两种测定青霉素酰化酶活性的两种方法的比较

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酶活性的测定方法

酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。

以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。

常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。

2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。

例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。

3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。

荧光法的灵敏度高，操作简便。

例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。

4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。

例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。

5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。

常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。

例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。

值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。

羟胺法测定青霉素酶酶活的研究

数据重复性好、操作过程简便、操作体系小ｆ有只
５）ｍＬ，因此比碘量法更有优势。
方法的原理是：青霉素在青霉素酶作用下降解，降１材料与方法解产物青霉噻唑酸能与碘发生反应，根据青霉素酶１１试验材料．
图１青霉素与羟胺反应原理
Ｆｉ．Ｍｅｈｎｓｏａｔｎｂｔｅｅｉｉｉｎｇ１ｃａｉｍｆｅｃｉｅｒｏｗｅｎｐｎｃｌｎａｄｌｈｄｏｙａｎｙｒｘｌｍｉｅ
吴芝清【等人又改进了羟胺法，增加了显色的稳定】性。青霉素酶能够分解青霉素，如果青霉素酶的分
分解青霉素前后消耗碘量的差值，计算出单位时间内青霉素降解量，进而折算出青霉素酶的活性。但
是碘量法经常受到其他因素的影响，例如反应过程０２ｍｏ／盐酸羟胺：取盐酸羟胺１７７，以水．５ｌＬ．３ｇ

中图分类号：Ｒ７．１９８１
文献标识码：Ａ
青霉素酶属于Ｂ内酰胺酶，可水解青霉素类的１．３．内酰胺环，使抗生素失效［。目前，青霉素酶常用于 ”
解产物既不影响羟胺与青霉素的反应，也不影响羟
肟酸与三价铁离子进一步反应，则可根据单位时间内青霉素酶反应前后羟胺法测得的青霉素含量的差
３６ｌ

紫外分光光度法用于青霉素酶活力测定的研究

紫外分光光度法用于青霉素酶活力测定的研究马韦钰1，马仕洪2*（1.烟台大学，烟台264000；2.中国食品药品检定研究院，北京100050）摘要　目的：建立紫外分光光度法测定青霉素酶活力，并研究中国药典青霉素酶活力单位与国际单位之间的关系。

方法：利用青霉素与青霉噻唑酸在232 nm处的吸光系数不同，分别在30 ℃和37 ℃下，于232 nm 处用紫外分光光度计监控青霉素酶与一定量青霉素的反应过程，通过反应时间计算青霉素酶的活力；同时用中国药典的碘量法进行测定。

结果：本文所用的紫外分光光度法测定结果与中国药典规定的碘量法相比无显著性差异（P=0.302>0.05）。

中国药典青霉素酶活力单位（U）与国际单位（IU）的换算关系为：1 U=4.4×107 IU+2.6×105。

结论：紫外分光光度法测定青霉素酶活力方法重复性好，操作简单，快速。

建立的中国药典青霉素酶活力单位与国际单位之间的关系使两者具有可比性。

关键词：青霉素酶；灭活剂；酶活力；国际单位；紫外分光光度法；药典方法中图分类号：R 917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793（2017）06-1142-04doi：10.16155/j.0254-1793.2017.06.29Determination of penicillinase activity by UV spectrophotometryMA Wei-yu1，MA Shi-hong2*（1.Yantai University，Yantai 264000，China；2.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）Abstract Objective： To establish a measuring method of penicillinase activity by UV spectrophotometry and to explore the relationship between penicillinase activity unit in Chinese pharmacopoeia and that in international standard．Methods：Since the absorbances of penicillinaces and penicillanic acid were different at 232 nm， the reaction between penicillinace and penicillinase was able to be monitored by ultraviolet spectrophotometer at 30 ℃ and 37 ℃．The value of penicillinase activity was calculated through the reaction time， and then compared with that of iodometric assay in ChP．Results： The results of UV spectrophotometry and iodimetric method had no significant difference （P=0.302>0.05）．The relationship of Chinese pharmacopoeia unit of penicillinase activity （U）and international unit （IU） was 1 U=4.4×107 IU+2.6×105．Conclusion：The UV spectrophotometric method was simple， repeatable and rapid．It was comparable between penicillinase activity unit in Chinese pharmacopoeia and that in international standard．Keywords：penicillinase； inactivator；enzyme activity； international unit； UV spectrophotometry； pharmacopoeia method *　通信作者　Tel：(010)67095990；E-mail:mash@ 第一作者　Tel：185********；E-mail:mwyaq1002@青霉素酶在自然界的多细菌中广泛存在，能够水解青霉素类抗生素，是临床致病菌最重要的耐药机制之一［1］。

