生物化学王镜岩第三第五章蛋白质的共价结构课件文稿演示
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• 1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素 的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；
• 1981年，Berg（因DNA重组技术得奖） 在大肠杆菌中表达了人胰岛素.
一蛋级 白结质构一测 级定结策构略测定步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化
2、测定蛋白质分子中多肽链的数目
3、亚基分离
生物化学王镜岩第三第五章蛋白质的共价结构课件文稿演 示
蛋白质结构层次
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质 的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
断氨基酸的排列顺序。
化学法专一性水解
肽键的专一性水解(化学法)
化学法: CNBr, H+, NH2OH, etc
消化道内几种蛋白酶的专一性
氨肽酶
（Phe.Tyr.Trp）
（Arg.Lys）
羧羧肽百度文库酶酶
（Phe. Trp）
（脂肪族）
胃蛋白酶
胰凝乳 弹性蛋白酶 胰蛋白酶 蛋白酶
酶法专一性水解
肽键的专一性水解(酶法)
枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）
专一酶：
Lys-X; X-Lys; Arg-X; Glu-X; X-Asp; Pro-X;
Asn-X , 商品名：Endoproteinase Asn-C
• 由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和 相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore & Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是 Edman没有和他们分享Nobel化学奖.
C端的测定方法
1、肼法 2、还原法 3、酶降解法
肼法C端测定
肼(hydrazine)法测定
+
DNFB（dinitrofiuorobenzene）
弱碱中
氨基酸
DNP-AA(黄色)
+ HF
Sanger试剂标记反应
Sanger试剂(FDNB)标记N末端
Sanger试剂标记测序
ABCDE ↓ FDNB
*ABCDE ↓ 部分水解
*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE ↓ 完全水解
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E ↓ FDNB
氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate） 弱硷中 (400 C)
(硝基甲烷 400 C) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
Edman降解法1
Edman 降解法(I)
4、二硫键的拆分与保护
5、分析每一多肽链的氨基酸组成
6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
7 、多种方法的部分水解
8、测序
9、重叠
10 、二硫键位置的确定
N端的测定方法
1、Sanger（二硝基氟苯）法 2、丹磺酰氯法 3、Edman法 4、酶降解法
氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应
（sanger反应）
PITC试剂的反应, 50年发明Edman
degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950)
1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始
过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个 氨基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开 发仪器的方便. 1972年到德国,77年因脑瘤过世.
泛用酶：
胰蛋白酶（trypsin）；
Lys-X, Arg-X (X≠Pro)
胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;
X≠Pro)
嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；
木瓜蛋白酶（papain）；
X-Y (X=R, K,Q, H, Y)
胃蛋白酶（pepsin）；
历史上第一个被确定 氨基酸序列的蛋白质
胰岛素
insulin
胰岛素的历史 第一个生化药物
• 最小的蛋白质，由A链(21 AA)和B (30 AA)组成；动物胰腺ß 细胞分泌的一种激 素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；
• 1921年Banting & Best 从胰腺中抽提 出了有活性的胰岛素，1923年Banting & Macleod获Nobel医学奖；
DABITC ：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团
Edman降解法2
Edman 降解法(II)
无冕英雄Pehr Victor Edman
• 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19
• 1946-47年在美国留学时想到改进1930
年Abderhalden & Brockmann发明的
1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结 构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp3 sp2
sp2 sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：•限制绕肽键的自由旋转 •形成酰胺平面 •产生键的平均化 •肽键呈反式构型
蛋白质与无水肼加热
-------NH-CH-CONH-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
＋NH2NH2，100℃，5～10h
-- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
溶于有机溶剂而被除去
多种方法确定
酶解法末端测序
酶解法末端测序
利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端 (aminopeptidase) 或C端 (carboxypeptidase) 一个接一个游 离出来， 在不同时间取样进行分析，根 据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1234 5 结论：A B C D E
酰化反应
CH3 CH3 N
CH3 CH3 N
H2N—CH—COOH +
pH9.7
R
O=S=O 40℃ O=S=O
Cl
HN—CH—COOH
5-二甲氨基萘磺酰氯 （DNS-Cl）
R
DNS-氨基酸
取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
• 1981年，Berg（因DNA重组技术得奖） 在大肠杆菌中表达了人胰岛素.
