6种区分乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的分子生物学方法比较
乳酸菌分类鉴定方法的研究进展
收稿日期 : 2008211207
基金项目 :国家“973”项目 (2004CB719604—4) ;农业部核技术农业应用专项资助课题 (200803034)
作者简介 :庞会利 (19822) ,女 ,河南洛阳人 ,博士研究生 ,主要从事乳酸菌的分类鉴定及应用研究工作 ;秦广雍 3 ,通讯作者 。
乳酸菌是利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性 用 AP I50CHL 体系分析了 317株可能为乳酸菌的菌株 , 只
细菌的通称 。乳酸菌是广义范畴的概念 ,是非正式 、非规 有 38%分离株被鉴定到种的水平 。W IJTZES T等 [4 ]利用
范的细菌分类学名称 [1 ] 。当前 ,乳酸菌产品以其独特的生 2种碳源发酵测试体系也未能将 14 种乳酸菌分离株鉴定
通过设计特异性的引物在一定条件下通过聚合酶链 式反应选择性的特异扩增特定的靶 DNA 片段 ,理论上讲 可以在任何分类水平上对微生物菌株进行区别和鉴定 。 虽然特异性扩增靶 DNA 片段可以快速准确地在种和亚种 甚至菌株水平鉴定乳酸菌 ,但是需要较复杂的引物设计策 略 ,并鉴定引物的有效性后才能获得一系列有效的引物 。 因此这种方法只有在对检测和鉴定的菌株完全了解的情 况下 ,才最为有效和实用 。 21212 基因组短重复序列标记
这类标记主要是指基因组中的分散保守重复 DNA 元 件 ( Interspersed Conserved Repetitive DNA Elements) ,依据 它们在整个细菌基因组 DNA 中存在多个拷贝进行引物设 计 。现在已有 3类重复性元件得到了确认 ,即重复基因外 回 文 序 列 ( Repetitive Extragenic Palindrom ic Sequences,
专论与综述
乳酸菌的分类鉴定综述
3.扩增片段长度多态技术（AFLP） 优缺点：重复性好，分辨率高，在亚种和菌株水 平上对菌株进行鉴定；对操作和设备要求高； 4.基因组简单重复序列PCR标记（Re-PCR） 优缺点：重复性好，可在亚种和菌株水平上对菌 株进行快速而准确的分类和鉴定；
5.变性梯度凝胶电泳/温度梯度电泳（DGGE/TGGE） 优缺点：DNA用量小，重复性好，但通常只能检 测微生物群落中数量大于一定值得优势种群。
分离株（球菌） ↙ ↘
链状
↙ 同型发酵 ↘ 异型发酵
四联
↙ 过氧化氢酶 ↘ 过氧化氢酶
↓
Streptococuus Enterococcus Lactococcus Streptococcus
↓
Leuconostoc
（+）
（-）
↓
Pediococcus
↓
非乳酸菌
以明串珠菌属为例，介绍种的鉴定
异性发酵乳酸链状球菌 Leuconostoc
↙ 发酵蔗糖产酸（+） ↓ 发酵蔗糖产葡聚糖 ↙ ↘ 发酵阿拉伯糖 发酵阿拉伯糖 ↙ ↘ ↙ ↘ 群3 群4 群5 发酵海藻糖 ↙ ↘ （+ ） （- ） 群6 群7
↘ 发酵蔗糖产酸(-) ↓ pH4.8生长试验；发酵果糖 ↙ ↘ （+ ） （- ） ↓ ↓ 群1 群2
群1：Leuc.oenos 群2：Leuc. mesenteroides subsp.cremoris 群3： Leuc. mesenteroides subsp.mesenteroides 群4： Leuc. mesenteroides subsp.dextranicum 群5： Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subsp.mesenteroides 群6： Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subsp.cremoris 群7：Leuc. lactis
利用16S rDNA部分序列聚类分析鉴定乳球菌
表１ １１株乳酸菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ部分序列相似百分比（ ％）
２
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
１００ ９９．１６ ９９．３２ ８５．０ ８６．８ ９５．６ ８５．８ ７７．２ ８２．３ ７８．４
１００ ９９．４９ ８４．７ ８６．５ ９５．６ ８５．４ ７６．９ ８２．０ ７８．１
１００ ８４．８ ８６．５ ９５．６ ８５．５ ７７．０ ８２．１ ７８．２
０引言
