生物化学王镜岩第三第五章蛋白质的共价结构课件文稿演示
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生物化学课件3_蛋白质的共价结构
水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
★DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄 层层析、液相等
★ PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，
有机溶剂抽提，层析。
2020/5/8
29
§3.4 蛋白质一级结构测序
3、 测序前的准备工作
§3.3 肽
1、 肽和肽键的结构
2020/5/8
14
§3.3 肽
1、 肽和肽键的结构
★多肽链可以看成由Cα 串联起来的无数个酰胺平 面组成
2020/5/8
15
§3.3 肽
2、 肽的物理和化学性质
（1）、 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 （2）、 酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－ COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电
泳行为确定是Glu或是Gln。
2020/5/8
38
§3.4 蛋白质一级结构测序
5、 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
（3）、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖 苷
脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列：
§3.4 蛋白质一级结构测序
1、蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至 C端，目前能测100多个N端氨基酸。
（1）、 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法
N A 法裂解 A1 A2 B 法裂解 B1 B2
★DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄 层层析、液相等
★ PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，
有机溶剂抽提，层析。
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29
§3.4 蛋白质一级结构测序
3、 测序前的准备工作
§3.3 肽
1、 肽和肽键的结构
2020/5/8
14
§3.3 肽
1、 肽和肽键的结构
★多肽链可以看成由Cα 串联起来的无数个酰胺平 面组成
2020/5/8
15
§3.3 肽
2、 肽的物理和化学性质
（1）、 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 （2）、 酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－ COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电
泳行为确定是Glu或是Gln。
2020/5/8
38
§3.4 蛋白质一级结构测序
5、 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
（3）、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖 苷
脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列：
§3.4 蛋白质一级结构测序
1、蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至 C端，目前能测100多个N端氨基酸。
（1）、 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法
N A 法裂解 A1 A2 B 法裂解 B1 B2
蛋白质的共价结构优秀课件
定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列
顺序。
主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。
一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学 功能的基础。
（三）蛋白质构象和结构的组织层次
(二) 蛋白质的二级结构
定义 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间
结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空 间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。
• 1. 催化功能-酶 • 2. 调节功能-激素、基因调控因子 • 3. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白 • 4. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白 • 5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白 • 6. 结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架 • 7. 支架作用-接头蛋白 • 8. 防御功能-免疫球蛋白 • 9. 异常功能
（三）蛋白质构象和结构的组织层次
蛋白质的分子结构包括
一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure)
（三）蛋白质构象和结构的组织层次
(一)、蛋白质的一级结构(Primary structure）
Ser
Val
T yr
Asp
Gln
H
H
H
H
H
O
O
O
O
H3N+ C C N C C N C C N C C N C COO-
N-端 CH2
H CH
H CH2
H CH2
H CH2 C-端
OH
CH3CH3
CO2H
CH2
肽键 OH
CONH2
• 多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 • 含游离-氨基的一端：氨基端或N-端
顺序。
主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。
一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学 功能的基础。
（三）蛋白质构象和结构的组织层次
(二) 蛋白质的二级结构
定义 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间
结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空 间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。
• 1. 催化功能-酶 • 2. 调节功能-激素、基因调控因子 • 3. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白 • 4. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白 • 5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白 • 6. 结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架 • 7. 支架作用-接头蛋白 • 8. 防御功能-免疫球蛋白 • 9. 异常功能