生化检验辅导：酶活性测定方法

20世纪50年代以前大都使用固定时间法。

这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。

50年代中期开始采用连续监测法。

这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。

（1）定时法：（两点法）通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。

其中t1往往取反应开始的时间。

酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中止反应法）。

加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。

该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。

优点：简单易行，对试剂要求不高。

缺点：难保证测定结果的真实性。

难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。

随着保温时间的延续，酶变性失活加速。

（2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。

在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。

因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。

实际工作中，采用工具酶的酶偶联法已经成为应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。

（3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。

2.按检测方法分类法：①分光光度法；②旋光法；③荧光法；④电化学方法；⑤化学反应法；⑥核素测定法；⑦量热法。

碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活

青霉素酰化酶除了在医药工业上用于大规模生产 - 内酰胺类抗生素中间体和半合成 - 内酰胺类抗生素之外 , 还有其他的一些潜在应用 , 对青霉素酰化酶的研究一直吸引着各国科。公式 : 酶活 ( IU / mL ) = ( ( V5 - V0 ) ∀ M ∀ 1000) / ( 5 ∀ V) , 式中 V 5: 样品消耗氢氧化钠溶液的毫升数 ( mL) ; V 0: 空白消耗氢氧化钠溶液的毫升数 ( mL) ; M : 氢氧化钠溶液浓度 ( mol/ L) ; 5: 反应时间( min) ; V: 取样体积 ( mL) 。 2 4 线性范围分别精密量取发酵液 ( 发酵 30 h 样品 ) 1, 2, 3, 4, 5 mL 按照上述方法进行检测 , 结果见表 1。以取样体积与消耗氢氧化钠溶液的量做线型图 , 结果表明所取样品酶活量在 20~ 100 IU 范围内呈良好线性 , 相关系数 0. 999 。表1
线性实验结果
2 mL 0. 03 2. 01 1. 98 3 mL 0. 03 3. 08 3. 05 4mL 0. 02 4. 12 4. 10
mL
5 mL 0. 04 5. 06 5. 02
Y = ( 1. 02X - 0. 034R ) / 0. 999
2 5 重复性
取发酵液 ( 发酵 30 h) 照上述方法重复检测 5 表 2 重复性实验结果
NaOH V0 V5 V 5- V 0 线性方程 1 mL 0. 02 1. 00 0. 98
。在发酵过程中 , 发酵液的酶活单位
是控制发酵液质量的重要指标 , 笔者发现采用碱液滴定进行酶活检测是行之有效的方法。 1 仪器和试剂 719S 型电位滴定仪 ( 带玻璃 pH 计 , 5 mL 滴定管 , 瑞士万通公司产 ) ; 电子恒温水浴锅 ( 控温 25 , 上海电子水浴锅厂) ; 离心机 ( 北京医用离心机厂 ) ; 电动搅拌浆 ( 瑞士万通公司) ; 二水合磷酸氢二钠 ( 分析纯 , 天津市永大化学试剂公司 ) ; 氢氧化钠 ( 分析纯 , 天津市永大化学试剂公司 ) , 青霉素 G 钾盐( 纯度 2 2 1 2 1 1 99. 0% , 中润公司生产) ; 磷酸 ( 分析纯 , 天津市永大化学试剂公司 ) 。方法与结果试剂溶液的配制 50 mmol/ L、 pH 7. 8 磷酸钠缓冲液将 17. 8 g