随着分子生物学技术的不断发展， ＰＣＲ 技术的日 益完善， 单独利用传统的表型分类和生理生化鉴定已 经不能够准确的表明细菌间的遗传关系， 所以通过 对细菌基因类似度的分析来判断细菌的种属， 就越 来 越 受 到 人 们 的 重 视 。 早 在 上 世 纪６０年 代 末 ， Ｗｏｅｓｅ 就开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类， 他通过 比 较 各 类 生 物 细 胞 的 核 糖 体Ｒ Ｎ Ａ（ｒＲ Ｎ Ａ）特 征 序 列 ， 认 为１６Ｓ ｒＲ Ｎ Ａ及 其 类 似 的ｒＲ Ｎ Ａ基 因 序 列 作 为 生 物 系统发育指标最为合适［１］。细菌的１６Ｓ ｒＲ Ｎ Ａ基因具有 高度的保守性，不同科、属、种间细菌１６Ｓ ｒＲ Ｎ Ａ基因的 同 源 性 可 达９７％以 上［２］。
１ 材料与方法
１．１ 材料 菌株由本实验室自牛乳中分离得到的Ｌ．ｓｐ．Ｆ００１。 ＰＣＲ 引物： 根据乳 酸 球 菌 的１６Ｓ ｒＲ Ｎ Ａ基 因 序 列
保守区域， 利用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５软件设计一对 引 物 ，
７ Ｖｏｌ．３３， Ｎｏ．８ ２００５（ｔｏｔａｌ １７７）
研究报告 Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｐｅｒｓ
菌株 １．Ｌ．ｓｐ．Ｆ００１ ２．ＮＣＤＯ ６０７ ３．ＮＣＤＯ ６０４ ４．ＮＣＤＯ ２１８１Ｔ ５．ＮＣＤＯ １８６９ ６．ＮＣＤＯ ６１７ ７．ＮＣＤＯ ２１５６ ８．ＮＣＦＢ ２７７８ ９．ＡＴＣＣ ４９３６７ １０．ＡＴＣＣ ＢＡＡ!２８９ １１．ＡＴＣＣ３３３１５
MLST在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用
2021年5月第42卷第10期食品研究与开发专题论述~=~218DOI : 10.12161/j.issn.l005-6521.2021.10.034MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用赵尘培,姜琳琳* ，张建龙,陈国忠，于馨，朱洪伟,张兴晓*基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2020QC227)；烟台市重点研发计划(2020YT06000171)作者简介:赵尘培(1996-),女(汉)，硕士研究生,研究方向:乳酸菌筛选及鉴定。
*通信作者凄琳琳(1986-),女(汉)，讲师，博士，研究方向:益生菌功能研究;张兴晓(1973-)，男(汉)，教授，博士，研究方向:微生物 与免疫学研究。
(鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025)摘要:乳酸菌是健康人类及动物肠道中重要的益生菌群，在维持肠道微生态平衡方面发挥重要作用。
由于乳酸菌的益生功能具有菌株特异性，因此•准确、灵敏的分子鉴定技术对乳酸菌功能的研究十分重要。
多位点序列分型(multilocus sequence typing , MLST )是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法,能够准确地从亚种水平进行菌株分类，在鉴定物种的遗传多样性方面发挥重要作用。
该文概述MLST 技术的原理、方法、优缺点及其在乳酸菌分类鉴定及遗 传多样性方面的研究现状,为乳酸菌株的鉴定提供理论依据。
关键词：乳酸菌；多位点序列分型;鉴定;遗传多样性Application of MLST in Identification and Diversity Analysis of Lactic Acid BacteriaZHAO Chen-pei, JIANG Lin-lin *, ZHANG Jian-long, CHEN Guo-zhong, YU Xin, ZHU Hong-wei,ZHANG Xing-xiao *(School of Life Sciences , Ludong University , Yantai 264025, Shandong , China )Abstract : Lactic acid bacteria is a type of important probiotic bacteria found in the intestines of healthy humansand animals. It plays a crucial role in maintaining the dynamic equilibrium of the intestinal microecology. Because