（三）蛋白质构象和结构的组织层次
蛋白质的分子结构包括
一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure)
（三）蛋白质构象和结构的组织层次
(一)、蛋白质的一级结构(Primary structure）
Ser
Val
T yr
Asp
Gln
H
H
H
H
H
O
O
O
O
H3N+ C C N C C N C C N C C N C COO-
N-端 CH2
H CH
H CH2
H CH2
H CH2 C-端
OH
CH3CH3
CO2H
CH2
肽键 OH
CONH2
• 多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 • 含游离-氨基的一端：氨基端或N-端
王镜岩生物化学与分子生物学考研蛋白质化学文稿演示
蛋白质 OH-
紫色络合物
3.蛋白质的呈色反应
颜色反应→光吸收→定量分析
酚试剂反应：
磷钨酸 蛋白质
磷钼酸
蓝色化合物
3.蛋白质的呈色反应
颜色反应→光吸收→定量分析
米伦试剂反应：
氢键
α-碳原子 侧链
0.54nm 0.50nm
2. β-折叠 （β-sheet）
✓锯齿状
✓顺向平行、逆向平行
俯俯视视
✓作用键：氢键
侧侧视视
平反行平行
3.β-转角（ β-turn）
4．无规卷曲（random coil）
肽链的肽键平面不规则排列，形成松散的二级 结构。
（二）超二级结构与结构域
超二级结构（super secondary structure） 二级结构单元进一步聚集和组合在一起——模
（一）一级结构与功能的关系
某些蛋白质的一级结构加工后，才具有生物学活 性。
如胰岛素原（proinsulin）的一级结构加工
（一）一级结构与功能的关系
一级结构的改变可引起某些疾病的发生 由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病，称为
分子病（molecular disease）。 如镰状红细胞性贫血
三、三级结构 （tertiary structure）
化学键 --氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键 --亲水基团：分子表面；疏水基团：分子内部
三级结构示意图
离子键
极性基团
二硫键
四、四级结构 （quaternary structre）
定义：两个或两个以上独立三级结构的多肽链 通过次级键结合而形成的空间结构
pH>pI
等电点： 氨基酸所带正负电荷相等时溶液的pH （pI） 值即该氨基酸的等电点
紫色络合物
3.蛋白质的呈色反应
颜色反应→光吸收→定量分析
酚试剂反应：
磷钨酸 蛋白质
磷钼酸
蓝色化合物
3.蛋白质的呈色反应
颜色反应→光吸收→定量分析
米伦试剂反应：
氢键
α-碳原子 侧链
0.54nm 0.50nm
2. β-折叠 （β-sheet）
✓锯齿状
✓顺向平行、逆向平行
俯俯视视
✓作用键：氢键
侧侧视视
平反行平行
3.β-转角（ β-turn）
4．无规卷曲（random coil）
肽链的肽键平面不规则排列，形成松散的二级 结构。
（二）超二级结构与结构域
超二级结构（super secondary structure） 二级结构单元进一步聚集和组合在一起——模
（一）一级结构与功能的关系
某些蛋白质的一级结构加工后，才具有生物学活 性。
如胰岛素原（proinsulin）的一级结构加工
（一）一级结构与功能的关系
一级结构的改变可引起某些疾病的发生 由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病，称为
分子病（molecular disease）。 如镰状红细胞性贫血
三、三级结构 （tertiary structure）
化学键 --氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键 --亲水基团：分子表面；疏水基团：分子内部
三级结构示意图
离子键
极性基团
二硫键
四、四级结构 （quaternary structre）
定义：两个或两个以上独立三级结构的多肽链 通过次级键结合而形成的空间结构
pH>pI
等电点： 氨基酸所带正负电荷相等时溶液的pH （pI） 值即该氨基酸的等电点
王镜岩生化第三版课件蛋白质-精共50页文档
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
王镜岩生化第三版课件蛋白 质-精
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的Leabharlann 人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
50
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
王镜岩生化第三版课件蛋白 质-精
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的Leabharlann 人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
50
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
蛋白质的共价结构4课件.ppt
3).肽链分离和鉴定 分离: 层析 电泳 鉴定: SDS-PAGE；N-末端分析
蛋白质的共价结构(4)课件
1).亚基拆分: • 寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接 血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体）
8mol/L尿素 6mol/L盐酸胍
• 多肽链以共价键连接 胰岛素：过甲酸氧化
β-巯基乙醇还原
2） 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下
1 酸碱性：
肽链中末端α-羧基的pKa值比游离氨基酸中的 大；末端α-氨基的pKa值比游离氨基酸中的小。
肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带 电荷情况，再统计净电荷的量（P166表4-6）。
（二） 肽的理化性质
•. 化学反应: 化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存
在,肽可以进行双缩脲反应。 茚三酮反应: 双缩脲反应：肽和蛋白质特有，而为氨基酸所
•. 化学反应:
由于多肽和蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的 肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应
多肽或蛋白质与铜离 子的络合物部分结构
（二） 肽的理化性质
3 旋光性质： 小肽：各氨基酸旋光度之和 长肽和蛋白：不是简单加和
（三）天然存在的活性肽
类别：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素
实例：短杆菌肽（抗生素） 谷胱甘肽： - 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 GSH（还原型）：三肽 GSSG（氧化型）：六肽 脑啡肽：五肽，神经系统 鹅膏蕈碱：环八肽 鹅肌肽（ -Ala-1-甲基-his) 二肽 肌肽（ -Ala-his) 二肽
（三）天然存在的活性肽
OH
CH3 CH CH2OH
CH O
O
O
HN CH C NH CH C NH CH2 C
蛋白质的共价结构(4)课件
