菌，放大倍数100x ，油浴2.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片进行革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，放大倍数100x,油浴3.酸奶中乳酸菌的革兰氏染色（拍照，注明放大倍数）4.黑曲霉菌水片观察六、思考题1.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。
实验一油镜的使用`革兰染色及特殊结构的观察
实验一油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察细菌个体微小，必须借助显微镜来观察其形态结构。
但是活细菌为无色半透明状态，在普通光学显微镜下不易观察清楚，常用染色的方法使细菌着色，使之与背景形成鲜明对比，再在显微镜下观察，可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。
观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。
目的和要求：1、熟悉显微镜油镜的使用方法。
2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构3、学习革兰染色法实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。
实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。
这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。
如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。
实验方法及注意事项：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。
2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。
染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。
3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。
4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。
5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。
若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
革兰氏染色实验报告
细菌革兰氏染色实验报告作者：刘冲地址：山东大学摘要：本次实验是通过一种特殊的染色方法-----革兰氏染色法进行细菌鉴定。
细菌一般可分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，本实验将通过革兰氏染色使细菌呈现不同的颜色以达到鉴别菌种的目的。
革兰氏阴性菌将呈现红色，革兰氏阳性菌将呈现紫红色。
要想达到此目的，要求革兰氏染色必须成功。
因此，在实验中要特别注意革兰氏染色的注意事项和影响实验成功的关键因素。
除了掌握革兰氏染色法外，我还掌握了油镜的使用。
实验得到了应有的结果，通过其颜色不同鉴别了实验菌种的革兰氏阴阳性。
关键词：革兰氏染色细菌鉴定颜色油镜前言：本实验的目的主要是通过动手操作使我们学习并掌握革兰氏染色法，了解革兰氏染色的原理，巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
革兰氏染色法可把细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
（细胞壁的组成结构比较可看下图）革兰氏染色有很大的意义，主要如下鉴别细菌、选择药物、细菌致病性（革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同）。
因此，革兰氏染色法有着广阔的应用前景。
在若干疾病中中，有很多都是由细菌引起的。
在生活中，细菌无处不在，不会由单一的菌种存在（除了特殊培养以外）。
因此，在探明病人病因时了解致病菌种是非常重要的。
革兰氏染色可以将病菌分为G+ G- 两种类型，我们可以通过这种方法对菌种加以鉴别，在医学上加以应用。
利用革兰氏阴阳性可以了解细菌的致病性情况，应用于医学造福人类。
1 材料与方法1.1材料1.1.1菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌1.1.2 试剂试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95％乙醇、番红复染液、水仪器：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、试管架、镊子、载玻片夹子、滤纸、滴管1.2方法操作步骤示意图：步骤（一）制片。
分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌按常规方法依次进行涂片（不宜过厚）、干燥（可以用酒精灯烘干）和固定。
