抗体纯化常见问题回答
抗体纯化技术
25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。通常情况下，在24%硫酸铵饱 和度以下很少有蛋白质沉淀下来，而在55%硫酸铵饱和度时会有多数蛋白质沉淀，当硫酸铵饱 和度达到80%以上时，几乎所有的蛋白质都会沉淀下来。
硫酸铵溶解度高，溶于水时产生的热量少，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性。
亲和层析法
概念
利用蛋白质分子对其配体分子的特异识别和可逆结合的特性建立起来的一种有效的分离纯化方 法。
蛋白A/G亲和层析
Protein A/G是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合 的结构域，可结合多种免疫球蛋白的Fc部分，特异性结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化 敏感，会随pH的降低而急剧下降，因此可用于纯化不同来源的抗体及抗体亚型。该法具有极 高的选择性，通常一步层析就可达到超过95%的纯度。
其他沉淀方法
有机溶剂沉淀
概念：利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀.
原理：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 特点：沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂容易除去；易影响蛋白质的活性，故应在低温下操
作并注意搅拌。
聚乙二醇沉淀
概念：在一定盐浓度条件下向溶液加入亲水性极强的聚乙二醇(PEG)引起大分子溶质非特异性 凝聚沉淀的方法。
其他沉淀方法-续
辛酸-硫酸铵沉淀
原理：在酸性条件下（pH4.8）向血清中加入一定量的短链脂肪酸，使血浆蛋白中的清蛋白、 α 及β免疫球蛋白成分沉淀，取以IgG成分为主的上清液再经硫酸铵沉淀得到进一步纯化。
等电点沉淀
概念：利用蛋白质在等电点(pI)时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离 的方法。
抗体纯化常见问题
抗体纯化常见问题1、Protein A 和 Protein G填料有什么区别？答：ProteinA载量更高，洗脱条件相对温和；Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG。
2、抗体片段的纯化填料，如何选择？答：不同配基结合特征如下：· rProtein A 和 PrismA 配基可以结合抗体 Fc 区域以及重链可变区VH3。
· Protein G 配基除了与 IgG 的 Fc 区域特异性结合，还可以和某些抗体的 Fab 段结合。
· Capto L 配基对于人 kappa 亚单位可变区 I, II 和 IV 亚型以及大鼠的 K1 轻链有很强的亲合力，结合位点在 Kappa 轻链的可变区。
与不同种属和亚型的亲和力差异，请查询附件。
· KappaSelect 层析介质与 KappaFab ( 恒定区 ) 结合，以及LambdaFabSelect 层析介质与 LambdaFab( 恒定区 ) 结合。
3、小鼠腹水中抗体样品纯化，如何进行预处理，避免堵柱子？答：腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。
方法一是在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去；方法二 PVP 能产生一个 pH 值依赖的沉淀效应， PVP 在 pH＝ 7.0 时能够沉淀 b- 脂蛋白和球蛋白。
另外也可以使用硫酸铵沉淀法。
4、Protein A Sepharose和Protein G Sepharose可以用来做Co-IP嘛？答：可以。
Cytiva也提供ProteinA或者ProteinG的磁珠产品。
5、如何进行人血清中 IgE 样品纯化？答：(1)可以尝试Capto L，注意去除血清中同样会结合Capto L 且含量更大的 IgG 污染。
(2)通过制备抗 IgE 抗体用于纯化。
(3)也可以考虑通过离子交换或者疏水层析等手段进行纯化。
抗体纯化中的常见问题有哪些？
抗体纯化中的常见问题有哪些？抗体纯化中的常见问题有哪些？1、优质的抗体包含的条件：抗体的纯度⼤于95%（这⾥的纯度是指有效抗体的含量⽽不是单纯的电泳纯度）；抗体的活性（效价⾼）；抗体的稳定性（4保存10天⽆沉淀，-20保存3年以上效价⽆明显变化，反复冻融10次⽆沉淀）。
2、ProteinA/G纯化的不利因素：Protein A是⼀种⾦黄⾊葡萄球菌（Protein G是⼀种链球菌株）细胞壁蛋⽩质，能特异性地与⼈和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合（有时结合少许IgM），故此可以分离出IgG抗体。
但是Protein A/G却⽆法区分特异性IgG的Fc段还是⾮特异性IgG的Fc段，故此Protein A/G纯化出的是总的IgG蛋⽩。
腹⽔中含有⽩蛋⽩、γ球蛋⽩、巨球蛋⽩、转铁蛋⽩、细胞及其残⽚、脂肪、⼩⿏的各种杂蛋⽩（如游离的⿏IgG、IgM），⽽我们真正需要的抗体只占很少⼀部分（⼤约占15%左右）；⽽抗⾎清中的有效抗体也只占总IgG的30%左右，其余都是⽆关的IgG或⽆⽤的抗体；所以Protein A/G纯化的抗体看似“很纯”（电泳图），其实真正有效的“⽬的抗体”单抗只占⽐75%左右，（兔）多抗只占⽐30%左右。
3、利⽤抗原亲和纯化抗体的优缺点。
亲和纯化是抗体抗原的结合，理论上应该是纯度最⾼特异性最好的纯化⽅法，但是通常由于抗原的提取难度⾮常困难，所以获得⾼纯度的抗原并不是⼀件⾮常简单的事情。
当我们不能获得⾼纯度的抗原时亲和层析做出来的抗体也就不会那么纯了；另外亲和纯化时抗原抗体的结合⽐较牢固，要想分离抗原抗体就需要⼤幅降低洗脱液的pH值，抗体（蛋⽩）在这么低地pH下很容易变形失活，损伤是⽆法避免的。
故此种情况下纯化出的抗体稳定性差，4保存1天就会出现少许沉淀，反复冻融很容易产⽣沉淀。
4、纯化出的抗体效价低的原因。
效价低是因为特异性抗体含量少；有沉淀是因为抗体纯度不够，杂蛋⽩含量⾼，如果是亲和纯化的抗体，那么可能是由于纯化过程中，抗体受到了损伤，抗体的结构和性能有所改变引起的。
