抗体纯化常见问题回答

用

户园地Q & A

30

鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相

互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析

即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体

纯化提供很好的解决方案。然而要得到高质量高纯度的抗

体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法

上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。

1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品，

有哪些样品处理的方法？

在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高

纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿

命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂

蛋白，酚红，小分子污染物等等。

腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂

类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是

在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋

白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值

依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球

蛋白。很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释

腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。

酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然

并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质

上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。

对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如

硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。

最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到

合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分

子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。

2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG

还是ProteinA？

首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强

度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的

IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介

质。但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0

才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。

此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料，结合缓冲

液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体

在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。

若实验室有AKTA系统，那么Hitrap ProteinG HP是高分

辨率方便快捷的首选。

若没有AKTA系统，MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你

带来最大的快捷和便利，试剂盒含有一个Hitrap ProteinG

HP1ml的预装柱，结合，洗脱和中和的缓冲液，一个具有

接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。

Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心

柱，和标准的小离心机一起使用，仅用20分钟就可以完成

一次小规模的抗体纯化。

ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。

3，面对ProteinA如此多的配基形式，它们有何区别

和应用？

蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株

系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结

构域，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他

杂蛋白流穿，具有极高的选择性，通常一步亲和层析就可

达到超过95%的纯度。

ProteinA sepharoseCL-4B，是将从金黄色葡萄球菌表

达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的

介质上，可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。

nproteinA sepharose4FF，nprteinA即为天然 (Native Protein

A)，表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。

rproteinA sepharose4FF，重组的蛋白A (rProtein A)，

经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位

点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了

与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引

用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。

rmpProteinA，多位点附着的技术，保证更低的配体

的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。

2005年我们推出了新一代的MabSelect ，是第一个使

用高流速琼脂糖凝胶 ( High flow Agarose) 作为骨架的新型

蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计。相比传统

抗体纯化常见问题回答

31

用户园地Q &A

Fast Flow 填料，高流速琼脂糖具有高流速高载量，更低的配体脱落，易于清洗与除菌消毒，寿命更长、更经济，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为治疗用单抗纯化和放大的标准介质。

4，为什么洗脱之后没有看到正确的条带？

首先我们先看样品是否结合了？先查不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（图1），看有没有亲和性，柱子选得对不对。然后检查结合缓冲液和样品的pH 是否7.3附近。必要时将原始样品和流穿跑还原和非还原SDS-PAGE 进行分析，有条件可以做Western Blot ，或检测Elisa 是结合上去没有洗脱?

检查洗脱缓冲液pH 对否？建议依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，跑电泳或ELisa 等检测洗脱产物

洗脱峰是否立即中和？蛋白长期在酸性条件下易水解，中和后也容易产生沉淀

跑电泳的loading buffer 是否新鲜配置？（常遇到还原loading buffer 中DTT 失效，导致电泳条带位置不对）

5， ProteinA 和ProteinG 填料如何清洗再生？

对于Sepharose 基架的ProteinA 和ProteinG 填料的清洗方法可以参考（预装柱同样适用此清洗方法）：

对于沉淀或变性的蛋白：

用6M 盐酸胍清洗2个柱体积，立即用5个柱体积的PH7-8结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超过10min 。

对于去除疏水性的物质：

70%乙醇浸泡12小时左右，然后立即用5个柱体积的PH7-8结合缓冲液来清洗，反向冲洗。

对于新一代的Mabselect SuRe 的介质，通过改造对碱敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸得到新的四聚体配基SuRe 配基，将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上，成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质，可以耐受0.1~0.5N 的氢氧化钠在位清洗/消毒大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。

6，抗体药物纯化过程中，如何降低聚集体含量？

在上游细胞培养，控制最佳的收获时机(TOH)，避免培养过程中抗体聚集；

相比其他蛋白A 填料，Mab select SuRe 可以用更温和的洗脱条件，即提高洗脱pH 0.5-1个单位；

亲和低pH 洗脱液中加入保护剂 (Arg 等)；亲和低pH 洗脱后，快速中和；适当降低亲和层析进样量；

样品处理和纯化过程中，尽量保持较低的温度 (4-8C)使用Superdex200, 离子交换层析, 疏水层析, Capto adhere 等层析技术去除聚集体。（详细的方法请参考《抗体纯化手册》）

7，含FCS 培养表达的human IgG 的纯化中，如何避免牛IgG 干扰？

选用专为纯化human IgG 而开发的新型Igselect 填料, 可以特异的识别结合human 的IgG ，而不结合其它种属来

源的IgG 。

也可以考虑先用传统的Protein A 或G 纯化，再使用疏水层析HIC 来去除牛IgG 。

使用IgG 含量较低的血清，也有助于后期的分离纯化。

8，我需要纯化抗体的Fab 片段，有什么办法吗？

KappaSelect 是专为纯化 Fab （kappa ）片断而设计的亲和 介质，能有效地捕获 Fab ，获得高纯度和高产量的 Fab 。 KappaSelect 是通用电气医疗集团客户定制设计填料项目之一，其以高度刚性的琼脂糖基质为基础，能在大规模生产中承受高流速和低反压。它是一种亲和填料，配体能与 Kappa 轻链的恒定区结合（也就是说，缺乏 Kappa 轻链恒定区的片断不会与之结合）。因此，KappaSelect 能够结合其它包含 Kappa 轻链恒定区的目标分子，如 IgA 和 IgM 。配体通过长的亲水空间臂与基质相连，使之易于结合目标分子（图2）。另外Protein G 在某些情况下可以和Fab 有结合作用，因此可以用于Fab, F(ab')2的纯化。

注意：kappaselect 只能结合human 抗体的k 轻链

。