细菌的形态学检查
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革兰染色法
结晶紫、碳酸钠初染，30秒 碘液媒染30秒
丙酮酒精数滴，脱色约5秒
碱性复红液2~3滴，5秒钟
待干，镜检。
注：每一步均需 细流水冲洗。
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• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
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• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
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革兰氏染色意义：
注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
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细菌形态示意图绘图要求
绘细菌的
形态 排列 染色性 特殊结构
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1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
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（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀 死细菌。
玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆 样速度通过三次，时间约3秒钟。
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革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（碘液）
脱色（95%乙醇） 复染（复红）
• 玻璃折射率： n=1.52
• 香柏油折射率： n=1.515
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二、细菌标本染色检查法
医学微生物学实验 革兰氏染色+球菌
医学微生物教研室
2012年3月
实验内容
一、细菌染色标本观察 （革兰染色法）
二、病原性球菌标本片观察 链球菌 脑膜炎双球菌
链球菌
脑膜炎双球菌
一、革兰染色法
由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。
【菌种】白色葡萄球菌+大肠杆菌 【试剂】革兰染液 【其他材料】酒精灯、接种环、玻片、吸水纸、
显微镜等 【方法】1、细菌涂片标本的制片
2、革兰染液染色 3、油镜下观察结果
细菌涂片的制备
器具：接种环（上）和接种针（下）
2—5mm
柄约22cm
5—8cm
金属柄约14.5cm
绝缘柄 约7.5cm
安装环(针)的螺口(约8mm)
操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）
Aseptic area 10-20cm
外焰 内焰 焰芯
细菌涂片的制备
菌液采取法
【操作步骤】
细菌涂片的制备
一般制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固；
可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
【操作步骤】 二、革兰染液染色
初染
媒染
脱色
复染
冲洗
冲洗
冲洗
结晶紫 1’ 碘液 1’ 95% 乙醇 30” 复红 1’
冲洗
滤纸干燥
油镜观察
革兰氏染色
甲
紫紫色色（（GG＋＋））
菌
初染 媒染 脱色 复染
革结兰晶氏紫 染碘色液步骤乙示醇 意图稀释复红
乙
红色（G-）
微生物学实验-简单染色与革兰氏染色
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3 次固定（以不烫手为宜）。
1 简单染色：
实验方法
2 革兰氏染色： （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色30 s
左右至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染2 min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水
纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
实验器材
菌种： 苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌 液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠 杆菌
染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红、 美蓝、醇醚、香柏油