1).亚基拆分: • 寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接 血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体）
8mol/L尿素 6mol/L盐酸胍
• 多肽链以共价键连接 胰岛素：过甲酸氧化
β-巯基乙醇还原
2） 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下
1 酸碱性：
肽链中末端α-羧基的pKa值比游离氨基酸中的 大；末端α-氨基的pKa值比游离氨基酸中的小。
肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带 电荷情况，再统计净电荷的量（P166表4-6）。
（二） 肽的理化性质
•. 化学反应: 化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存
在,肽可以进行双缩脲反应。 茚三酮反应: 双缩脲反应：肽和蛋白质特有，而为氨基酸所
•. 化学反应:
由于多肽和蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的 肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应
多肽或蛋白质与铜离 子的络合物部分结构
（二） 肽的理化性质
3 旋光性质： 小肽：各氨基酸旋光度之和 长肽和蛋白：不是简单加和
（三）天然存在的活性肽
类别：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素
实例：短杆菌肽（抗生素） 谷胱甘肽： - 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 GSH（还原型）：三肽 GSSG（氧化型）：六肽 脑啡肽：五肽，神经系统 鹅膏蕈碱：环八肽 鹅肌肽（ -Ala-1-甲基-his) 二肽 肌肽（ -Ala-his) 二肽
（三）天然存在的活性肽
OH
CH3 CH CH2OH
CH O
O
O
HN CH C NH CH C NH CH2 C
王镜岩生物化学与分子生物学考研蛋白质化学(精品课件)
定义：两个或两个以上独立三级结构的多肽链 通过次级键结合而形成的空间结构
疏水键、氢键、盐键
亚 基
2006-8
ppt课件，可编辑
35
血红蛋白四级结构示意图
4个亚基构成 2α-亚基 2β-亚基
2006-8
ppt课件，可编辑
36
蛋白质一、二、三、四级结构示意图
2006-8
ppt课件，可编辑
37
五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键
ppt课件，可编辑
10
碱性氨基酸
=
H2N-C-NH— NH
2006-8
ppt课件，可编辑
11
（三）氨基酸的理化性质 1. 两性电离和等电点
氨基酸具有氨基、羧基等
能接受H+而成——NH3+ 具碱性
能电离出H+而成——COO具酸性
2006-8
ppt课件，可编辑
12
氨基酸的两性电离
pH<pI
pH=pI（兼性离子）
空间结构
一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
2006-8
ppt课件，可编辑
20
一、一级结构
概念：多肽链中氨基酸的组成与排列顺序 主键：肽键 意义：决定蛋白质的空间结构
2006-8
ppt课件，可编辑
21
胰岛素的一级结构
B链 A链
2006-8
ppt课件，可编辑
22
二、二级结构 （secondary structure）
定义 蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转，构成 的局部空间构象。
2006-8
ppt课件，可编辑
23
（一）二级结构的类型
α-螺旋 β-折叠 β-转角 无规则卷曲
疏水键、氢键、盐键
亚 基
2006-8
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35
血红蛋白四级结构示意图
4个亚基构成 2α-亚基 2β-亚基
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36
蛋白质一、二、三、四级结构示意图
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37
五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键
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10
碱性氨基酸
=
H2N-C-NH— NH
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11
（三）氨基酸的理化性质 1. 两性电离和等电点
氨基酸具有氨基、羧基等
能接受H+而成——NH3+ 具碱性
能电离出H+而成——COO具酸性
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12
氨基酸的两性电离
pH<pI
pH=pI（兼性离子）
空间结构
一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
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一、一级结构
概念：多肽链中氨基酸的组成与排列顺序 主键：肽键 意义：决定蛋白质的空间结构
2006-8
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21
胰岛素的一级结构
B链 A链
2006-8
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22
二、二级结构 （secondary structure）
定义 蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转，构成 的局部空间构象。
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23
（一）二级结构的类型
α-螺旋 β-折叠 β-转角 无规则卷曲
(推荐)《王镜岩生物化学》PPT课件
平面偏振光
如果让光通过一个象栅栏一样的 Nicol 棱镜 (起偏镜) 就不是所有方向的光都能通过，而只有与棱镜晶轴方向 平行的光才能通过。这样，透过棱晶的光就只能在一个 方向上振动，象这种只在一个平面上振动的光，称为平
12
面偏振光，简称偏振光或偏光。
生物化学.第一篇 .生物分子的结构和化学
第一章 生物分子导论
细胞器(organelle)（细胞核、线粒体,高尔基体等)
6
细胞(原核细胞,真核细胞等)
生物化学.第一篇 .生物分子的结构和化学
第一章 生物分子导论
三.生物分子的三维结构
1.生物分子大小:生物分子不仅种类繁多,在大小方面跨度也很大,例如,丙 氨酸分子量是89,但烟草花叶病毒达到40000000.
2.立体异构与构型
故：分子的手性是对映体存在的必要和充分条件。
19
§3—4— 3 含一个手性碳原子化合物的对映异构 一、构型的表示法： 1. 透视式（三维结构）：略 2.Fischer 投影式：
COOH
H
OH
COOH
H
OH
C H3
CH3
20
使用Fischer 投影式的注意事项： (1)可以沿纸面旋转，但不能离开纸面翻转。
一.什么是生物化学(Biochemistry、Biological chemistry )
D.通常将生物大分子结构、功能及其代谢调控的研究称为分子生物学 (Molecular biology).在某种意义上,分子生物学是生物化学发展的一个新阶段. 所以这门学科也称为生物化学与分子生物学 （Biochemistry & Molecular Biology）.