their functions are strain -specific , it is essential to develop a rapid and reliable molecular markertechnique for the identification of different species of lactic acid bacteria. Multilocus sequence typing (MLST) isa method employed for bacterial gene typing and is based on DNA sequencing. Moreover, MLST can simultaneously identify strains at the subspecies level and has been used for the analysis of the genetic diversityof lactic acid bacteria. The aim of the present study was to describe the basic principle , methods , advantagesand disadvantages of MLST, while highlighting the suitability of MLST for the identification and classification oflactic acid bacteria.Key words : lactic acid bacteria; multilocus sequence typing; identification; genetic diversity引文格式：赵尘培，姜琳琳，张建龙，等.MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用[J].食品研究与开发，2021, 42(10):218-224.ZHAO Chenpei , JIANG Linlin , ZHANG Jianlong , et al. Application of MLST in Identification and Diversity Analysis ofLactic Acid Bacteria[J]. Food Research and Development , 2021, 42( 10) ： 218—224.乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能够发酵 糖类物质最终产物为乳酸的革兰氏阳性细菌。
乳酸细菌分类鉴定及实验方法
乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。
分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。
1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。
一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。
可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。
1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。
1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。
1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。
常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。
2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。
首先，从培养的细菌中提取DNA。
然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。
比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。
2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。
通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。
2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。