一蛋级 白结质构一测 级定结策构略测定步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化
2、测定蛋白质分子中多肽链的数目
3、亚基分离
生物化学王镜岩第三第五章蛋白质的共价结构课件文稿演 示
蛋白质结构层次
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质 的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
断氨基酸的排列顺序。
化学法专一性水解
肽键的专一性水解(化学法)
化学法: CNBr, H+, NH2OH, etc
消化道内几种蛋白酶的专一性
氨肽酶
（Phe.Tyr.Trp）
（Arg.Lys）
羧羧肽百度文库酶酶
（Phe. Trp）
（脂肪族）
胃蛋白酶
胰凝乳 弹性蛋白酶 胰蛋白酶 蛋白酶
酶法专一性水解
肽键的专一性水解(酶法)
枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）
专一酶：
Lys-X; X-Lys; Arg-X; Glu-X; X-Asp; Pro-X;
Asn-X , 商品名：Endoproteinase Asn-C
• 由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和 相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore & Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是 Edman没有和他们分享Nobel化学奖.
C端的测定方法
1、肼法 2、还原法 3、酶降解法
肼法C端测定
肼(hydrazine)法测定
+
DNFB（dinitrofiuorobenzene）
弱碱中
氨基酸
DNP-AA(黄色)
+ HF
Sanger试剂标记反应
Sanger试剂(FDNB)标记N末端
Sanger试剂标记测序
ABCDE ↓ FDNB
*ABCDE ↓ 部分水解
*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE ↓ 完全水解
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E ↓ FDNB
氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate） 弱硷中 (400 C)
(硝基甲烷 400 C) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
Edman降解法1
Edman 降解法(I)
4、二硫键的拆分与保护
5、分析每一多肽链的氨基酸组成
6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
7 、多种方法的部分水解
8、测序
9、重叠
10 、二硫键位置的确定
N端的测定方法
1、Sanger（二硝基氟苯）法 2、丹磺酰氯法 3、Edman法 4、酶降解法
氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应
（sanger反应）
PITC试剂的反应, 50年发明Edman
degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950)
1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始
过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个 氨基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开 发仪器的方便. 1972年到德国,77年因脑瘤过世.
泛用酶：
胰蛋白酶（trypsin）；
Lys-X, Arg-X (X≠Pro)
胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;
X≠Pro)
嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；
木瓜蛋白酶（papain）；
X-Y (X=R, K,Q, H, Y)
胃蛋白酶（pepsin）；
历史上第一个被确定 氨基酸序列的蛋白质
胰岛素
insulin
胰岛素的历史 第一个生化药物
• 最小的蛋白质，由A链(21 AA)和B (30 AA)组成；动物胰腺ß 细胞分泌的一种激 素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；
• 1921年Banting & Best 从胰腺中抽提 出了有活性的胰岛素，1923年Banting & Macleod获Nobel医学奖；
DABITC ：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团
Edman降解法2
Edman 降解法(II)
无冕英雄Pehr Victor Edman
• 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19
• 1946-47年在美国留学时想到改进1930
年Abderhalden & Brockmann发明的
1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结 构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp3 sp2
sp2 sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：•限制绕肽键的自由旋转 •形成酰胺平面 •产生键的平均化 •肽键呈反式构型
蛋白质与无水肼加热
-------NH-CH-CONH-CH-COOH
|
|
Rx
Ry
＋NH2NH2，100℃，5～10h
-- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH
|
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Rx
Ry
溶于有机溶剂而被除去
多种方法确定
酶解法末端测序
酶解法末端测序
利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端 (aminopeptidase) 或C端 (carboxypeptidase) 一个接一个游 离出来， 在不同时间取样进行分析，根 据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1234 5 结论：A B C D E
酰化反应
CH3 CH3 N
CH3 CH3 N
H2N—CH—COOH +
pH9.7
R
O=S=O 40℃ O=S=O
Cl
HN—CH—COOH
5-二甲氨基萘磺酰氯 （DNS-Cl）
R
DNS-氨基酸
取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高