第三十章 DNA的复制和修复
如果让光通过一个象栅栏一样的 Nicol 棱镜 (起偏镜) 就不是所有方向的光都能通过，而只有与棱镜晶轴方向 平行的光才能通过。这样，透过棱晶的光就只能在一个 方向上振动，象这种只在一个平面上振动的光，称为平
12
面偏振光，简称偏振光或偏光。
生物化学.第一篇 .生物分子的结构和化学
第一章 生物分子导论
细胞器(organelle)（细胞核、线粒体,高尔基体等)
6
细胞(原核细胞,真核细胞等)
生物化学.第一篇 .生物分子的结构和化学
第一章 生物分子导论
三.生物分子的三维结构
1.生物分子大小:生物分子不仅种类繁多,在大小方面跨度也很大,例如,丙 氨酸分子量是89,但烟草花叶病毒达到40000000.
2.立体异构与构型
故：分子的手性是对映体存在的必要和充分条件。
19
§3—4— 3 含一个手性碳原子化合物的对映异构 一、构型的表示法： 1. 透视式（三维结构）：略 2.Fischer 投影式：
COOH
H
OH
COOH
H
OH
C H3
CH3
20
使用Fischer 投影式的注意事项： (1)可以沿纸面旋转，但不能离开纸面翻转。
一.什么是生物化学(Biochemistry、Biological chemistry )
D.通常将生物大分子结构、功能及其代谢调控的研究称为分子生物学 (Molecular biology).在某种意义上,分子生物学是生物化学发展的一个新阶段. 所以这门学科也称为生物化学与分子生物学 （Biochemistry & Molecular Biology）.
第三十章 DNA的复制和修复
王镜岩-生物化学-第5章_蛋白质的三维结构
④ 氨基酸残基侧链向外；
⑤ 相邻螺圈之间形成 链内氢链，氢键的取 向几乎与中心轴平行。 ⑥ 肽键上N-H氢与它后 面（ N 端）第四个残基 上的 C=0 氧间形成氢键。 这种典型的α螺旋用 3.6 13表示，3.6表示每 圈螺旋包括 3.6 个残基， 13表示氢键封闭的环 包括13个原子。
2. α螺旋的偶极矩和帽化 α螺旋中氢键都沿螺旋轴指向同一方向 ,每一肽键具有由 NH 和 C=O 的极性产生的偶极矩。α螺旋本身也是一个偶极矩。
在纤维状蛋白质的β折叠中，氢键主要是在肽链之间形式， 而在球状蛋白质中，β折叠既可在不同肽链间形成，也可在 同一肽链的不同部分间形成。
（三）β-转角（β-turn）
β-转角也称β-回折（reverse turn）、β弯曲（β-bend）、发夹结构（hairpin structure） β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折， 有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O 与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。
α螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性：一旦形成 一圈α螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而 迅速。 4. 影响α螺旋形成的因素 R侧链的大小和带电性决定了能否形成α螺旋以及形成的α 螺旋的稳定性： ① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys， 或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从 而不能形成稳定的α螺旋。如多聚 Lys 、多聚 Glu 。而当这 些残基分散存在时，不影响α螺旋稳定。 ② Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使 形成α螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α螺旋。 丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
从Ciα向Ni看，沿顺时针方向 旋转Ciα-Ni键所形成的Φ规定 为正值，反时针方向旋转为负 值； 从Ciα向Ci看, Ciα -Ci顺时针 Ψ为（+）反时针Ψ为（-）
王镜岩-生物化学-第5章_蛋白质的三维结构
（一）-螺旋 -helix
1.α螺旋的结构
在 α 螺 旋 中， 多 肽 主 链按 右 手 或 左 手方 向 盘 绕 ，形 成右手螺旋或左手螺旋 ， 相 邻 的 螺 圈之 间 形 成 链内 氢键，构成螺旋的每个Cα 都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋特征：
① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋； ② 每圈螺旋：3.6个a.a残基， 高度：0.54nm ; ③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm；
共价键和次级键键能对比
• 肽键
• 二硫键 • 离子键 • 氢键 • 疏水键
90kcal/mol
3kcal/mol 1kcal/mol 1kcal/mol 0.1kcal/mol
数量巨大
• 范德华力
这四种键能远小于共价键，称次级键
提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主 要的作用力,原因何在?