食品中乳酸菌的种类鉴定与筛选
食品中乳酸菌的种类鉴定与筛选导语：乳酸菌作为一类益生菌，对人体健康有着重要作用。
在食品行业中，乳酸菌也被广泛应用于酸奶、乳酸发酵食品等产品的制作中。
但是，不同种类的乳酸菌对人体的功效和食品质量的影响也存在差异。
因此，食品中乳酸菌的种类鉴定与筛选成为了食品工业中一项重要的研究内容。
一、乳酸菌的基本特征乳酸菌是一类革兰氏阳性、非芽孢形成的厌氧杆菌。
它具有利用碳源的多样性，能够在较宽的温度和pH范围内生长，敏感于多种抗生素，但对酸和胆盐具有很高的耐受性。
乳酸菌的独特特征在于其产酸能力和产酶能力，这对于发酵乳制品中的酸度调节、食品品质和保质期具有重要影响。
二、食品中乳酸菌的种类食品中常见的乳酸菌主要包括嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、乳酸杆菌等。
这些乳酸菌在食品发酵过程中发挥着重要作用。
例如，嗜酸乳杆菌能够将乳糖转化为乳酸，起到酸度调节和抑制有害菌生长的作用；屎肠球菌则具有较强的抗菌活性，能够抑制肠道有害菌的生长；乳酸杆菌则被广泛应用于酸奶等乳制品的制作中，具有促进消化、增强免疫力等功效。
三、食品中乳酸菌的种类鉴定方法1.传统方法传统上，食品中乳酸菌的种类鉴定主要依靠生理和生化特性，包括菌株的外形特征、生长条件、产酸能力、抗菌活性等。
然而，这种方法存在着一定的主观性和局限性，无法准确鉴定不同种类的乳酸菌。
2.分子生物学方法近年来，随着分子生物学技术的发展，食品中乳酸菌的种类鉴定方法得到了极大的改进。
例如，通过PCR扩增和序列分析特定的基因片段（如16S rRNA）可以确定乳酸菌的亲缘关系和种类。
这种方法准确度高、重现性好，成为当前乳酸菌鉴定的主要手段之一。
四、食品中乳酸菌的筛选与应用1.筛选方法食品中乳酸菌的筛选一般基于其酸度产生和抗菌活性。
通过培养基和条件的优化，可以获得具有较高产酸能力和抗菌活性的乳酸菌菌株。
同时，利用基因工程技术也可以对乳酸菌进行基因编辑，增强其产酸能力和抗菌活性。
2.应用领域食品中乳酸菌的筛选和应用广泛存在于乳制品、调味品、肉制品等食品行业中。
乳酸菌菌种的分别挑选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》
《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》一、引言乳酸细菌（Lactobacillus）是一类常见的益生菌，它们能帮助消化系统聪明，同时也可以通过促进有益的肠道微生物的生长来改善肠道健康。
因此，乳酸细菌的分类和鉴定对于研究乳酸细菌的功能和应用具有重要意义。
本文将首先介绍乳酸细菌的分类和鉴定，然后介绍乳酸细菌的实验方法。
二、乳酸细菌的分类和鉴定1. 乳酸细菌的分类乳酸细菌是属于细菌科（Bacteroidetes）的一类细菌。
它们可以分为三大类：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸乳球菌（Streptococcus）和乳酸变形杆菌（Bifidobacterium）。
每一类乳酸菌都有不同的特征，如形态、生长习性和生理功能。
2. 乳酸细菌的鉴定乳酸细菌的鉴定可以分成宏观鉴定和微观鉴定两种。
宏观鉴定可以从外观上分辨不同种类的乳酸细菌，其中包括形态、大小、色泽和膜结构等。
微观鉴定则是从细节上来识别乳酸细菌的特征，包括菌体的形态、菌落的形状、菌落的大小和染色等。
三、乳酸细菌的实验方法1. 样品采集乳酸细菌的实验方法首先要从样品的采集开始。
乳酸细菌的样品可以从食品、生物体表面、自然环境或肠道等环境中获取。
采集的样品应当及时保存，以防乳酸细菌的生长和繁殖。
2. 培养基制备乳酸细菌的培养基是乳酸细菌实验的基础，它可以保证乳酸细菌的生长和繁殖。
常用的乳酸细菌培养基有MRS培养基、MRS-glucose培养基和MRS-sucrose培养基等。
这些培养基中的成分可以满足乳酸细菌的需求，从而促进乳酸细菌的繁殖和活力。
3. 培养和筛选采集到的样品和制备好的培养基可以混合在一起，然后置于培养室中，根据规定的条件进行培养。
一旦乳酸细菌在培养基中获得了生长和繁殖的机会，就可以开始筛选。
筛选的过程可以通过诸如生长观察、生理鉴定和生化鉴定等方法来进行。
4. 分子鉴定最后，分子鉴定是乳酸细菌分类鉴定的最关键步骤。
分子鉴定可以通过PCR技术、限制性片段长度多态性分析（RFLP）和16S rRNA基因测序等方法准确地识别乳酸细菌的种类。
不同来源乳酸菌的分离与鉴定