抗体纯化注意事项
抗体纯化注意事项抗体纯化是将混合物中的抗体与其他污染物分离的过程。
这是一项常见且重要的技术，在生物医学研究及药物开发领域中得到广泛应用。
下面将重点介绍抗体纯化的注意事项及一些常用的纯化方法。
首先，进行抗体纯化之前需要明确所要纯化的抗体种类，以便选择合适的纯化方法和材料。
例如，要纯化的是IgG类的抗体，可以使用蛋白A或蛋白G纯化柱；要纯化IgM类的抗体，则需要使用蛋白L纯化柱。
其次，注意确保实验室操作的无菌和洁净。
抗体是很容易受到污染的生物分子，因此在纯化过程中，应该使用无菌工具和材料，避免无菌操作环境中的气溶胶污染，同时定期清洗和消毒实验室设备和工作区域。
第三，选择适当的缓冲液和洗脱条件。
缓冲液的选择应根据所使用的纯化方法和目标抗体进行优化，以获取最佳的纯化效果。
同时，洗脱条件的选择需要根据抗体与固相材料的结合强度和特异性来判断，以避免过度洗脱或不完全洗脱的情况发生。
第四，注意进行冷链操作。
抗体是一种易于变性的蛋白质，容易在高温或长时间储存下失活。
因此，在纯化过程中应尽量保持低温操作，例如使用冷藏离心机和冰浴来冷却离心和洗涤液。
第五，合理选择纯化方法。
目前，常用的抗体纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤、超滤等。
在选择纯化方法时，应根据抗体的特性和目标纯化程度来选择合适的方法。
例如，亲和层析法适用于高效纯化特定抗体，而离子交换层析法则适用于纯化抗体混合物。
最后，采取适当的储存条件。
纯化后的抗体应储存在低温、无菌和避光的条件下，以保持其稳定性和活性。
并且，应避免抗体与其他蛋白质、酶、氧化剂等物质接触，以避免降解和污染。
总结起来，抗体纯化是一项复杂而关键的步骤，需要注意无菌洁净操作、选择合适的纯化方法和条件、冷链操作、合理储存等一系列注意事项，以确保纯化效果和抗体的稳定性。
只有严格遵循这些注意事项，才能获得高纯度、高活性的抗体样品，为后续的实验和应用提供有力支持。
抗体制备问答
一、抗原多肽选择的基本原则1、尽可能是在蛋白表面2、保证该段序列不形成α-helix3、N,C端的肽段比中间的肽段更好4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5、避免同源性太强的肽段6、交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。
二、抗原多肽设计的基本原则为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。
尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注意的细节，已超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有几点关键的基本设计原则可以提供给大家参考：1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。
然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。
例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。
这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。
（无法产生相互作用）。
2、识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。
因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。
核酸提取纯化常见问题解答
核酸提取纯化常见问题解答1.AccuPrep®凝胶回收试剂盒常见问题2.AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒常见问题3.AccuPrep®GMO提取试剂盒常见问题4.AccuPrep®PCR纯化试剂盒常见问题5.AccuPrep®质粒提取试剂盒常见问题6.AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒常见问题7.AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒常见问题8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题9.质粒DNA提取操作常见问题AccuPrep®凝胶回收试剂盒↑TOPQ1. 产量低A1. 1）凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。
离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全，DNA被包裹不能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致DNA产量降低。
2）加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗? 过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。
3）错误的洗脱缓冲液会降低产量. 洗脱缓冲也不能包含过多的盐. 缓冲液的pH 应调至7.0-8.5。
4）错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH 在正常范围内。
如果颜色为红色或橘黄色，表示pH已经超出了正常的范围。
这时应该加入几滴醋酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。
5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。
如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸附力，从而导致DNA产量的降低。
Q2．琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。
WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。