氢键是两个极性基团之间的弱键，也就是一个偶极 (dipole) 的带正电荷的一端被另一偶极带负电荷的一端所吸引形成的 键。存在于肽链与肽链之间，亦存在于同一螺旋肽链之中。 氢键虽然是弱键，但蛋白质分子中的氢键很多，故对蛋白质 分子的构象起着重要的作用。 方向用键角表示，是 指X—H与H…Y之间的 夹角，一般为180～ 250。
包括 三种弱的作用力： 定向效应: 极性基团间 诱导效应: 极性与非极性基团 间 分散效应: 非极性基团间
范德华力非常依赖原子间的距离，只有当两个非键合 原子处于一定距离时(当相互靠近到大约0.4～ 0.6nm(4～6A)时)，才能达到最大。
疏水键是蛋白质分子中疏水性较强的一些氨基酸(如缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等)的侧链避开水相自相粘附聚 集在一起，形成孔穴，对维持蛋白质分子的稳定性起一定作 用。 它在维持蛋白质的三级结
第3章蛋白质的共价结构PPT课件
3.多肽链的部分裂解和肽段混合物 的分离纯化
（
• 酶解法:
1
）
• 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶
多 肽
• 裂解后通过凝胶过滤、凝胶电泳和高效液相色谱分离纯化。
• (6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多 种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或 多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。
第24页/共46页
(4)二硫键的断裂
• 由几条多肽链构成的蛋白质分子存在两种形式： • 1.几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用
8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分 开多肽链(亚基). • 2.几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过 量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基， 然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它 重新被氧化。
2.肽的命名
H3N+ N-端
Ser H
O
CC
Val H
O
NCC
CH2
H CH
OH
CH3 CH3
肽键
Tyr H
O NCC H CH2
OH
Asp H
NCC
H CH2 CO2H
Gln H
N C COOH CH2 C-端
CH2
CONH2
• 根据参与其组成的氨基酸残基从N-末端开始命 名。
• 如上述五肽可称为丝氨酰缬氨酰酪氨酰天门冬 氨酰谷氨酰氨，N-末端氨基酸残基在左，C末端氨基酸残基在右。
第19页/共46页
1. 测序的一般策略
• (2)多肽链的拆分。
• 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进 行拆分。
• 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的 非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法 拆分多肽链间的二硫键。
王镜岩生物化学课件-第五章 蛋白质的三维结构(修改版2)
二、范德华力 (van der Waals force)
狭义的范德华力指是非极性分子或基团瞬时 偶极间的静电相互作用，所以是一种很弱的 作用力。 实际上范德华力包括引力和斥力两种相互作 用。非共价键合原子或分子相互挨得太近时， 由于电子云重叠，将产生范德华斥力。 虽然就其个别来说范德华力是很弱的，但是 相互作用数量大并且具有加和效应，因此就 成为一种不可忽视的作用力。
一、氢键 (hydrogen bond)
氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。氢键的 形成情况：多肽的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键， 除此之外，氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质 水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。
大多数蛋白质所 采取的折叠策略 是使主链肽基之 间形成最大数目 的分子内氢键 (如α螺旋、β折 叠片)，与此同 时保持大多数能 成氢键的侧链处 于蛋白质分子的 表面将与水相互 作用
质量数（a） 奇数
原子序数（Z） 自旋量子（I） 例子 奇或偶 1/2，2/3， 2/5，… 0
I I 1 2 3 2 , H 1, C6 , N 7; , B5 ; I
11 1 13 15
5 2
, O8
17
偶数
偶数
12
C 6 , O 8 , S 16
16
32
偶数
奇数
1，2，3，…
I 1, H 1 ; N 7
离子键
氢键
范德华力
疏水相互作用力
稳定蛋白质构象的力
目录
维持蛋白质空间结构中重要的化学键
（1）非共价键 氢键
离子键
范德瓦尔力 疏水作用
（2） S-S键
氢键
疏水作用 和范德华力
王镜岩生物化学002氨基酸与蛋白质ppt课件
第三章
蛋白质
2019/11/22
1
第一节 蛋白质概论
一、 蛋白质的化学组成与分类
1、元素组成
碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼
硫 0-3%
凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25
2、 氨基酸组成
蛋白质是由20种L-型α 氨基酸组成的长链分子。
2019/11/22
2
7
一、蛋白质的水解
酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解：消旋，色氨酸稳定 酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱
2019/11/22
8
二、氨基酸的结构与分类
重点
基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种 稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸经酶促修饰而来
非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质 (约150种)
2 pI
pK
1
pK
2 log
[R ] [R ]
pI 1 ( pK 1 pK 2 ) 2
2019/11/22
45
氨基酸等电点的计算
中性氨基酸 pI pKa ( COOH ) pKa ( NH3 ) 2
酸性氨基酸 pI pKa ( COOH ) pKR 2
碱性氨基酸 pI pKa ( NH3 ) pKR 2
22
（1）非极性氨基酸 9种 在维持蛋白质的三维结构中起着重要
（蛋白质的疏水核心）。 （2） 不带电何的极性氨基酸 6种
这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水 （3）带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸) 2种
（4）带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸) 3种
2019/11/22
蛋白质
2019/11/22
1
第一节 蛋白质概论
一、 蛋白质的化学组成与分类