不同来源乳酸菌的分离与鉴定于晨龙;张七斤;陈光明;杨晓宇;吕天星;苏日娜【摘要】试验从传统乳制品、仔猪粪便及鸡肠道分离到6株乳酸菌,分别命名为LS、LT、LJ1、LJ2、LZ1、LZ2.通过细菌形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析,对6株分离菌进行鉴定及研究.结果显示LS、LT、LJ1、LZ2菌株为短乳杆菌;LJ2菌株为粪肠球菌;LZ1菌株为嗜酸乳杆菌.这6株菌株对李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌效果.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)002【总页数】5页(P208-212)【关键词】乳酸菌;分离鉴定;16S rDNA【作者】于晨龙;张七斤;陈光明;杨晓宇;吕天星;苏日娜【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】S852.61目前由细菌引起的疾病一般都通过抗生素来治疗，但抗生素的滥用使得大部分细菌对其产生了不同程度的抗性，给疾病治疗及人类健康带来隐患。
寻找有益的抗生素替代品已成为亟待解决的问题，而以菌治菌的方法正日益被人们接受。
实践证明益生素是一种可直接饲喂动物并能促进动物肠道菌群平衡的微生态制剂，可部分替换抗生素作为饲料添加剂，有望解决抗生素残留问题及动物耐药问题，而在肠道众多菌种中，最具代表性的有益菌当属乳酸菌（罗慧等，2008）。
青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究
青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究何轶群;雷赵民;吴润;万学瑞;刁小龙;艾文娜【摘要】为筛选优良的青贮饲料添加剂,采用平板分离法从青贮饲料中分离乳酸菌,通过细菌形态学、生理生化特征鉴定和16S rRNA基因序列分析相结合的方法对分离出的细菌进行鉴定.通过产酸性试验和抑菌试验对分离出来的12株乳酸菌进行筛选,并对筛选出的6株乳酸菌进行生物学特性比较.结果显示,5株为戊糖片球菌,4株为植物乳杆菌,1株为发酵乳杆菌,1株为肠系膜明串珠菌肠膜亚种,1株为屎肠球菌；菌株B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1、B5-2的产酸能力和抑菌效果较好；菌株B1-7和B5-2生长最快,8h后进入稳定期,其余菌株14 h后进入稳定期；菌株B1-7在培养温度高于45℃,培养基pH＞10和含盐量＞0.08g/mL时不再生长,其余菌株均具有良好的抗逆性具备青贮潜力,可作为秸秆青贮的生物添加剂做进一步研究.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】7页(P177-183)【关键词】乳酸菌;16S rRNA;筛选;生物学特性【作者】何轶群;雷赵民;吴润;万学瑞;刁小龙;艾文娜【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070【正文语种】中文近几年来，我国畜牧业发展迅速，动物养殖规模日益扩大，但由于我国耕地面积减少，用于生产饲料的原料严重不足，加之对秸秆类植物的利用率相对较低，养殖业和饲料生产的矛盾日益突出，这些问题严重制约着我国畜牧业的发展。
因此，发展饲料工业以及加大对秸秆类植物饲料化的转化是目前我国畜牧业迫切需要解决的问题。
目前对秸秆类粗饲料的加工处理主要有物理加工法、化学加工法和微生物发酵法，其中以微生物发酵法中的青贮法应用最为广泛。
乳酸菌耐酸机理_陈霞
ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ中国乳品工业０引言乳酸菌是人体肠道中正常菌群之一，与人体健康关系密切。
乳酸菌家族中的嗜酸乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）是宿主（人和动物）肠道、口腔和阴道正常菌群，当达到一定数量时，能够调节宿主体内微生物菌群的平衡，可以改善宿主体内系统环境，对宿主健康具有促进作用［１］。
能否在人体肠道中的低ｐＨ值，高胆汁酸中存活成为这些有益菌群面对的首要挑战和进一步开发应用的限制因素。
同时，由于人们健康意识日益增加，微生态制剂市场变得活跃起来。
微生态制剂主要是通过其含有的活菌的积极生命活动来调节微生态的平衡，因此活菌含量的高低是产品质量的关键指标之一。
作为微生态制剂的主要成员乳酸菌，由于大多是厌氧或兼性厌氧微生物，并在其本身的生命活动过程中又会产生一些酸性物质，如乳酸和乙酸等，使之难以保存，货架期缩短。
因此，保持一定量的活菌数变得十分重要。
另外，在乳酸菌成长中产生乳酸，引起低ｐＨ值，作为人体胃肠道有益菌群，乳酸菌同样面临低ｐＨ值的考验。