如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次。
Q3．提纯后的后续酶反应效率降低A3. 1)样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。
这种情况下，加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱5分钟，然后再离心。
抗体的检测和纯化(4)
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
方法
1 腹水的处理 取腹水,在4 ℃,12 000g 条件下 离心15min ,以除去较大的凝块。 2 装柱 将1. 5g Protein A-Sep harose CL-4B 干 粉用6～7ml 三蒸水溶解,再用0. 02M ,p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然 后装入层析柱中。 3 平衡 用10 倍柱床体积的上样缓冲液过柱, 流速为1ml/ min , p H 试纸测试流出液体的p H 为7. 4 。
ELISA的原理
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
是一种免疫测定试验 。
基础: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记
。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物
，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，组化
2， 操作步骤
• 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体 的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析 所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用 来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% • （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加 到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸 pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液 （ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.。
抗体纯化磁珠
抗体纯化磁珠（Beads Magrose Protein A/G Antibody Purification）规格：20T保存：2-8℃，保质期1年产品内容：Beads Protein A/G抗体纯化磁珠系列产品是由NHS活化的超顺磁性微球与Protein A/G共价结合形成的复合微粒。
该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。
本产品为微米级磁性微球，熟练操作可在15min内完成抗体吸附过程，30min内完成抗体纯化流程。
用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择磁珠的类别，Magrose Protein A，Magrose Protein G磁珠与不同抗体的亲和性比较参见下表。
产品特性：产品名称Magrose Protein A Magrose Protein G磁珠粒径30~150µm30~150µm磁珠浓度10%（v/v）10%（v/v）配基Protein A Protein G介质Magrose Magrose抗体结合能力25~30mg Human IgG/mL Gel25~30mg Human IgG/mL Gel保存温度2~8℃2~8℃Binding/Washing buffer PBST（pH7.2~7.4）:137mM NaCl，2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2.0mM KH2PO4,0.1%Tween-20Elution buffer100mM Gly,0.1%Tween-20,pH2.5Neutrilization buffer 1.0M Tris-HCl,pH9.0Storage buffer PBST（含0.05%NaN3）适用范围：适用于血浆、腹水、组织培养上清液等样品中的抗体纯化，也可用于抗体固定及其它相关研究。
操作步骤(以纯化人血清IgG为例)：1、样品处理：取人血清100µL至 1.5mL EP管中，接着加入900µL Binding/Washing buffer，充分混匀。
亲和层析纯化抗体，如何减少洗脱后中和沉淀的出现？
亲和层析纯化抗体，如何减少洗脱后中和沉淀的出现？随着亲和层析技术的发展，蛋白纯化技术相对简单，蛋白纯化技术的应用也越来越普遍，一步亲和层析即可达到90%以上的纯度。
然而，蛋白纯化的过程中各个环节不容忽视。
样品处理，纯化介质的选择，纯化方法的考虑，等等，虽然纯化方法简单，但是蛋白不同，采用的纯化体系也不尽相同。
只要达到最终的纯化目的就是最好的纯化方法。
对于亲和层析纯化抗体，不论是蛋白A/G还是特异性抗原亲和层析，酸洗脱峰后一般加Tris中和。
因为蛋白长期在酸性条件下易水解。
但有一个问题就是中和容易产生沉淀。
这是为什么？是抗体变性了？如何才能避免这种情况呢？这种沉淀主要是因为洗脱时的酸性条件导致抗体变形，而在中和的时候，pH的剧烈变化更易导致抗体的变性。
沉淀发生的另一个重要原因是宿主蛋白等杂质含量偏高。
这类杂质在中和的时候容易导致溶液浑浊进而引发抗体沉淀。
要减少沉淀的发生应该从几个方面入手：（1）尽量提高洗脱液的pH值。
了解蛋白pH稳定性，包括低pH 的稳定性，以及抗体的溶解度。
如果pH稳定性低，最好使用Mabselect Sure探索高PH洗脱（PH5.0，4.0，3.0），都可以去尝试。
高PH可以洗脱的，尽量不要选择更低的PH。
（2）尽量减少宿主蛋白。