1、元素组成
碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼
硫 0-3%
凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25
2、 氨基酸组成
蛋白质是由20种L-型α 氨基酸组成的长链分子。
2019/11/22
2
7
一、蛋白质的水解
酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解：消旋，色氨酸稳定 酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱
2019/11/22
8
二、氨基酸的结构与分类
重点
基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种 稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸经酶促修饰而来
非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质 (约150种)
2 pI
pK
1
pK
2 log
[R ] [R ]
pI 1 ( pK 1 pK 2 ) 2
2019/11/22
45
氨基酸等电点的计算
中性氨基酸 pI pKa ( COOH ) pKa ( NH3 ) 2
酸性氨基酸 pI pKa ( COOH ) pKR 2
碱性氨基酸 pI pKa ( NH3 ) pKR 2
22
（1）非极性氨基酸 9种 在维持蛋白质的三维结构中起着重要
（蛋白质的疏水核心）。 （2） 不带电何的极性氨基酸 6种
这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水 （3）带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸) 2种
（4）带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸) 3种
2019/11/22
第5章蛋白质的三维结构(共105张PPT)
上图：L-Ala残基的拉氏构象图，横坐标为的取 值，纵坐标为 的取值。
32
多肽主链形成三维结构的空间限制
拉氏图不仅对蛋白质的构象研究起到了简化作用，对于 判断所得到的蛋白质结构模型的正误也有意义。 实际得到的许多蛋白质的三维结构证实了拉氏图是根本 正确的。
33
5.4 二级结构：多肽链折叠的规那么方式 Secondary structure :The common regular
• 反平行折叠片较稳定，重复单位为0.7 nm， 即每个氨基酸的长度为0.35nm;
α螺旋的偶极矩
α螺旋相当于在N—末端 积累了局部负电荷，在 C—末端积累了局部正电荷
43
Protein Secondary structure
α螺旋的手性
• 蛋白质中的α螺旋几乎
都是右手的 (除胶原蛋白外)。
44
影响α螺旋形成的因素
• 与它的氨基酸组成和序列有极大的关系:
– 侧链R-基团所带的电荷。如多聚赖氨酸， 不能形成；
多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的 外表，与水分子作用形成排列有序的水化层，稳 定蛋白质的构象。
16
5.2.5 二硫键 Disulfide bond
Covalent bond between side chains of two cysteine residues
17
Disulfide bond
Bond Energy （kJ/mol）
13－30 4－8 12－20 12－30 210 376.81
21
5.3 多肽主链折叠的空间限制
5.3.1 肽键和肽平面
多肽主链是由-NH-Cα-CO-相连重复排列 形成的。164
肽基〔peptide
32
多肽主链形成三维结构的空间限制
拉氏图不仅对蛋白质的构象研究起到了简化作用，对于 判断所得到的蛋白质结构模型的正误也有意义。 实际得到的许多蛋白质的三维结构证实了拉氏图是根本 正确的。
33
5.4 二级结构：多肽链折叠的规那么方式 Secondary structure :The common regular
• 反平行折叠片较稳定，重复单位为0.7 nm， 即每个氨基酸的长度为0.35nm;
α螺旋的偶极矩
α螺旋相当于在N—末端 积累了局部负电荷，在 C—末端积累了局部正电荷
43
Protein Secondary structure
α螺旋的手性
• 蛋白质中的α螺旋几乎
都是右手的 (除胶原蛋白外)。
44
影响α螺旋形成的因素
• 与它的氨基酸组成和序列有极大的关系:
– 侧链R-基团所带的电荷。如多聚赖氨酸， 不能形成；
多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的 外表，与水分子作用形成排列有序的水化层，稳 定蛋白质的构象。
16
5.2.5 二硫键 Disulfide bond
Covalent bond between side chains of two cysteine residues
17
Disulfide bond
Bond Energy （kJ/mol）
13－30 4－8 12－20 12－30 210 376.81
21
5.3 多肽主链折叠的空间限制
5.3.1 肽键和肽平面
多肽主链是由-NH-Cα-CO-相连重复排列 形成的。164
肽基〔peptide
生物化学第5章-蛋白质的三维结构(共41张PPT)
锌指结构，Zinc finger；
亮氨酸拉链结构，Leucin zipper；
EF手型钙结合性模序
(EF-hand Ca2+-binding motif）
肌钙蛋白的两个结构域。
七、球状蛋白与三级结构
1、定义：蛋白质的三级结构是指多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即整 条肽链的三维构象。蛋白质的三级结构是在多种二级结构的基础上进一步
早在20世纪30年代，科学家就开始有X-射线衍射方法研究了肽的结构。 1、酰胺平面：参与肽键形成的两个原子及相邻的四个原子处于同一平面
，形成了酰胺平面，也称肽键平面，又称一个肽单位；多肽链的主链 由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。
肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋 转;(肽键中C-N键长0.132nm, C-N单键0.148nm,C=N键）
基酸,某些氨基酸如脯氨酸和甘氨酸经常存在其中,由于甘氨酸缺少侧链(只有一个H),在β-转
角中能很好的调整其他残基的空间阻碍,因此使立体化学上最合适的氨基酸；而脯氨酸残
基的R与其α氨基己形成吡咯环，不能形成α-螺旋，因此在一定程度上迫使β-转角形成 。
四、Protein的二级结构——无规则卷曲
random coil
侧链与介质水，主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。
②稳定蛋白质三维结构的作用力——盐键
盐键又称盐桥或离子键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负 电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离 子键。多数情况下，可解离侧链基团分布在球状蛋白的表面，与介 质水形成水化层，稳定蛋白构象。
酰胺平面中的键长、键角是一定的；
亮氨酸拉链结构，Leucin zipper；
EF手型钙结合性模序
(EF-hand Ca2+-binding motif）
肌钙蛋白的两个结构域。
七、球状蛋白与三级结构