如何在低ｐＨ值条件下存活，便显得尤为重要。
本文讨论了乳酸菌可能的耐酸机理，并对其进行了初步分析。
１质子泵该途径又称为质子原动力（ＰｒｏｔｏｎＭｏｔｉｃｅＦｏｒｃｅ，ＰＭＦ）透性酶转移系统，该系统可在ｐＨ值为５．５以下、糖供应过剩时发挥作用，而质子原动力的产生与菌体内Ｈ＋－ＡＴＰ酶的活性相关。
如图１所示，该系统通过转运和质子消耗去羧基反应生成ＡＴＰ。
如：通过谷氨酸降解将谷氨酸离子（Ｇｌｕ２－）移入细胞，将γ－氨基丁酸离子（ＧＡＢＡ－）移出细胞；通过苹果酸降解将苹果酸离子（Ｍａｌ２－）移入细胞，将乳酸盐离子（Ｌａｃ－）移出细胞；通过草酰乙酸降解将柠檬酸离子（Ｈｃｉｔ２－）移入细胞，将乳酸盐离子（Ｌａｃ－）移出细胞。
在以上转运过程中产生电压。
通过以上脱羧收稿日期：２００７－０７－３１基金项目：国家自然基金项目（３０５６００９７）；国家高技术研究发展计划（２００６ＡＡ１０Ｚ３４５）。
食品生物技术团队-海南大学
一、团队名称食品生物技术团队二、团队简介本团队现有成员6人，其中教授4人，讲师2人，具有博士学位的6人，博士生导师2人，硕士导师3人，海南省―515人才‖工程第一层次1人。
现有在读博士后1人，在读博士研究生2人，硕士研究生20多人。
团队主要围绕现代生物技术在特色资源开发中的应用开展研究，在热带农产品发酵与高值化利用、椰纤果发酵生产的关键技术及产业化应用、热带特色微生物资源开发利用方面形成了稳定的研究方向。
近五年来，团队承担国家及省部级科研课题10余项，其中，国家科技支撑计划项目1项，国家自然科学基金项目3项；发表论文60多篇，其中SCI/EI收录17篇；出版专著3部；授权专利27项；获得省部级奖励2项。
三、主要研究方向1、热带农产品发酵与高值化利用2、椰纤果发酵生产的关键技术及产业化应用3、热带特色微生物资源开发利用四、团队负责人及成员（含照片）李从发博士、教授、博士生导师，团队负责人。
研究方向：热带农产品发酵关键技术；热带特色微生物资源开发利用；椰纤果发酵技术的产业化应用。
刘四新博士、教授、博士生导师，团队负责人。
研究方向：椰纤果发酵生产关键技术研究；热带特色微生物资源基础研究；热带农产品高值化利用。
杨劲松博士、教授、硕士生导师。
研究方向：益生菌、食品发酵与酿造、农产品副产物的饲料化研究。
李武博士、讲师、硕士生导师。
研究方向：热带特色资源应用、生物活性成分作用研究。
胡晓苹博士、讲师。
研究方向：热带特色资源应用、农产品无损检测技术、肉类及水产品的研究与开发。
张家超博士、校聘教授。
研究方向：微生物多样性及功能基因组学、乳酸菌资源开发利用、益生菌与肠道菌群互作研究。
五、主要项目四、获奖/鉴定成果五、代表性论文六、授权专利七、其他1、主编专著《细菌纤维素》，中国农业大学出版社，2007.062、主编专著《热带农产品加工学》，海南出版社，2007.063、主编教材《酿酒工艺学》，海南出版社，2011.01。
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的 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris ATCC19257 作 为 试 验参考菌株。 1. 1. 2 试验主要试剂和仪器：伯乐公司变性梯度凝 胶电泳仪（ Dcode system） ，TGL-16B 型台式高速离心 机，ND-1000 型 微 量 紫 外 分 光 光 度 计，ML-30L 型 全 自 动 高 压 蒸 汽 灭 菌 器，HHSI-NI 恒 温 水 浴 槽， CDS8000 型 UPV 凝 胶 成 像 分 析 系 统，DHP-9272 型 电热恒温培 养 箱，HZS-H 水 浴 振 荡 器，PL303 /01 电 子天平，TGL-16G-A 型 高 速 冷 冻 离 心 机，DG82 型 干 燥箱，PTC-200 型 梯 度 基 因 扩 增 仪，电 泳 仪，本 试 验 所用引物均由上海 桑 尼 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成，具 体引物序列见表 1。
Sequence （5′→3′ ） CTACGGCTACCTTGTTACGA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GAAGTCGTAACAAGG CAAGGCATCCACCGT TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGG CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG GTGGTGGTGGTGGTG GAGGGTGGCGGTTCT