测定酶活性浓度的两大类方法

三、连续监测法测酶活性浓度
连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”，发达国家从 50 年代到 70 年代末用了约 20 余年的时间，我国从 80 年代初开始使用连续监测法，虽然发展很快，但至少仍有不少地区医院实验室仍使用老的方法，就是已使用新法的实验室，也不一定掌握得很好，本节将比较详细地从分类，酶偶联反应，测定注意事项等方面对连续监测法加以介绍。
当测定酶的反应速度明显大于指示酶，此时 A 很快转变为 B，由于指示酶反应慢，中间产物 B 大量推积，最终产物产生速度明显慢于底物 A 的消失速度。
当指示酶速度加大后，中间产物 B 堆积减小，指示酶反应速率偏差程度也变小。只有当指示酶大量达到高峰后的时期），C 和 A 的变化速度非常一致。也就是只有在些情况下，才是测定酶浓度的理想条件。
⒉间接连续监测法直接法试剂简单，操作方便，可惜的是只有当底物与产物之间，在光学性质或其它理化性质有显著差异时，才有可能使用此法。到目前为止，大部分酶都无法用直接法测定。
科学家还曾设法在原来反应体系中添加一些试剂，这些试剂必须不与酶作用也不影响酶活性，同时又能与酶反应物迅速作用，产生可以被直接测定的物质，典型的例子是 Ellman 的胆碱酯酶测定法，底物为硫代乙酰胆碱，酶水解产物硫代胆碱与添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用立刻生成黄色化合物，可在 412nm 用分光光度法连续监测。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶，在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。

青霉素酰化酶的固定技术分析

青霉素酰化酶的固定技术分析作者：高磊来源：《中国科技博览》2014年第11期论文摘要：文章讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。

一、青霉素酰化酶的固定化方法固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。

载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种。

1 、载体固定法吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。

物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。

离子吸附是利用酶解离状态2、无载体固定法（1）交联酶晶体（CLECs）晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限，浓缩的蛋白形成晶体，通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联，分子中静电反应和疏水反应数量增加，明显增强了蛋白质的稳定性。

交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域，应用前景广泛。

（2）交联酶聚集体（CLEAs） CLEAs的活性和稳定性可与CLECs相媲美。

在CLEAs制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出，能保持酶的三维构象和活性。

再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成CLEAs。

CLEAs催化的高效转化率和高效可循环再利用的特点，有利于实现固定化青霉素酰化酶的工业应用价值。

二、不同菌属青霉素酰化酶的固定化条件不同菌属所产青霉素酰化酶可能对应不同的固定化条件。

大规模生产青霉素G酰化酶的菌种有巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、埃希菌属大肠埃希菌（Escherichia coli）、雷氏普罗威登菌（Providencia rettgeri）和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）等，尤以前两种最常见。

产青霉素V酰化酶的菌种多为淡紫链霉菌（Streptomyces lavendulae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、球形杆菌（Bacillus sphaericus）和气单胞菌属（Aeromonas）等。

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展在如今医疗体系发展的过程中，青霉素酰化酶已经被广泛的使用到了抗生素制备体系中，以及一些多肽合成体系中。

高效的青霉素酰化酶使用，能够最大限度的提升酶本身在PH值、溶剂极性、温度等各个方面适用效果大幅度提高，这实际上已经成为了青霉素酰化酶在如今工业体系中应用的关键。

本篇文章着重针对青霉素酰化酶的固定化以及应用进展进行了全面详细的探讨。

标签：青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用青霉素酰化酶本身在实际使用的过程中，呈现出了良好的溶剂记性使用想以及反复使用的多方面稳定效果，由于这一特性的存在，使得青霉素酰化酶已经成为了工业体系的关键梭子啊。

下文主要是从载体选择固化以及应用的进展上来进行了全面详细的探讨。

1、载体形式1. 1有机高分子载体有机载体本身在实际使用的过程中，实际上具备了极为优秀的机械性强度，同时也完全可以通过产业化形式进行生产，天然性质的高分子载体在实际运行的过程过程中，表现出了极为优秀的传质性能、无毒性，被广泛使用到了壳聚糖、甲壳素之中。