器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、 擦镜纸（脱脂棉）、显微镜
实验方法
1 简单染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上滴2滴蒸馏
实验完毕后的处理
将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净： （1）先用脱脂棉将油镜头上的油擦去。 （2）用脱脂棉沾少许醇醚将镜头擦2—3次。 （3）再用干净的脱脂棉将镜头擦2—3次。 （4）注意擦镜头时向一个方向擦拭。
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色 时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性 菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。
2 革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，
细菌的形态结构观察实验
How to do
4.油镜观察
在干燥的细菌涂片上滴加香柏油，转到油镜进 行观察。观察内容：
1 细菌的革兰染色性：
细菌被染成紫蓝色——革兰阳性（G+)菌 细菌被染成红色——革兰阴性（G-)菌
2 单个细菌的形态：球菌（C），杆菌（b） 3 细菌的排列：散在排列；葡萄状排列 记录： G+c，葡萄状排列； G-b，散在排列。
Gram Positive Bacteria (Staphylococcus)
Gram Negative Bacteria ( E. coli )
5.细菌特殊结构观察(示教镜)
细菌的荚膜（capsule）
Capsule
（特殊染色法，X1000)
细菌的芽胞（spore） 细 菌的鞭毛(flagellum)
医学微生物学实验 （EXPERMENT OF MICROBIOLOGY）
医学微生物学实验室规则
1.每次进入实验室必须穿白大褂，拒绝穿拖鞋者入内。 2.不准携带食品、饮料和餐具入室，拒绝实验室内吃喝。 3.上课前请不要动桌面上的实验器材，老师介绍完后才能开始
实验。实验完成后统一下课。 4.实验过程中发生意外时，应立即报告老师，不要私自处理。 5.实验完成后要求洗手离开。服从班干部安排，做好实验室
Spore
flagellum
(特殊染色法,x1000)
实验报告 实验名称
一、材料和方法 关键试剂、重要的方法
二、实验结果 文字、图、表描述
三、结论（讨论）
实验报告
一、细菌革兰染色 方法、结果（绘图）、讨论
Байду номын сангаас
二、细菌特殊结构
绘图
？
绘图要求
染色方法、 放大倍数
微生物实验-革兰式染色
细菌的革兰氏染色与显微观察一、实验原理革兰氏染色原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结，当用乙醇处理时，由于脱水而引发网状结构的孔径变小，通透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
显微镜成像原理：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
在载玻片与镜头之间加滴镜油主要是为了增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。
以油代替空气作为光的传播介质，减少光线的折射或全反射，使观察到的像更加清晰。
二、实验器材1.菌落：大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物。
2.溶液或试剂：蒸馏水、碘液、结晶紫染色液、95%酒精、番红染色液、香柏油。
3.仪器：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、镊子、擦镜纸。
三、实验步骤革兰氏染色：1.涂片取出载玻片，点燃载玻片，燃尽载玻片上的酒精和灭菌，在中间轻轻点一小滴蒸馏水，用接种环在试管的斜面培养基上，轻轻挑取少量菌体，整个过程试管口都要处在酒精灯的上方，而且速度要快，以防污染培养基。
然后在载玻片的小水滴以转圈的动作涂片，待水滴混浊后停住，等其干燥、固定。
2.初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于菌落上，染色1～2min ，倾去染色液，有细水从载玻片上方向下冲洗，至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
3.媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
4.脱色将载玻片上面的水甩净，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脱色，直至流出的酒精刚好不出现蓝色，立即用水冲净酒精，将载玻片上水甩净。
医学微生物学实验革兰染色+特殊结构
05 实验注意事项与改进建议
实验操作注意事项
无菌操作
革兰染色实验涉及活菌 操作，必须严格遵守无
菌技术，避免污染。
涂片制备
涂片应均匀、薄透，避 免过厚导致染色不均。