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 50（12） ：1670 － 1676； 4 December 2010 ISSN 0001 － 6209； CN 11 － 1995 / Q http： / / journals. im. ac. cn / actamicrocn
Research Paper 研究报告
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 试验参考菌株：本试验以购买自中国普通微 生物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 （ CGMCC ） 的 Lactococcus lactis subsp. lactis AS 1. 18 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris AS 1. 9，以及 美 国 标 准 菌 种 收 藏 所 （ ATCC ）
基金项目：国家自然基金项目 （30660135 ，30800861 ） ；国家“863 计划”（2006 AA10Z345 ，2007 AA10Z353 ） * 通信作者。Tel： + 86 -471 -4319940 ；Fax： + 86 -471 -4300122 ；E-mail：hepingdd@ vip. sina. com 作者简介：张家超（1986 － ） ，男，内蒙古包头人，博士研究生，研究方向为乳品生物技术。E-mail：zhjch321123 @ sohu. com 收稿日期：2010 -06-03；修回日期：2010 -07-04
1. 5 变性 梯 度 凝 胶 电 泳 （ Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）
选用 引 物 V3F 和 V3R［18］，对 参 考 菌 株 的 16S rRNA 基因的 V3 区进行扩增，并将 300 ng 扩增产物 于 8% 的聚丙 烯 酰 胺 胶 上 进 行 分 离，变 性 剂 梯 度 范 围为 32% － 57% （100% 的变性剂包含 7 mol / L 尿 素和 40% 去离子甲酰胺） 。电泳在恒温 60℃ 下 1 × TAE 缓冲液中进 行，电 压 200 V，时 间 4 h。 电 泳 结 束后进行银染并对电泳图谱进行分析。 1. 6 随 机 扩 增 多 态 性 分 析 （ Random Amplified poly-morphism DNA，RAPD）
早在 1919 年，Jensen 等人便依靠表型特征对这 两个亚种 进 行 了 区 分，可 是 区 分 效 果 并 不 理 想［4］。 近 些 年 来 ，随 着 科 学 技 术 的 不 断 发 展 ，越 来 越 多 的 科 研工作者以核酸碱基排 列 顺 序 不 同 为 契 机，从 DNA 结构层面，应用各种 分 子 生 物 学 技 术 对 这 两 个 亚 种 进 行 了 区 分，比 如 16S rRNA 基 因 序 列 分 析 技 术［5 － 7］，16 S-23 S rRNA 间区序列多态性分析［8 － 9］，变 性梯度凝胶电泳技术 （ DGGE ）［10 － 11］，随 机 扩 增 多 态 性分析技术（ RAPD）［12 － 13］，限 制 性 酶 切 片 段 多 态 性
使用实验 室 自 主 设 计 的 引 物 A27F 和 A1495R 对参考菌 株 的 16S rRNA 片 段 进 行 扩 增，菌 体 扩 增 条件如下：94℃ 预 变 性 5 min；30 个 循 环：94℃ 变 性 1 min，58℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 2 min；72℃ 末端延 伸 10 min。然后将扩增成功的产物寄往上海桑尼生 物科技有限 公 司 测 序，将 测 序 结 果 上 传 到 NCBI 并 BLAST 比对，最 后 应 用 MEGA4. 0 软 件 做 出 系 统 发 育树完成同源性分析。 1. 4 16S-23S rRNA 间 区 序 列 多 态 性 分 析 （ 16S23S rRNA ISRs Polymorphism）
Reference This work This work ［9 ］ ［9 ］ ［21 ］ ［21 ］
［18 ］
［18 ］ ［20 ］ ［19 ］
1. 2 菌株基因组 DNA 的提取 采 用 改 良 的 CTAB-冻 融 方 法 提 取 菌 株 基 因 组
DNA［17 ］，即 用 液 氮 反 复 冻 融 后 进 行 提 取 。 1. 3 16S rRNA 基因序列分析
