纸片扩散法测大肠杆菌对几种抗生素的敏感性(清晰整齐)

纸片扩散法测大肠杆菌对几种抗生素的敏感性

1 实验原理

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC 愈小，抑菌圈直径愈大。

2 实验材料

2.1 菌液

江山大农庄拉稀的猪仔肠道黏膜物中提取的大肠杆菌。

2.2药品

链霉素、四环素、多粘菌素B、万古霉素、庆大霉素、红霉素、氨苄青霉素、新霉素、利福平、青霉素、菌必治、羧苄青霉素。

3 实验步骤

3.1药敏纸片的准备

纸片内抗菌药物含量

抗生素纸片浓度

U/μg/片

抗生素

纸片浓度

U/μg /片

抗生素

纸片浓度

U/μg /片

氨苄青霉素10μg 链霉素10μg 万古霉素30μg 羧苄青霉素100μg 新霉素30μg 多粘菌素B 300U

头孢菌素类30μg 庆大霉素10μg 四环素类30μg

菌必治30μg 利福平5μg 红霉素15μg

3.2细菌的制备

从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。

3.3 接种平板

制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。

3.4 粘贴药敏试纸

待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。纸片间距离不小于24mm，纸片中心距平皿边缘不小于15mm。直径为90mm的平板最好贴6张。贴好纸片后，需在15min内置35℃培养箱内培养。培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用，平板培养18～24h后，读取结果。

4 结果判定

培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，磺胺类药的抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。

抑菌圈直径（mm）敏感度

20mm及以上极敏

15～20mm 高敏

10～14mm 中敏

10mm以下低敏

0mm 不敏

5 实验结果

如图

大肠杆菌对12种药物的敏感性

抑菌药物抑菌圈直径（mm）敏感度

链霉素12.56 中敏

多黏菌素B 9.61 低敏

庆大霉素14.57 中敏

羧苄青霉素24.51 高敏菌必治10.51 中敏

新霉素0 无敏

红霉素0 无敏

四环素0 无敏

利福平0 无敏

青霉素0 无敏

氨苄青霉素0 无敏

万古霉素0 无敏

大肠杆菌对12种抗菌药物的敏感性如上表所示。从表中可以看出，大肠杆菌对多粘菌素、链霉素，庆大霉素三种抗菌药物抗菌药物敏感性是有所下降。对羧苄青霉素还是有极高的敏感性。

由此可见，实验中所采用的大肠杆菌还未产生明显的耐药性。该株大肠杆菌对多粘菌素、菌必治、链霉素和庆大霉素的敏感性有轻微的降低，说明有耐药性的产生。所以应注重平时抗生素的合理使用。