由于其本身呈现出的有机分子有着较高的强度，但是在传质性能较差的情况下，例如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等一列的物质。

而从相关的研究结果来看，在针对高密度环氧结构体系下的载体固定，使用青霉素酰化酶执行了相应的处理之后又，催化活力所表现出的相关游离酶在这一过程中大幅度的提高，并且呈现出的重复使用稳定性也极强。

1.2无机分子载体在如今材料学持续发展的过程中，已经涌现出了孔分子筛形式的载体，其本身能够有效的对于高稳定的固化酶进行制备处理。

在使用了无机载体执行表面修饰以及酶固定的相关措施之后，其本身所表现出的相关性能实际上必然能够有较大幅度的提升。

某小组在进行课题研究的过程中，曾直接使用表面氨基形式的介孔二氧化硅材料，来针对青霉素酰化酶加以固定处理，其中呈现出的活力实际上直接达到了90%及以上，特别是在循环使用10次的催化处理之后，其中所表现出的活力实际上依然是维持在94%的水平上。

青霉素分解检验方法碘量法

待全部溶解后加蒸馏水至 250ml。 2.3.2 检测仪器设备 37℃水浴箱、试管、１毫升吸管、 0.1 毫升移液器 3 检测和结果判断 3.1 检测步骤
取 0.1ml 青霉素磷酸盐缓冲液于一小试管中，加入牛奶 1.5ml ，在 37℃水浴中放置 1 小时 20 分钟，不时摇动，加入淀粉溶液 3 滴, 摇匀，加入碘液 1 滴，在 37℃水浴中放置 2 分钟观察结果。同时做对照实验。 3.2 结果判读
在 2 分钟内能使蓝色完全消退的菌株为β - 内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。即蓝色为阴性；白色的为阳性。
本实验水浴 1 小时 20 分钟，检出限为 0.018g/L --0.06g/L. 3.3 注意事项： 3.3.1 由于青霉素钠很容易分解，因而用于实验的青霉素钠应现用现配。否则会产生假阳性结果。淀粉也应现用现配。 3.3.2 实验应按照步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。 3.3.3 每次试验最好用阳性和阴性对照。 3.3.4 注意使用器具的洁净，避免交叉污染。 3.3.5 水浴过程中需要多次震摇促进反应的进行。结果观察
时，在水浴中不断震摇有利于结果的观察。
未加入抗生素分解酶的样品结果：蓝色为阴性
加入抗生素分解酶的样品结果：白色为阳性
阳
阴
阴
性
性
性
阳
阴
阴
阴
性
性
性
性
阳
阴
性
性
中国检验检疫科学院验证碘量法检出限为 5 ppm ，证明此方法可行。图中为中国检验检疫科学院验证结果： β-内酰胺酶浓度从左至右依次为 0、2.5 ppm 和 5 ppm ，酶解时间 2 min 。
青霉素分解酶检测方法 __碘量法