1、定义：蛋白质的三级结构是指多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即整 条肽链的三维构象。蛋白质的三级结构是在多种二级结构的基础上进一步
早在20世纪30年代，科学家就开始有X-射线衍射方法研究了肽的结构。 1、酰胺平面：参与肽键形成的两个原子及相邻的四个原子处于同一平面
，形成了酰胺平面，也称肽键平面，又称一个肽单位；多肽链的主链 由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。
肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋 转;(肽键中C-N键长0.132nm, C-N单键0.148nm,C=N键）
基酸,某些氨基酸如脯氨酸和甘氨酸经常存在其中,由于甘氨酸缺少侧链(只有一个H),在β-转
角中能很好的调整其他残基的空间阻碍,因此使立体化学上最合适的氨基酸；而脯氨酸残
基的R与其α氨基己形成吡咯环，不能形成α-螺旋，因此在一定程度上迫使β-转角形成 。
四、Protein的二级结构——无规则卷曲
random coil
侧链与介质水，主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。
②稳定蛋白质三维结构的作用力——盐键
盐键又称盐桥或离子键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负 电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离 子键。多数情况下，可解离侧链基团分布在球状蛋白的表面，与介 质水形成水化层，稳定蛋白构象。
酰胺平面中的键长、键角是一定的；
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1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结 构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp3 sp2
sp2 sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：•限制绕肽键的自由旋转 •形成酰胺平面 •产生键的平均化 •肽键呈反式构型
4、二硫键的拆分与保护
5、分析每一多肽链的氨基酸组成
6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
7 、多种方法的部分水解
8、测序
9、重叠
10 、二硫键位置的确定
N端的测定方法
1、Sanger（二硝基氟苯）法 2、丹磺酰氯法 3、Edman法 4、酶降解法
氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应
（sanger反应）
历史上第一个被确定 氨基酸序列的蛋白质
胰岛素
insulin
胰岛素的历史 第一个生化药物
• 最小的蛋白质，由A链(21 AA)和B (30 AA)组成；动物胰腺ß 细胞分泌的一种激 素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；
• 1921年Banting & Best 从胰腺中抽提 出了有活性的胰岛素，1923年Banting & Macleod获Nobel医学奖；
• 1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素 的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；
• 1981年，Berg（因DNA重组技术得奖） 在大肠杆菌中表达了人胰岛素.
一蛋级 白结质构一测 级定结策构略测定步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化
2、测定蛋白质分子中多肽链的数目
3、亚基分离
生物化学王镜岩第三第五章蛋白质的共价结构课件文稿演 示
蛋白质结构层次
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质 的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）
专一酶：
Lys-X; X-Lys; Arg-X; Glu-X; X-Asp; Pro-X;
Asn-X , 商品名：Endoproteinase Asn-C
DABITC ：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团
Edman降解法2
Edman 降解法(II)
无冕英雄Pehr Victor Edman
• 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19
• 1946-47年在美国留学时想到改进1930
年Abderhalden & Brockmann发明的
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1234 5 结论：A B C D E
酰化反应
CH3 CH3 N
CH3 CH3 N
H2N—CH—COOH +
pH9.7
R
O=S=O 40℃ O=S=O
Cl
HN—CH—COOH
5-二甲氨基萘磺酰氯 （DNS-Cl）
R
DNS-氨基酸
取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
蛋白质与无水肼加热
-------NH-CH-CONH-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
＋NH2NH2，100℃，5～10h
-- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
溶于有机溶剂而被除去
多种方法确定
酶解法末端测序
酶解法末端测序
利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端 (aminopeptidase) 或C端 (carboxypeptidase) 一个接一个游 离出来， 在不同时间取样进行分析，根 据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判
断氨基酸的排列顺序。
化学法专一性水解
肽键的专一性水解(化学法)
化学法: CNBr, H+, NH2OH, etc
消化道内几种蛋白酶的专一性
氨肽酶
（Phe.Tyr.Trp）
（Arg.Lys）
羧羧肽肽酶酶
（Phe. Trp）
（脂肪族）
胃蛋白酶
胰凝乳 弹性蛋白酶 胰蛋白酶 蛋白酶
酶法专一性水解
肽键的专一性水解(酶法)
氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate） 弱硷中 (400 C)
(硝基甲烷 400 C) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
Edman降解法1
Edman 降解法(I)
PITC试剂的反应, 50年发明Edman
degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950)
1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始
过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个 氨基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开 发仪器的方便. 1972年到德国,77年因脑瘤过世.