固定处理
涂片后需经火焰固定，使细 胞质凝固，形态固定，同时 增加细胞对染料的亲和力。
染色时间
严格控制染色时间，避 免过长或过短导致染色
特殊结构染色结果分析
芽孢染色
部分革兰阳性菌在不良环境下能形成芽孢， 以抵抗外界环境。芽孢经特殊染色后呈现明 显的形态，如梭状芽孢杆菌的芽孢位于菌体 中央。
鞭毛染色
荚膜染色
部分细菌在特定条件下能形成荚膜，具有保 护细菌、抵抗吞噬等作用。荚膜经特殊染色 后呈现明显的轮廓，如肺炎链球菌的荚膜。
某些细菌具有鞭毛结构，用于运动。鞭 毛经特殊染色后呈现丝状附属物，如弧 菌、螺旋菌等具有周鞭毛或端鞭毛。
石炭酸复红染色法
用碱性染料石炭酸复红着色后，再加酸性乙醇处理，使菌体脱色而芽孢保留红色。
芽孢荧光染色法
用荧光染料染色后，在荧光显微镜下观察，由于荧光染料能透过芽孢壁而使芽孢呈现明亮 的荧光。
鞭毛染色法
银浸法
将细菌涂布在洁净的载玻片上，干燥后用硝酸银溶液覆盖涂 菌部分，作用一定时间后水洗、脱色、复染等步骤。结果菌 体呈深褐色，鞭毛显褐色。
荧光抗体法
用已知的鞭毛抗原免疫动物制备特异性抗体，将荧光素标记 在抗体上制成荧光抗体。用此荧光抗体与细菌鞭毛结合形成 抗原抗体复合物，在荧光显微镜下观察发出荧光的鞭毛。
其他特殊结构染色法
异染颗粒染色法
白喉棒状杆菌的异染颗粒主要由核糖核 酸和多偏磷酸盐组成，可用甲苯胺蓝或 甲基紫进行染色。
VS
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。
所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。
微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。
不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。
常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。
通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
《医学微生物学》微生物的形态检查实验
《医学微生物学》微生物的形态检查实验[目的]1．掌握显微镜油镜的使用和保护。
2．掌握细菌的基本形态和特殊结构。
3．掌握细菌涂片标本的制备及革兰染色的步骤，判断革兰染色性及明确其临床意义。
4．了解特殊结构的染色方法。
5．了解放线菌和霉菌的形态。
6．了解放线菌和霉菌的形态观察方法。
[内容]一、显微镜油镜的使用方法（一）普通光学显微镜的接物镜有高倍镜、低倍镜和油镜三种，检查微生物最常用者为油镜，在使用前首先要识别油镜头，在油镜头上常有下列标记：（1）放大倍数是90×或100×。
（2）油镜头前端有一白圈。
（3）物镜的前面透镜最小。
（4）刻有“油”或外文“HI”（Homogene Immersions）, “Oil Immersion”等字样。
（二）使用方法（1）使用显微镜时，必须端坐，坐凳和桌面高度配合适宜，显微镜应直立在桌上。
把显微镜的电源线插在适当的电源插座中。
（2）把照明器的开关移到“ON（开）”的位置，滑动光亮控制钮以获得适宜的照明亮度。
集光器越靠近载物台平面，则光线越强；光圈放得越大，光线也越强。
检查染色标本时，光线应强，光圈应放大，集光器要抬高。
检查未染色标本时光线宜较弱，此时应适当缩小光圈，降低集光器。
（3）染色标本上加一小滴香柏油，油勿过多，更勿将油涂开。
（4）置标本于载物台上。
弹簧夹固定，将待检部分移至接物镜下。
（5）转动接物镜旋转盘，使油镜头对准标本。
眼睛从侧面看着，转动粗调节器，使载物台逐渐上升，直至油镜头侵没入油滴内（上升程度是使油镜头几乎与标本接触，但两者切勿相碰！）然后眼睛转到目镜处，一面观察，一面调节粗调节器使载物台缓慢下降，待获得模糊物象时，再换用细调节器调节至物象清晰为止。
调节时千万不可使用强力将载物台任意上升，以至压碎标本玻片，甚至将贵重的油镜头损坏。
观察标本时，两眼应同时睁开，调节视度圈，使其与瞳距基本一致。
（6）观察完毕，转动粗调节使载物台下降，取下标本片，用滴加有乙酸乙酯的擦镜纸将油镜头的油擦净，再用干净的擦镜纸将镜头擦净（7）显微镜见图1-1二、革兰染色法[原理]革兰染色的原理可能与下列因素有关：1．革兰阳性菌等电点（PI2~3）比革兰阴性菌的等电点（PI4~5）低。
微生物实验01_革兰染色
脂溶性色素： 不溶于水，仅使菌落显 色而培养基颜色不变， 如金黄色葡萄球菌。
八、细菌感染的检查方法
（大小、形态、染色、排列、特殊结构）
细菌的分离培养与鉴定
“金标准”
细 菌 学 诊 断
采集血清 （双份）
血清学 诊断
标本的采集和运送原则
早期采集（未使用抗菌药物） 无菌采集 采集适当标本（血液、粪便、脑脊液） 采集双份血清（恢复期效价比急性期
革兰染色法 Gram stain
G＋菌：紫色 G－菌：红色
革兰染色法 Gram stain
原理：可能与细菌细胞壁的结构有关。
革兰氏阳性菌G＋
革兰氏阴性菌G—
革兰染色法 Gram stain
G+菌与G－菌细胞壁结构比较：
G+菌
强度 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 磷壁酸 外膜 结构 坚韧
G－菌
疏松
特殊结构：
荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞
荚膜 Capsule
荚膜是细胞壁外围绕的一 层粘性、胶冻状的物质， 不易着色。 染色：特殊染色或墨汁负 染。 形成：在营养丰富的条件 下（如机体内）。 功能：抗吞噬作用；黏附； 潴留水分，抗干燥。
鞭毛 Flagellum
鞭毛是菌体上的细长而弯 曲的丝状物。 类型：数目、位置、排列 功能：运动器官 具有抗原性
医学微生物学实验（一）
讲课教师：张戎 基础医学院病原生物学系 zhangrong@
实验内容
讲解：实验室规则、显微镜的使用、 细菌的形态、特殊结构、 细菌的变异、细菌的生化反应 录像：细菌感染的检查方法与防治原则 操作：革兰染色
一、实验室规则
1. 带学生证、红蓝铅笔和实验报告 2. 穿好白大褂 3. 不能在实验室吃东西、喝水 4. 实验操作时收起书本，避免污染 5. 物品按指定地点存放、丢弃
微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色(分析“染色”)共7张
1、涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上；
5将烘、染干水好 菌的液洗涂〔：片注放：倒空不去气能中直染晾接液干在或火，者焰用用上吸烘洗水烤瓶纸，吸以自干免载。菌体玻变片形〕的。一端轻轻冲洗〔切勿将菌膜冲掉〕，
使菌体固直定至于载流玻下片的上。水为无色为止。
6、枯燥：将玻片置于玻片架上，自然枯燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。
脱色时间对革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，G-菌转呈革兰氏阳性结果；
3微、生固物学定实：验细用菌夹的简子单夹染色住和载革兰玻氏片染色一端，迅速通过火焰2～3次， 涂载片玻使不 片菌易、过接体厚种固，杯否、定那木于么夹造子载成、玻局酒片部精菌灯上体、。脱擦色镜不纸完、全显，微而镜使。G-菌呈现革兰氏阳性结果。
将菌载玻片龄倾斜对使少革量菌液兰延伸氏至玻染片中央色。 结果的影响：选取处于活泼生长期— —指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌体尚未成熟或 菌体过老，可能使染色结果呈现相反的结果。
四、实验步骤
〔一〕简单染色的步骤 〔见P11〕
1、涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上；
在载玻片中央滴一小滴生理盐水，
混匀用并涂接成种薄环膜〔以注无：菌涂片操不作易取过厚少〕许。菌体于水滴中〔注：不要挑破培养基〕，
直至混流下匀的水并为涂无色成为薄止。膜〔注：涂片不易过厚〕。
3、固定：用夹子夹住载玻片一端，迅速通过火焰2～3次， ②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色局部带正电荷〔酸性染料的染色局部带
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5—8cm
金属柄约14.5cm
绝缘柄 约7.5cm
安装环(针)的螺口(约8mm)
操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）
Aseptic area 10-20cm
外焰 内焰
焰芯
细菌涂片的制备
菌液采取法
【操作步骤】
一、细菌涂片的制备
一般制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片 干燥 固定
实验内容
细菌染色标本观察 （革兰染色法） 细菌特殊结构观察 （荚膜、鞭毛、芽胞）
细菌的特殊结构观察
芽胞示教片：破伤风杆菌。 鞭毛示教片：变形杆菌。 荚膜示教片：肺炎双球菌。
产芽孢细菌的种类 芽胞
芽孢 菌体 （营养细胞）
破伤风梭菌×1000
鞭毛
变形杆菌鞭毛×1000
细菌荚膜示意图
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘
得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
【操作步骤】 革兰染液染色
初染 媒染 脱色 复染
冲洗
冲洗
冲洗
结晶紫 1’
冲洗
碘液 1’
滤纸干燥
95% 乙醇 30”油镜观察源自复红 1’革兰氏染色
甲 菌
紫色（G＋） 紫色（G＋） 初染 媒染 脱色
革兰氏染色步骤示意图 乙醇 稀释复红 结晶紫 碘液
乙 菌 红色（G-）
复染
革兰氏染色步骤示意图
【结果】
细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；
阳性菌——紫色
阴性菌——红色
实验报告
简要写出革兰氏染色原理、操作步骤， 绘制革兰染色镜下细菌图 绘制细菌特殊结构镜下图
荚膜的观察：
负染色
革兰染色法
由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。
【菌种】金黄色葡萄球菌 + 大肠杆菌
【试剂】革兰染液
【其他材料】酒精灯、接种环、玻片、吸水纸、 显微镜等 【方法】1、细菌涂片标本的制片 2、革兰染液染色 3、油镜下观察结果
细菌涂片的制备
器具：接种环（上）和接种针（下）