测定酶活性的方法

测定酶活性的方法
测定酶活性的常用方法有以下几种：
1. 吸光测定法：利用酶催化底物反应产生的产物对特定波长的光的吸收变化进行测定，常见的方法有比色法和荧光法。

2. 浊度测定法：在酶催化底物反应中，产生的沉淀、胶束或团聚物等形成浑浊或沉淀，通过测定反应溶液的浊度变化来确定酶活性。

3. 冷凝法：利用酶催化底物反应产生的产物，通过与特定试剂发生反应产生气体或形成沉淀，在特定条件下进行冷凝，并通过测定冷凝物的质量或体积变化来确定酶活性。

4. 离子选择性电极法：利用通过酶催化底物反应产生或消耗的离子浓度变化，通过检测特定离子选择性电极反应电位的变化来测定酶活性。

5. 标记物测定法：将底物或产物标记上特定的分子或放射性核素，通过测定标记物在反应中的变化来测定酶活性，如放射性测定法、荧光标记物测定法等。

这些方法根据不同的实验要求和酶的特性可以选择不同的测定方法来进行酶活性的测定。

酶活性测量的方法有哪几种

酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。

根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。

以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。

在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。

比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。

2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。

这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。

荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。

3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。

这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。

发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。

4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。

该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。

放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。

5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。

这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。

电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。

6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。

这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。

色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。

表面活性剂法破壁提取青霉素酰化酶

２．表面活性剂法优于其他提取方法．该法操作简单．提取收率高，减少了水、电等能耗，且避免了高压均质机等高压设备的使用，是一种利于推广的毕赤酵母的破壁提取方法。（作者单位：华北制药股份有限公司）
关系
稀释１．５倍。
２．试剂准备：１Ｏ％十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）（表面
活性剂）。６０ｏＣ热水溶解；１ｍｏｌｌＬＮａＯＨ。
二、方法与计算
酶活收率＝离心上清液酶活／混液酶活
应用技术
暑 ■ — ＿馕富
表面活性剂法破壁提取青霉素酰化酶
李涛
．一｛ Leabharlann 霉素酰化酶广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。由巴斯德毕赤酵母产生的青霉素
加入１０％表面活性剂溶液（ＣＴＡＢ）．搅拌均匀后升温至４１ ℃，保温２小时，期间维持ｐＨ６．７￣０．１，保温结束后检测发酵液
混液酶活和上清液酶活，计算酶活收率。
为低温条件下酶由细胞内释放到细胞外速度较慢．而温度４３℃ 时酶活损失明显．应该是温度过高对活性蛋自的破坏导致．由此确定青霉素酰化酶破壁温度保持在４１℃至４２℃可使酶

青霉素几种分离纯化方法比较

生物工程下游技术期末作业青霉素的分离提纯方法的发展与比较摘要：本文主要介绍了青霉素的分离提纯方法的发展以及比较，包括传统的方法，如吸附法，沉淀法，溶剂萃取法等，也包括现代发展的高新技术，如反胶团萃取法，乳状液膜法，中空纤维更新液膜法以及其它的高效提取方法。

Abstract：This paper describes the development of penicillin G and the comparison of methods of separation and purification , including traditional methods, such as adsorption, precipitation, solvent extraction, but also includes modern high-tech development, such as reverse micelles extraction, emulsion liquid membrane hollow fiber renewal liquid membrane extraction and other efficient methods.正文：1、青霉素简介1、1基本性质：青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。

青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。

青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。

分子式为：1、2发展历程：早在唐朝时，长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合，就是因为绿毛产生的物质（青霉素素菌）有杀菌的作用，也就是人们最早使用青霉素。

酶活测定方法

、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。

在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。

通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。

色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。

该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。

粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。

木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。

基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。

这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。

免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。

用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。

在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

青霉素酰化酶的分离纯化

双功能膜纯化和固定PGA

Chih-I Chen等通过实验，将吸附于固定化Cu2+亲和膜的青霉素酰化酶与膜表面物质共价结合，制备成固定化酶
工艺流程
PGA
18℃ 12h
EDTA
pH 10.0, 18℃,76h
青霉素酰化酶； Cu2+；
配位键；
共价键
原初膜与固定化酶后的膜表面电镜结构
结果
离子交换膜色谱

离子交换膜色谱：离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的离子交换作用进行分离的根据离子交换基团的性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴离子型、弱阴离子型。
离子交换膜色谱的特点

操作条件较温和
使用寿命长选择性差

离子交换膜色谱分离青霉素酰化酶
青霉素酰化酶的分离纯化
青霉素

青霉素是常见抗生素之一。来源于点青霉、产黄青霉等真菌。对革兰氏阳性菌的生长有抑制作用
青霉素
青ห้องสมุดไป่ตู้素的分类
青霉素的代谢途径
α-氨基己二酸半胱氨酸缬氨酸
ACVS α-氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸 IPNS
异青霉素N
AT 青霉素

AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰基转移反应生成不同的青霉素添加苯乙酸相应的AT催化它与异青霉素N反应生成青霉素G 添加苯氧乙酸时，相应的AT催化它与异青霉素 N反应生成青霉素V