可以在亲和层析之前经过深层过滤，絮凝沉淀，超滤等方法去掉一些宿主蛋白类杂质。
另外优化亲和层析时的中间洗涤步骤，尽量更多的去除宿主蛋白。
当然不同批次的料液，其宿主蛋白的含量有所不同，因此需要加强监控，控制好亲和层析上柱前的料液中HCP的含量。
最好在上样后加wash 洗HCP，PH 6左右加添加剂wash更换）。
另外，也有一些介质本身的HCP的非特异吸附（这种情况在文献中提到， agrose的非特异吸附少）（3）同时可以添加一些尿素等变性剂以提高洗脱液的洗脱能力；也可以添加精氨酸等蛋白稳定剂，以减少蛋白的变形；也可以改善中和条件，中和用的tris溶液的浓度和用量不要太高（常用的是5%体积的1M tris）。
抗体的纯化：盐析法
抗体的纯化：盐析法发布时间：2009-02-18 新闻来源：精制抗体的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1、试剂（1）正常人混合血清；灭菌生理盐水。
（2）饱和硫酸铵溶液的配制称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。
冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调PH至7.4。
配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
（3）萘氏试剂配制称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。
（4）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制：贮存液A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；B液：0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
（5）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
（6）20%磺基水杨酸。
2、器材普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸（PH5.5～9.0）、眼科镊子、小剪刀。
多克隆抗体纯化与保存
多克隆抗体纯化与保存
多克隆抗体的纯化和保存是制备高质量抗体的重要步骤。
以下是一些关于多克隆抗体纯化和保存的常见信息：
1. 纯化方法：多克隆抗体通常通过Protein A 或Protein G 的方法从动物血清中纯化抗体。
但是，对于某些使用场景，需要利用抗原亲和层析从总IgG 抗体中进一步纯化和分离抗原特异性抗体，从而获得纯度高、非特异性背景低的多克隆抗体。
2. 保存条件：多克隆抗体可以保存在50% 的丙三醇中，或保存在饱和硫酸铵中，或保存在-20℃。
对于某些特殊抗体，如酶偶联抗体、荧光抗体等，需要保存在4℃或避光保存。
3. 保存时间：多克隆抗体的保存时间取决于其类型和纯度。
一般来说，保存在50% 的丙三醇中的抗体可以保存数年，而保存在-20℃的抗体可以保存更长时间。
4. 保存前的处理：在保存前，需要对多克隆抗体进行适当的处理，例如去除任何可能的蛋白质杂质，并进行适当的稀释，以确保保存的抗体的稳定性和有效性。
总之，多克隆抗体的纯化和保存是制备高质量抗体的重要步骤。
在进行多克隆抗体制备时，应该根据具体情况选择适当的纯化和保存方法，并严格遵守保存条件，以确保抗体的稳定性和有效性。
抗体的纯化与检测详细版
注意事项：选择 合适的荧光标记 抗体避免非特异 性结合
抗体纯化与检测的应 用
疾病诊断
抗体检测：通过检测抗体水平判断疾病状态 抗体纯化：提高抗体检测的准确性和灵敏度 抗体检测的应用：用于诊断多种疾病如传染病、肿瘤等 抗体纯化的应用：提高抗体检测的特异性和灵敏度降低假阳性和假阴性率
药物研发
抗体纯化与检测在药物研发中的作用：提高药物的疗效和安全性 抗体纯化与检测在药物研发中的具体应用：抗体筛选、抗体工程、抗体药物研发等 抗体纯化与检测在药物研发中的技术难点：抗体的纯化、抗体的检测、抗体的稳定性等 抗体纯化与检测在药物研发中的发展趋势：抗体药物的个性化治疗、抗体药物的靶向治疗等
步骤：样品制备、 电泳分离、转膜、 封闭、抗体孵育、 显色、结果分析
优点：灵敏度高、 特异性强、操作 简便、结果直观
应用：广泛应用 于蛋白质表达分 析、疾病诊断、 药物研发等领域
流式细胞术
原理：利用荧光 标记抗体通过流 式细胞仪检测细 胞表面抗原
优点：快速、灵 敏、准确
应用：免疫学、 肿瘤学、血液学 等领域
根据实验目的选 择检测方法：如 定量检测、定性 检测等
实验数据的分析和解读
数据的完整性：确保实验数 据的完整性避免遗漏和缺失
数据的时效性：确保实验数 据的时效性避免过时和失效
实验数据的准确性：确保实 验数据的准确性避免误差和 偏差
数据的解读：根据实验数据 进行合理的分析和解读得出
结论和结论
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生物科学研究
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 重要性
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 应用实例
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 发展趋势
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 挑战与机遇
抗体制备问答
一、抗原多肽选择的基本原则1、尽可能是在蛋白表面2、保证该段序列不形成α-helix3、N,C端的肽段比中间的肽段更好4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5、避免同源性太强的肽段6、交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。
二、抗原多肽设计的基本原则为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。
尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注意的细节，已超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有几点关键的基本设计原则可以提供给大家参考：1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。
然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。
例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。
这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。
（无法产生相互作用）。
2、识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。
因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。
抗体常见问题解答
抗体常见问题解答常见问题：1. 如何选择合适的一抗？2. 如何选择合适的二抗？3. 如何选择合适的同型对照？4. 如何选择阳性对照？5. 如何确定一抗的稀释比例？6. 如何选择合适的抗原修复方式？7. 为何WB检测条带大小与预期有差别？8. 抗体能够用于其他种属/实验方法？9. 如何确定抗体是否能用于未经验证的种属？10. 抗体能否与该蛋白的其它亚型或同一家族其他蛋白交叉反应?11. 如何保存抗体？12. 如何分装抗体？13. 能否提供抗体的免疫原序列？1、如何选择合适的一抗？请先确定您要检测的种属和使用的实验方法，然后查找相关产品，根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。
如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测，则您可以放心地购买该产品。
如果说明书中没有注明您用的种属和实验方法经过验证，那么请参考第8、9、10条。
Abcam网站所有说明书都是根据验证情况（Abcam实验室以及客户）实时更新的，所以可以放心参考！2、如何选择合适的二抗?二抗的选择原则：针对一抗来源的二抗（比如一抗是小鼠来源的，二抗就要是抗小鼠的）针对一抗Ig亚型的（比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗体）为了增加特异性、降低背景：可以选择Fab段的抗体（去除Fc段的）、经过标本来源种属血清吸附的的二抗查看二抗的说明书，选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗Abcam提供各种种属、各种类型和标记的二抗，完全满足您实验的需要：可以通过一抗说明书页面的“Related Products”来选择合适的二抗通过产品分类目录选择合适的二抗3、如何选择同型对照？同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。
同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。
例如：一抗是FITC标记，其抗体分型是小鼠的IgG1，则同型对照要选择是FITC 标记的小鼠的IgG1。
Abcam提供各种种属和Ig分型的同型对照产品，可以在Abcam和51AB的网站，产品分类“Isotype”/“同型对照”中查找和选择合适的产品多抗的同型对照：绝大部分的同型对照产品都是单克隆抗体，因此不适用于作为多克隆抗体的对照（因为多抗含有多种IgG的亚型）。
抗体纯化的原理和步骤
抗体纯化的原理和步骤抗体纯化，听起来是不是像一门高深的学问？其实，它就是把那些超级英雄般的抗体从一堆“杂质”中找出来的过程。
咱们的免疫系统就像一支警察队，抗体就是那些最勇敢、最聪明的警察，它们专门对付入侵的坏家伙——病毒、细菌等等。
不过，想把这些抗体从复杂的生物样品中提取出来，得有一套“秘籍”！今天，就来跟大家聊聊抗体纯化的原理和步骤，保证让你听得津津有味。
1. 抗体的基本知识1.1 抗体是什么首先，咱们得知道抗体是什么。
这玩意儿其实是由B细胞生产的蛋白质，负责识别和中和外来的侵略者。
可以想象成是专门为打击“罪犯”而生的特工，它们不仅能认得出坏家伙，还能给它们上“刑”。
每种抗体对特定的“罪犯”都有极强的专一性，这让它们在免疫反应中发挥着至关重要的作用。
1.2 抗体的种类抗体可分为多种类型，比如IgG、IgA、IgM等等。
每种都有它独特的功能，就像每位英雄都有自己的超能力。
IgG是最常见的，负责大多数的免疫防御，IgA则主要在黏膜表面发挥作用，像是个“门卫”。
要纯化抗体，了解这些小伙伴的特性可真是必不可少。
2. 抗体纯化的原理2.1 为什么需要纯化好吧，明白抗体是什么后，咱们接下来得搞清楚，为什么要纯化抗体。
想象一下，假如你去参加聚会，周围全是陌生人，你得找到自己的朋友才能安心聊天。
抗体纯化就是这样的过程——把那些“杂质”都清理掉，只留下那些“志同道合”的抗体。
纯化后的抗体才能够更有效地用于科研、治疗等各种用途。
2.2 纯化的方法抗体纯化的方法有不少，比如亲和层析、盐析、透析等等。
亲和层析可以说是个“万里挑一”的高手，它利用抗体和抗原之间的特异性结合，像钓鱼一样，把目标抗体捞出来。
盐析则是利用盐的溶解度差异，让抗体聚集在一起，轻松搞定一部分杂质。
而透析就像是洗衣机，把不需要的“小毛病”洗掉，留下干净的抗体。
3. 抗体纯化的步骤3.1 实验步骤详解接下来，咱们就聊聊具体的步骤吧。
首先，得准备好样品，通常是血清或细胞培养液。
单克隆抗体制备常见问题分析
单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。