Method 16S rRNA Gene analysis 16 S-23 S rRNA ISRs Polymorphism RFLP
DGGE
Rep-PCR RAPD
Primer A27 F A1495 R LI G1 Y1 Y2
V3 F
V3 R GTG5 M13
表 1 试验所用引物 Table 1 Primers used in this study
张家超等： 6 种区分乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的分子生物学……. / 微生物学报（2010）50（12）
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分析（ RFLP） 技术［14 － 15］以及重复基因外回文 序 列 分 析 技 术 （ rep-PCR ）［16］。 本 文 以 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 的 4 株参考菌株为研究 对 象，应 用 上 述 6 种 分 子 生 物 学 技术对这两个亚种 进 行 了 区 分，并 对 这 6 种 方 法 的 区分效果做出了比较和评价。
合成引物 L1 和 G1［9］，在 94℃ 预 变 性 5 min；25 个循环：94℃ 变 性 1 min，55℃ 退 火 2 min，72℃ 延 伸 3 min；72℃ 末端延伸 10 min 的条件下扩增 4 株参考 菌株的 16S-23S rRNA 间区序列，将扩增产物用 2% 的琼脂糖凝胶在电 压 60 V 的 条 件 下 电 泳 3 h，而 后 将电泳凝胶用溴化乙锭（ EB） 染色并分析电泳结果。
在乳制品 的 生 产 发 酵 过 程 中，Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 发挥
了重要作用，尤其 是 在 干 酪 的 生 产 过 程 中。 通 常 情 况下，Lactococcus lactis subsp. cremoris 被用来生产硬 质干酪 （ 特 别 是 Cheddar 干 酪） ，而 Lactococcus lactis subsp. lactis 则 广 泛 应 用 于 软 质 干 酪 的 生 产［3］。 所 以 ，从 工 业 生 产 和 科 学 研 究 的 角 度 ，对 这 两 个 亚 种乳脂亚种的分子生 物学方法比较
张 家 超 ，王 芳 ，徐 海 燕 ，于 洁 ，刘 文 俊 ，包 秋 华 ，孙 志 宏 ，张 和 平 *
（ 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）
摘要：【目的】比较并评价 6 种分子生物学技 术 对 乳 酸 乳 球 菌 乳 酸 亚 种 （ Lactococcus lactis subsp. lactis） 和 乳 酸乳球菌乳脂亚种（ Lactococcus lactis subsp. cremoris） 的区分效果。【方法 】采用 16S rRNA 基因序列分析技 术，16S-23S rRNA 间区序列多 态 性 分 析 技 术，变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 技 术 （ DGGE ） ，随 机 扩 增 多 态 性 分 析 技 术 （ RAPD） ，重复基 因 外 回 文 序 列 分 析 技 术 （ rep-PCR ） 和 限 制 性 酶 切 片 段 多 态 性 分 析 技 术 （ RFLP ） 对 4 株 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 参考菌株进行了区分，并对这 6 种方法的区 分效果进行了比较评价。【结果】16S rRNA 基 因 序 列 分 析 技 术，16S-23S rRNA 间 区 序 列 多 态 性 分 析 技 术 无 法区分 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris，而其余 4 种技术可以实现区分。【结 论】变性梯度凝胶电泳（ DGGE） ，随机扩 增 多 态 性 分 析 技 术 （ RAPD） 耗 时 短，操 作 简 单，试 验 结 果 准 确 稳 定， 更适合 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 的快速准确区分。 关键词： 乳酸乳球菌； 分类鉴定； 分子生物学方法 中图分类号： Q93-3 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 （2010） 12-1670-07