固定化

分离纯化
传统的分离纯化方法

硫酸铵沉降
葡聚糖凝胶色谱离子交换色谱电泳

据我们组阅读的文献，传统方法分离青霉素酰化酶的回收率大部分在30%至50% 有必要开发新型提纯工艺

大学生物化学实验中的酶活性测定方法

大学生物化学实验中的酶活性测定方法在大学生物化学实验中，酶活性测定是一个非常重要的实验项目。

酶是一种生物催化剂，它在生物体内起着至关重要的作用。

了解酶的活性对于研究生物体的代谢过程以及药物研发等领域具有重要意义。

本文将介绍一些常用的酶活性测定方法。

一、酶的活性测定原理酶的活性测定是通过测量酶催化下的反应速率来确定酶活性的。

酶活性的测定方法有很多种，其中常用的有比色法、荧光法和放射性同位素法等。

这些方法的原理都是基于酶催化下的底物转化反应。

二、比色法比色法是一种常用的酶活性测定方法。

该方法通过测量底物转化后所产生的产物的颜色强度来确定酶的活性。

比色法适用于那些底物转化后所产生的产物具有明显的颜色变化的酶反应。

比如，过氧化物酶（POD）催化底物苯酚和过氧化氢反应生成有色产物，可以通过测量产物的吸光度来计算酶的活性。

三、荧光法荧光法是一种基于酶催化下的底物转化反应产生荧光信号来测定酶活性的方法。

荧光法通常使用荧光素或荧光染料作为底物。

酶催化下的底物转化反应会导致荧光强度的变化，通过测量荧光强度的变化来计算酶的活性。

荧光法具有高灵敏度和高选择性的优点，适用于那些底物转化后产生荧光信号的酶反应。

四、放射性同位素法放射性同位素法是一种利用放射性同位素标记底物来测定酶活性的方法。

该方法通过测量底物转化后所产生的放射性同位素的放射活性来计算酶的活性。

放射性同位素法具有高灵敏度和高精确度的优点，但由于放射性同位素的使用，需要特殊的实验条件和设备。

五、其他方法除了上述介绍的比色法、荧光法和放射性同位素法外，还有许多其他的酶活性测定方法。

例如，电化学法利用电化学传感器测量底物转化后所产生的电流变化来测定酶活性；质谱法通过测量底物转化后所产生的质谱图谱来计算酶的活性。

这些方法各有特点，适用于不同类型的酶反应。

六、实验注意事项在进行酶活性测定实验时，需要注意以下几点。

首先，要选择合适的底物和催化剂，并控制实验条件，确保反应的可重复性。

青霉素酰化酶提取技术研究

青霉素酰化酶提取技术研究摘要：青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性，但是作为胞内酶，需要破壁后释放后才能发挥作用。

本研究采用超声破壁技术处理青霉素酰化酶粗酶液，通过单因素实验考察酶液比、超声时间、超声功率对细胞破壁率的影响情况。

实验结果显示酶液比对破壁效果影响最大，超声时间次之，超声功率的影响最小；超声最佳的处理参数为：酶液比为1:200，超声时间为10 min，超声功率为500W，得到超声处理的最大破壁率为78.2%。

本研究为青霉素酰化酶的提取提供了新的技术参数和理论指导，具有工业化价值。

关键词：青霉素酰化酶；提取；破壁；超声波1950年，日本的科学家第一次在产黄青霉Q176中发现了青霉素酰化酶（PA）[1]。

随后研究者发现自然界中的放线菌、细菌、真菌都能合成青霉素酰化酶[2]。

青霉素酰化酶具有重要的应用价值，是一种工具酶，广泛地应用于催化D-氨基酸类似物和β-内酰胺母核酶法合成新型的半合成β-内酰胺类抗生素，而且能逆向催化青霉素水解，生产β-内酰胺类抗生素中间体7-氨基-3-脱乙酸酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)和6一氨基头孢烷酸(6-ACA)，同时在手性药物的拆分和多肽合成等方面也有不错的表现[3]。