我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,0.5ml ip (腹腔内注射)? 2,3周后第二次免疫1×10,,0.5ml ip? 3周后加强免疫(融合前三天) 1×10,,0.5ml ip或iv(静脉内注射)?取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫Ag 1,50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射? (一般0.8,1ml 0.2ml,点)?3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip? (ip剂量不宜超过0.5ml)?3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip? (5,7天后采血测其效价，检测免疫效果)?2,3周后加强免疫，剂量50,500μg为宜，ip或iv?3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如?将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
R&D常见问题之抗体部分
R&D常见问题之抗体部分
问：目录中抗体的名称有AB, AF, BAF, MAB之分，它们有何不同？
答：带有AB的抗体是用G蛋白纯化的，带有IgG成分；带有AF的抗体经G蛋白纯化后又经抗原亲和层析纯化。
所以，AF抗体为抗原特异性的IgG，而AB抗体含有与目标分析物非特异性的IgG。
BAF是生物素化的AF抗体；MAB是单克隆抗体。
问：IgG的分子量是多少？
答：IgG的分子量是150kDa。
它由两条50kDa的重链和两条25kDa的轻链组成。
问：某一单克隆抗体所识别的抗原表位是什么？
答：R&amD Systems不做抗原表位的定位。
抗体是针对整个免疫原（列在数据表中）的。
问：某一多克隆抗体所识别的抗原表位是什么？
答：多克隆抗体有多个抗原表位识别位点。
抗体是针对整个免疫原（列在数据表中）的。
问：什么是Thehalose？它为什么在这个抗体上？
答：Thehalose是一种非还原糖（分子量为342.1）, 它在梅拉德式（Maillard）反应中与氨基酸和蛋白都不作用。
它存在于许多植物和动物中。
有报道称Thehalose是稳定蛋白抗御冰冻的最有效抗冻剂，它使得蛋白抵御水分的能力增加从而使产品在重新溶解时不容易产生沉淀物。
问：采用Trehalose稳定蛋白的原因是什么？
答：Trehalose主要用于在冰冻和脱水过程中保护蛋白。
它是非还原糖，在干粉化时呈非结晶状。
纯化抗体得不到轻链的原因
纯化抗体得不到轻链的原因纯化抗体是一项重要的实验技术，可以用于研究和治疗许多疾病。
然而，有时在纯化抗体的过程中，我们无法得到轻链，这可能是由于多种原因导致的。
轻链在纯化抗体的过程中可能被损坏或丢失。
纯化抗体的过程通常包括多个步骤，如细胞培养、细胞破碎、蛋白质结合、洗涤和洗脱等。
这些步骤中的任何一个环节出现问题，都有可能导致轻链的损坏或丢失。
例如，在细胞破碎的过程中，轻链可能受到剪切或降解，从而无法得到纯化。
此外，在蛋白质结合和洗涤的过程中，如果没有选择合适的条件，也可能导致轻链的丢失。
轻链可能与重链结合过紧，难以分离。
抗体由两条重链和两条轻链组成，它们通过非共价键相互结合。
在纯化抗体的过程中，我们通常会使用分离剂或条件来破坏这些非共价键，以便将抗体分离出来。
然而，如果这些条件选择不当或处理不当，就可能导致轻链和重链结合过紧，难以分离。
例如，如果使用的分离剂浓度过高或处理时间过长，就可能导致轻链和重链的结合不完全，从而无法得到纯化的轻链。
还有一些其他因素可能导致无法得到纯化的轻链。
例如，在抗体的表达和分泌过程中，可能存在一些变异或错误折叠的情况，导致轻链无法正确组装或分泌到培养基中。
为了解决这个问题，我们可以采取一些策略。
首先，我们可以优化纯化抗体的步骤和条件，确保轻链能够得到充分的保护和分离。
例如，可以尝试调整细胞破碎的条件、蛋白质结合和洗涤的条件，以及分离剂的浓度和处理时间等。
其次，我们可以使用新的分离技术或材料，以提高纯化抗体的效率和选择性。
例如，可以尝试使用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法，或者尝试使用新型的纯化介质，如亲和树脂、离子交换树脂等。
纯化抗体时无法得到轻链的原因可能有多种，包括轻链的损坏或丢失、轻链与重链结合过紧、抗体表达和分泌的问题，以及其它蛋白质或杂质的竞争结合等。
为了解决这个问题，我们可以优化纯化步骤和条件，采用新的分离技术和材料，以提高纯化抗体的效率和选择性。
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用
户园地Q & A
30
鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相
互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析
即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体
纯化提供很好的解决方案。
然而要得到高质量高纯度的抗
体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法
上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。
1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品，
有哪些样品处理的方法？
在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高
纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿
命。
对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂
蛋白，酚红，小分子污染物等等。
腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂
类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。
方法一是
在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋
白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值
依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球
蛋白。
很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释
腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。
酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然
并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质
上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。
对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如
硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。
最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到
合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分
子。
更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。
2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG
还是ProteinA？
首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强
度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的
IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介
质。
但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0
才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。
此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料，结合缓冲
液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体
在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。
若实验室有AKTA系统，那么Hitrap ProteinG HP是高分
辨率方便快捷的首选。
若没有AKTA系统，MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你
带来最大的快捷和便利，试剂盒含有一个Hitrap ProteinG
HP1ml的预装柱，结合，洗脱和中和的缓冲液，一个具有
接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。
Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心
柱，和标准的小离心机一起使用，仅用20分钟就可以完成
一次小规模的抗体纯化。
ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。
3，面对ProteinA如此多的配基形式，它们有何区别
和应用？
蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株
系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结
构域，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他
杂蛋白流穿，具有极高的选择性，通常一步亲和层析就可
达到超过95%的纯度。
ProteinA sepharoseCL-4B，是将从金黄色葡萄球菌表
达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的
介质上，可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。
nproteinA sepharose4FF，nprteinA即为天然 (Native Protein
A)，表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。
rproteinA sepharose4FF，重组的蛋白A (rProtein A)，
经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位
点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了
与IgG 的结合能力。
同时配基在发酵和纯化过程中没有引
用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。
rmpProteinA，多位点附着的技术，保证更低的配体
的脱落。
一步高度纯化单抗和多抗。
2005年我们推出了新一代的MabSelect ，是第一个使
用高流速琼脂糖凝胶 ( High flow Agarose) 作为骨架的新型
蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计。
相比传统
抗体纯化常见问题回答
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用户园地Q &A
Fast Flow 填料，高流速琼脂糖具有高流速高载量，更低的配体脱落，易于清洗与除菌消毒，寿命更长、更经济，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为治疗用单抗纯化和放大的标准介质。
4，为什么洗脱之后没有看到正确的条带？
首先我们先看样品是否结合了？先查不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（图1），看有没有亲和性，柱子选得对不对。
然后检查结合缓冲液和样品的pH 是否7.3附近。
必要时将原始样品和流穿跑还原和非还原SDS-PAGE 进行分析，有条件可以做Western Blot ，或检测Elisa 是结合上去没有洗脱?