泛用酶：
胰蛋白酶（trypsin）；
Lys-X, Arg-X (X≠Pro)
胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;
X≠Pro)
嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；
木瓜蛋白酶（papain）；
X-Y (X=R, K,Q, H, Y)
Байду номын сангаас
胃蛋白酶（pepsin）；
+
DNFB（dinitrofiuorobenzene）
弱碱中
氨基酸
DNP-AA(黄色)
+ HF
Sanger试剂标记反应
Sanger试剂(FDNB)标记N末端
Sanger试剂标记测序
ABCDE ↓ FDNB
*ABCDE ↓ 部分水解
*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE ↓ 完全水解
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E ↓ FDNB
• 由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和 相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore & Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是 Edman没有和他们分享Nobel化学奖.
C端的测定方法
1、肼法 2、还原法 3、酶降解法
肼法C端测定
肼(hydrazine)法测定
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp3 sp2
sp2 sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：•限制绕肽键的自由旋转 •形成酰胺平面 •产生键的平均化 •肽键呈反式构型
4、二硫键的拆分与保护
5、分析每一多肽链的氨基酸组成
6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
7 、多种方法的部分水解
8、测序
9、重叠
10 、二硫键位置的确定
N端的测定方法
1、Sanger（二硝基氟苯）法 2、丹磺酰氯法 3、Edman法 4、酶降解法
氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应
（sanger反应）
历史上第一个被确定 氨基酸序列的蛋白质
胰岛素
insulin
胰岛素的历史 第一个生化药物
• 最小的蛋白质，由A链(21 AA)和B (30 AA)组成；动物胰腺ß 细胞分泌的一种激 素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；
• 1921年Banting & Best 从胰腺中抽提 出了有活性的胰岛素，1923年Banting & Macleod获Nobel医学奖；
• 1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素 的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；
• 1981年，Berg（因DNA重组技术得奖） 在大肠杆菌中表达了人胰岛素.
一蛋级 白结质构一测 级定结策构略测定步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化
2、测定蛋白质分子中多肽链的数目
3、亚基分离
生物化学王镜岩第三第五章蛋白质的共价结构课件文稿演 示
蛋白质结构层次
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质 的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）
专一酶：
Lys-X; X-Lys; Arg-X; Glu-X; X-Asp; Pro-X;
Asn-X , 商品名：Endoproteinase Asn-C
DABITC ：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团
Edman降解法2
Edman 降解法(II)
无冕英雄Pehr Victor Edman
• 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19
• 1946-47年在美国留学时想到改进1930
年Abderhalden & Brockmann发明的
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1234 5 结论：A B C D E
酰化反应
CH3 CH3 N
CH3 CH3 N
H2N—CH—COOH +
pH9.7
R
O=S=O 40℃ O=S=O
Cl
HN—CH—COOH
5-二甲氨基萘磺酰氯 （DNS-Cl）
R
DNS-氨基酸
取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
蛋白质与无水肼加热
-------NH-CH-CONH-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
＋NH2NH2，100℃，5～10h
-- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH
|
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Rx
Ry
溶于有机溶剂而被除去
多种方法确定
酶解法末端测序
酶解法末端测序
利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端 (aminopeptidase) 或C端 (carboxypeptidase) 一个接一个游 离出来， 在不同时间取样进行分析，根 据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判
断氨基酸的排列顺序。
化学法专一性水解
肽键的专一性水解(化学法)
化学法: CNBr, H+, NH2OH, etc
消化道内几种蛋白酶的专一性
氨肽酶
（Phe.Tyr.Trp）
（Arg.Lys）
羧羧肽肽酶酶
（Phe. Trp）
（脂肪族）
胃蛋白酶
胰凝乳 弹性蛋白酶 胰蛋白酶 蛋白酶
酶法专一性水解
肽键的专一性水解(酶法)
氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate） 弱硷中 (400 C)
(硝基甲烷 400 C) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
Edman降解法1
Edman 降解法(I)
PITC试剂的反应, 50年发明Edman
degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950)
1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始
过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个 氨基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开 发仪器的方便. 1972年到德国,77年因脑瘤过世.
泛用酶：
胰蛋白酶（trypsin）；
Lys-X, Arg-X (X≠Pro)
胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;
X≠Pro)
嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；
木瓜蛋白酶（papain）；
X-Y (X=R, K,Q, H, Y)
Байду номын сангаас
胃蛋白酶（pepsin）；
+
DNFB（dinitrofiuorobenzene）
弱碱中
氨基酸
DNP-AA(黄色)
+ HF
Sanger试剂标记反应
Sanger试剂(FDNB)标记N末端
Sanger试剂标记测序
ABCDE ↓ FDNB
*ABCDE ↓ 部分水解
*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE ↓ 完全水解
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E ↓ FDNB
• 由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和 相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore & Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是 Edman没有和他们分享Nobel化学奖.
C端的测定方法
1、肼法 2、还原法 3、酶降解法
肼法C端测定
肼(hydrazine)法测定