发酵液中不仅含有游离酶，还有大量的色素、无机盐、杂蛋白等杂质，这就需要对发酵液进行分离纯化，再使细胞内酶释放，从而得到比活好、纯度高的青霉素酞化酶[5]。

青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性[4]。

但是，由于青霉素酰化酶属于胞内表达酶，需要将酶从细胞内释放后细胞外发挥作用，这就需要破碎细胞或者改变细胞壁的通透性[6]。

细胞破壁技术包括机械破壁法和非机械破壁法。

其中机械破壁法的主要方式是高压均质器法和超声波破壁法[7]。

而非机械破壁法的典型方式则是冻融破壁法和溶酶菌法。

高压均质法容易操作，但是能源消耗过高，不利于工业化生产[8]。

冻融破壁法条件温和，但是耗时长。

溶酶菌法则是成本过高无法实现大生产[9]。

青霉素酰化酶酶活的荧光胺测定法

青霉素酰化酶酶活的荧光胺测定法
戴燕;静天玉
【期刊名称】《河北大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】1989(009)003
【摘要】青霉素酰化酶酶活可以利用荧光胺和6-氨基青霉烷酸(6-APA)反应加以测定。

这一方法操作方便、灵敏度高。

底物青霉素对反应没有干扰,其它干扰物质的影响可以通过控制pH4.0加以消除。

与6-硝基3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)方法相比,荧光胺方法可以反映酶与其真正底物青霉素之间的作用关系,在数值上,两种方法具有相关性,灵敏度高6倍。

与对一二甲胺基苯甲醛(PDAB)法相比,灵敏度高3.6×10~4倍。

【总页数】5页(P90-94)
【作者】戴燕;静天玉
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.8
【相关文献】
1.碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活 [J], 孙凤卿;罗建辉;康辉;赵霞
2.青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学 [J], 慕洋洋;甄倩楠;王梦凡;齐崴;苏荣欣;何志敏
3.人多巴胺D2基因启动子区-350 A/G多态位点荧光素酶表达载体的构建与鉴定及活性检测 [J], 段朝霞;张洁元;陈魁君;李晓霞;许川;王建民;李兵仓
4.荧光免疫测定法与酶免疫测定法、放射免疫测定法对庆大霉素的测定比较 [J], 解向群
5.血清中多巴胺的荧光分光光度测定法 [J], 邢亚东
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单宁酶活力测定方法的研究

将不同浓度的 PG 与其在 260nm、270nm、 280nm 处吸收值的关系分别作散点图( 图 1) 。
从散点图作初步判断, 在 270nm 处 PG 浓度与其吸收值之间呈直线关系, 散点集中于同一直线上。在 260nm、280nm 处, 散点不完全集中于同一直线上, 而直线 1 斜率最大,
第 10 卷第 6 期 2000 年 12 月
生物技术 BIOTECHNOLOGY
Vol. 10, No. 6 Dec, 2000
图 1 两种方法提取的粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳
A: 渗透压冲击法; B: 超声波法
从图 1 可知, 渗透压冲击法提取的粗酶液杂蛋白含量少, 而超声波法提取的粗酶液杂蛋白含量多。测定结果表明二者比活相差 10 倍以上, 与电泳结果一致, 活性染色显示第一条带为酶带。
将反应温度为 40 条件下, 1ml 酶液每分钟使 PG 液在 270nm 处减少 0 001 个吸收值定义为 1 个酶活力单位。
2 结果与讨论
2 1 没食子酸丙酯在紫外光区不同波长处的吸收值
波长 ( nm)
250 260 270 280 290 300 310 320 330
表 1 不同浓度 PG 在紫外区不同波长下的吸收值( OD) T able 1 The absorption value of PG on different wavelength in ultraviolet district
0. 083 0. 187 0. 287 0. 389 0. 484 0. 588 0. 685 0. 784 0. 883
0. 076 0. 167 0. 241 0. 337 0. 437 0. 538 0. 627 0. 700 0. 802