检查洗脱缓冲液pH 对否？建议依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，跑电泳或ELisa 等检测洗脱产物
洗脱峰是否立即中和？蛋白长期在酸性条件下易水解，中和后也容易产生沉淀
跑电泳的loading buffer 是否新鲜配置？（常遇到还原loading buffer 中DTT 失效，导致电泳条带位置不对）
5， ProteinA 和ProteinG 填料如何清洗再生？
对于Sepharose 基架的ProteinA 和ProteinG 填料的清洗方法可以参考（预装柱同样适用此清洗方法）：
对于沉淀或变性的蛋白：
用6M 盐酸胍清洗2个柱体积，立即用5个柱体积的PH7-8结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超过10min 。
对于去除疏水性的物质：
70%乙醇浸泡12小时左右，然后立即用5个柱体积的PH7-8结合缓冲液来清洗，反向冲洗。
对于新一代的Mabselect SuRe 的介质，通过改造对碱敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸得到新的四聚体配基SuRe 配基，将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上，成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质，可以耐受0.1~0.5N 的氢氧化钠在位清洗/消毒大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。
6，抗体药物纯化过程中，如何降低聚集体含量？
在上游细胞培养，控制最佳的收获时机(TOH)，避免培养过程中抗体聚集；
相比其他蛋白A 填料，Mab select SuRe 可以用更温和的洗脱条件，即提高洗脱pH 0.5-1个单位；
亲和低pH 洗脱液中加入保护剂 (Arg 等)；亲和低pH 洗脱后，快速中和；适当降低亲和层析进样量；
样品处理和纯化过程中，尽量保持较低的温度 (4-8C)使用Superdex200, 离子交换层析, 疏水层析, Capto adhere 等层析技术去除聚集体。
（详细的方法请参考《抗体纯化手册》）
7，含FCS 培养表达的human IgG 的纯化中，如何避免牛IgG 干扰？
选用专为纯化human IgG 而开发的新型Igselect 填料, 可以特异的识别结合human 的IgG ，而不结合其它种属来
源的IgG 。
也可以考虑先用传统的Protein A 或G 纯化，再使用疏水层析HIC 来去除牛IgG 。
使用IgG 含量较低的血清，也有助于后期的分离纯化。
8，我需要纯化抗体的Fab 片段，有什么办法吗？
KappaSelect 是专为纯化 Fab （kappa ）片断而设计的亲和 介质，能有效地捕获 Fab ，获得高纯度和高产量的 Fab 。
KappaSelect 是通用电气医疗集团客户定制设计填料项目之一，其以高度刚性的琼脂糖基质为基础，能在大规模生产中承受高流速和低反压。
它是一种亲和填料，配体能与 Kappa 轻链的恒定区结合（也就是说，缺乏 Kappa 轻链恒定区的片断不会与之结合）。
因此，KappaSelect 能够结合其它包含 Kappa 轻链恒定区的目标分子，如 IgA 和 IgM 。
配体通过长的亲水空间臂与基质相连，使之易于结合目标分子（图2）。
另外Protein G 在某些情况下可以和Fab 有结合作用，因此可以用于Fab, F(ab')2的纯化。
注意：kappaselect 只能结合human 抗体的k 轻链。
通用电气 (中国) 医疗集团。